发明内容
本发明的目的是提供一种产业化制备BCG-CpG-DNA的方法,采用两步纯化的方法,从BCG的菌体裂解液中纯化DNA(BCG-CpG-DNA),杂质蛋白含量明显降低,该方法尤其适合产业化制备高纯度大分子量的BCG-CpG-DNA片段。
本发明的技术方案为:
一种产业化制备BCG-CpG-DNA的方法,包括菌体培养、菌体裂解、裂解液澄清、裂解液纯化和浓缩、浓缩液除菌分装,所述裂解液纯化是指利用Q Sepharose HP离子交换柱依次在TE缓冲体系、磷酸钠缓冲体系中将卡介菌菌体裂解液中卡介菌CpG-DNA分离出来;所述浓缩指将经磷酸钠缓冲体系纯化所得的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩后再进行缓冲液置换。
进一步方案,所述离子交换柱在TE缓冲体系中进行分离时,先将卡介菌菌体裂解液加入第一上样缓冲液中;卡介菌裂解液上样后,再使用第一洗脱缓冲液进行梯度洗脱;所述第一上样缓冲液为0~0.5M NaCl+50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)+1mM EDTA(乙二胺四乙酸),pH为7.5~8.5;所述第一洗脱缓冲液为1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA,pH7.5~8.5。
更进一步,所述梯度洗脱是指先用质量分数为30%~50%的第一洗脱缓冲液进行洗脱,然后用质量分数为50%~100%的第一洗脱缓冲液继续洗脱。
优选,所述第一上样缓冲液为0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5;第一洗脱缓冲液为1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5。
优选,所述梯度洗脱是指先用质量分数为40%~45%的第一洗脱缓冲液进行洗脱,然后用质量分数为100%的第一洗脱缓冲液继续洗脱。
进一步,所述离子交换柱在磷酸钠缓冲体系中进行分离时,先将注射用水加入经TE缓冲体系纯化后的洗脱液中,使其中的NaCl离子浓度达到0~0.5M;然后将其加入经第二上样缓冲液平衡后的Q Sepharose HP离子交换柱进行上样,上样后,使用第二洗脱缓冲液进行梯度洗脱;所述第二上样缓冲液为0~0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5~8.5;所述第二洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5~8.5。
进一步,所述第二上样缓冲液为0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5;所述第二洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5;所述梯度洗脱是指使用质量分数为60-100%的第二洗脱缓冲液进行洗脱。
进一步,所述裂解液澄清是指经高速冷冻离心机在4℃条件下以8000~12000rpm/min离心10~20min,将其上清液收集并用去离子蒸馏水或离子交换分离用的洗脱缓冲液对其进行稀释1倍,最后用0.45~1μm的过滤器进行过滤。
进一步,所述中空纤维柱将洗脱液浓缩至原体积的1/10~1/20,所述的缓冲液置换是指将置换缓冲液不间断的加入浓缩后的洗脱液中进行超滤处理;所述置换缓冲液为10mM磷酸盐缓冲液+质量分数为0.85~0.9%氯化钠,pH6.8~7.4。
本发明在获得卡介菌菌体裂解液之后,利用Q Sepharose HP离子交换柱从卡介菌裂解液中分离卡介菌CpG-DNA,其先在TE缓冲体系中进行,然后再在磷酸钠缓冲体系中进行,且此两种缓冲液的使用顺序不能改变,即:
第一步纯化,在TE缓冲体系中进行分离,卡介菌CpG-DNA裂解液样品可采用如下的上样缓冲液:0~0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5~8.5,优选上样缓冲液为0.5MNaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5;如下的洗脱缓冲液:1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTApH7.5~8.5,优选洗脱缓冲液为1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA pH7.5。上样后的洗脱采用梯度洗脱,梯度洗脱的方法为30%~50%所述洗脱缓冲液洗脱,继续50%~100%所述洗脱缓冲液洗脱,根据样品洗脱峰后,电导和紫外检测稳定后停止洗脱;优选40%~45%所述洗脱缓冲液洗脱,继续100%所述洗脱缓冲液洗脱;更优选45%所述洗脱缓冲液洗脱,继续100%所述洗脱缓冲液洗脱。
第二步纯化,在磷酸钠缓冲体系中进行置换,将注射用水加入第一步纯化洗脱液,调整上样样品中的离子浓度,使其达到含有0~0.5M NaCl的效果。采用如下的上样缓冲液:0~0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5~8.5,优选上样缓冲液为0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5;如下的洗脱缓冲液:1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5~8.5,优选洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液,pH7.5。上样后的洗脱采用特定浓度洗脱,洗脱的方法为用50%~100%所述洗脱缓冲液洗脱,根据样品洗脱峰后,电导和紫外检测稳定后停止洗脱;优选60%所述洗脱缓冲液洗脱。
破碎卡介菌菌体以获得菌体裂解液时所用的液体体系和稀释卡介菌裂解液时所用的液体体系,可以是注射用水,也可以是TE缓冲液,为了方便之后的分离纯化操作,优选使用的液体体系是分离纯化操作时所用的上样缓冲液或洗脱缓冲液。
为了进一步得到更好的分离纯化效果,在分离纯化时,上样的卡介菌CpG-DNA裂解液样品中可以含有0~0.5M NaCl,优选含有0.5M NaCl,为了使经TE缓冲体系纯化后的洗脱液中,NaCl离子浓度达到0~0.5M,可以在菌体破碎裂解和稀释卡介菌菌体裂解液时使用相应的上样缓冲液。如果在菌体破碎裂解和稀释卡介菌菌体裂解液时使用的是注射用水,则可以在上样时采用相应的洗脱液稀释上样样品,以达到上样CpG-DNA裂解液样品中含有0~0.5M NaCl的效果。
将经磷酸钠缓冲体系纯化的洗脱液经中空纤维柱进行浓缩与缓冲液置换,从而控制最终所获得样品的浓度、缓冲液离子浓度与pH。
本发明使用中空纤维系统进行超滤浓缩和缓冲液置换,中空纤维系统的工作原理为:随着物料流被输送过纤维柱膜表面,大分子量溶质物质被膜孔截留并通过循环流路回流,溶剂与小分子溶质物质则穿过膜孔,在纤维管的外侧和滤柱的外壳内侧被收集,从而达到浓缩样品和置换缓冲液的目的。使用本系统能够更好的控制BCG-CpG-DNA原液的缓冲液体系,还能够截留大片段核酸片段,达到浓缩BCG-CpG-DNA样品的目的;同时,中空纤维系统以垂直切向流模式运行,在浓缩和置换过程中也能降低对CpG-DNA的剪切力,使浓缩和置换前后CpG-DNA分子量片段大小基本保持一致。
分别用原有技术(201310586057.X)与本发明技术对卡介菌裂解液进行纯化,纯化结果为:原有技术中TE缓冲体系纯化的样品杂蛋白浓度为46.84μg/ml,原有技术中磷酸钠缓冲体系纯化的样品杂蛋白浓度为16.1μg/ml,本发明纯化体系纯化的样品杂蛋白浓度为6.4μg/ml。蛋白含量测定结果表明,与原有技术单一使用TE缓冲体系或磷酸钠缓冲体系相比,使用本发明的两步法纯化体系所获得的卡介菌CpG-DNA原液杂蛋白含量明显更低,原液的纯度更高。
本发明的两步法纯化体系所获得的卡介菌CpG-DNA原液杂蛋白含量明显更低,其所占比例不超过1%,原液的纯度更高。且使用中空纤维系统进行超滤浓缩和缓冲液置换,达到浓缩BCG-CpG-DNA样品的目的。
具体实施方式
以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在,以帮助阅读者更好地理解本发明的精神和实质,但不构成对本发明实施范围的限定。
一、BCG-CpG-DNA的制备
步骤一、菌体培养:
将卡介菌菌种接种于马铃薯苏通培养基,37℃培养15天后转种于改良的液体苏通培养基,37℃下培养14~20天;
其中,马铃薯苏通培养基的制备方法为:取洗净新鲜土豆(1个),用穿刺器穿成圆柱,再用刀切成4公分长斜面;再用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时;然后用纯化水冲洗土豆斜面块、用苏通培养基冲洗斜面块;取苏通培养基20ml,加入100ml灭菌大管中;最后将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中,115℃30分钟灭菌。
改良的液体苏通培养基配方及制备;
天冬素(AR):4g
柠檬酸(AR):2g
K2HPO4·3H2O(AR):0.5g
MgSO4·7H2O(AR):0.5g
柠檬酸铁按(CP):0.05g
甘油(药用级):60ml
蒸馏水:940ml
先以NH3·H2O调节pH7.2~7.4之间,然后加1%(W/V)硫酸锌1m1,115℃30分钟灭菌。
步骤二、菌体收集:
待菌体生长至对数期时,对培养瓶逐瓶检查后,收集菌膜,加入适量去离子蒸馏水洗涤,压干后称重。
步骤三、菌体裂解:
将收集的菌体以去离子蒸馏水或BCG-CpG-DNA离子交换分离用的上样缓冲液按1g/ml混匀,以组织捣碎匀浆机破碎样品,获得菌体裂解液。
步骤四、裂解液澄清:
将破碎的菌体裂解液在高速冷冻离心机4℃、8000~12000rpm/min、10~20min条件下离心,收集上清,以去离子蒸馏水或BCG-CpG-DNA离子交换分离用的上样缓冲液稀释1倍。上柱前可以再经0.45~1μm的滤器过滤。
步骤五、澄清裂解液纯化与缓冲液置换:
A、离子交换层析中洗脱条件的选择
1、样品的线性洗脱
Q Sepharose HP,填料体积160ml,色谱柱:XK26/40(GE产品)
上样量:88.5ml
上样缓冲液:0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
洗脱缓冲液:1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
线性洗脱:0~100%
纯化图谱见图1A,可见洗脱缓冲液能将各洗脱峰有效的分开;图1A中共有4个较明显的峰,依次为峰1、峰2、峰3、峰4,其中,峰1为流穿峰,峰2的洗脱液浓度为18%~22%,峰3的洗脱液浓度为37%~47%,峰4的洗脱液浓度为45%~69%。
将各收集峰进行电泳分析,电泳图谱见图1B,结果表明:峰1(泳道1)几乎观察不到核酸条带;峰2(泳道2)也无明显核酸条带;峰3(泳道3)在较靠下部位有较小浅条带,为片段较小核酸;峰4(泳道4)有较清晰条带,为目标峰。
2、样品的梯度洗脱
Q Sepharose HP,填料体积160ml,色谱柱:XK26/40(GE产品)
上样量:102ml
第一上样缓冲液:0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
第一洗脱缓冲液:1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
梯度:45%,100%(质量分数)
洗脱液其纯化图谱见图2A,各收集峰电泳图谱见图2B,由图2A和图2B可见:用45%第一洗脱缓冲液洗脱时,大部分杂质和小片段DNA被洗脱下来;当第一洗脱缓冲液的浓度升为100%时,其目标峰被洗脱下来。
B、TE缓冲体系放大实验
Q Sepharose HP,填料4000m1,色谱柱:BPG200/500
第一上样缓冲液:0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
第一洗脱缓冲液:1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
梯度:30%,40%,100%(质量分数)
纯化图谱与电泳结果见图3A、图3B。由图3A和图3B可以看出:流穿峰(泳道1)基本无核酸条带、30%和40%的洗脱峰(泳道2、3)可以去除杂质和小片段DNA,100%洗脱峰(泳道4)为目标峰。
C、磷酸钠缓冲体系放大实验
Q Sepharose HP,填料4000m1,色谱柱:BPG200/500
第二上样缓冲液:50mM磷酸钠缓冲液,0.5M氯化钠,pH7.5
第二洗脱缓冲液:50mM磷酸钠缓冲液,1M氯化钠,pH7.5
梯度:30%,40%,100%(质量分数)
纯化图谱与电泳结果见图4A,图4B。由图4A和图4B可以看出:流穿峰基本无核酸条带(泳道4)、30%和40%的洗脱峰(泳道3、2)可以去除杂质和小片段DNA,100%洗脱峰(泳道4)为目标峰。
D、两步法纯化体系放大实验
(一)、TE缓冲体系离子交换层析
Q Sepharose HP,填料4000m1,色谱柱:BPG200/500
第一上样缓冲液:0.5M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
第一洗脱缓冲液:1M NaCl+50mM Tris+lmM EDTA,pH7.5
梯度:45%,100%(质量分数)
分别进行了三次纯化过程,纯化图谱见图5A、5B、5C电泳图谱见图5D,由三次实验结果得知,体系放大后所获得的核酸样品与小试结果一致。
(二)、磷酸钠缓冲体系离子置换层析
上样的样品:上述(一)中100%洗脱液体
第二上样缓冲液:50mM磷酸钠缓冲液,0.5M氯化钠,pH7.5
第二洗脱缓冲液:50mM磷酸钠缓冲液,1M氯化钠,pH7.5
梯度:60%(质量分数)
分别进行了三次纯化过程,纯化图谱见图6A、6B、6C,电泳图谱见图5D,由三次实验结果得知,采用60%第二洗脱缓冲液洗脱所得为唯一核酸峰。
表1三种不同的纯化方式经浓缩过滤分装后所得样品的蛋白含量
从表1看出,使用TE缓冲体系纯化的样品杂蛋白浓度为46.84μg/ml,使用磷酸钠缓冲体系纯化的样品杂蛋白浓度为16.1μg/ml,而本发明同时采用TE缓冲体系和磷酸钠缓冲体系纯化的样品杂蛋白浓度为6.4μg/ml。所以蛋白含量测定结果表明,与单一使用TE缓冲体系或磷酸钠缓冲体系相比,本发明使用两步法纯化体系所获得的原液杂蛋白含量明显更低,同时原液的纯度更高。
步骤六、纯化液浓缩与缓冲液置换:
原料:60%离子交换置换缓冲液洗脱的样品
仪器:中空纤维柱
浓缩置换缓冲液:10mM磷酸盐缓冲液,0.85%氯化钠pH7.1
浓缩步骤:先通过中空纤维系统浓缩样品,将样品体积浓缩为原来体积的1/10-1/20,称作A液。再将浓缩置换缓冲液不断加入A液中,用于置换60%离子交换置换缓冲液,加入的浓缩置换缓冲液总体积为A液体积的10-20倍,同时继续浓缩至特定浓度。
结果与分析:电泳图谱见图7,泳道1为100%TE洗脱峰、泳道2为60%磷酸钠洗脱峰、泳道3为浓缩液,泳道4为除菌分装液。从图中可以看出,经过浓缩后,样品分子量片段范围与浓缩前的洗脱峰基本一致。
表2浓缩前后样品浓度和pH值
检测指标 |
浓缩前 |
浓缩后 |
DNA浓度(μg/ml) |
121.5 |
1571.1 |
pH值 |
7.49 |
7.12 |
从上表2结果可以看出,经过中空纤维系统浓缩和置换的过程,浓缩前后的样品分子量片段大小基本一致,样品的DNA浓度得到提升,同时缓冲液中的pH发生改变。这表明,通过该浓缩和置换工艺,可以调节样品的浓度、pH值,而不改变样品的分子量片段大小,这为样品的后续研究提供了保障。
步骤七、浓缩液除菌分装:
将步骤六处理好的样品通过无菌的0.2μm滤膜进行过滤除菌,再调整样品浓度,进行分装保存。
二、药效学研究
通过上述工艺制备的BCG-CpG-DNA佐剂,经动物实验,对含该佐剂的狂犬病疫苗进行了药效学研究。
1.实验材料
BCG-CpG-DNA佐剂:1.0mg/ml
冻干人用狂犬病疫苗、狂犬病疫苗国家标准品(效力检定用)
实验动物:昆明系小鼠(SPF),12-14g
2.实验方法
参照中国药典2015版三部人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)的相关内容进行。
1)小鼠分组
按照下表中的方式进行实验分组:
表3动物实验分组
2)给药方法:将各稀释度样品对小鼠进行腹腔注射,0.5ml/只。分别在第0天和第7天进行两次腹腔注射免疫。
3)CVS毒攻击:第一次免疫后14天,用稀释好的约含45LD50病毒量的攻击毒CVS对小鼠进行颅内注射,每只0.03ml。
4)小鼠攻毒后逐日观察14天,并记录死亡情况,前3天死亡小鼠视为无效,统计第5天后死亡和典型狂犬病脑症状的小鼠。以狂犬病疫苗国家标准品(效力检定用)为参考疫苗,通过NIH法计算疫苗组和佐剂组的相对效力。
3.实验结果
该实验重复进行四次,相对效力情况见下表。
表4动物实验结果
4.实验分析
从上述结果可以看出,佐剂组的相对效力高于疫苗组。由于佐剂组中的抗原含量是疫苗组中抗原含量的一半,表明通过该制备工艺得到的BCG-CpG-DNA佐剂,配伍狂犬疫苗能够有效提升狂犬疫苗的免疫原性。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明的技术方案作任何形式上的限制。在不脱离本发明精神和范围的前提下的各种变化和改进仍在本发明的技术方案的范围内且属于要求保护的本发明的范围。