KR100266556B1 - 백일해균의 방어성분의 분리방법 - Google Patents
백일해균의 방어성분의 분리방법 Download PDFInfo
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Abstract
백일해균의 방어성분을 효율적으로 분리하는 방법을 제공하기 위해, 과량의 인산이온의 존재하에 칼슘이온을 백일해균 배양물에 첨가함으로서 형성된 인산칼슘겔에의 흡착능의 차이를 근거로 하여, 백일해균의 방어 성분을 백일해균 배양물로 부터 분리한다.
전통적으로, 백일해균의 방어성분은 각각의 방어성분에 상이한 방법을 사용하여 분리해왔다. 본 발명에 따라, 모든 목적하는 성분에 동일한 정제 방법을 사용함으로써 고효율 및 고회수율로써 각 성분을 정제하는 것이 가능케되며 공업적 제조의 면에서 매우 이롭다. 또한 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 백일해 독소(PT)의 효과적인 배합을 포함하는 개선 및 정제된 백일해 성분 백신을 효율적으로 생산할 수 있다.
Description
백신은 전염병을 예방하는 데 널리 사용된다. 백일해균의 감염에 의한 전염성 호흡 질환은 종종 발작이 따르는 무호흡 기침때문에 환자. 특히 유아에게 심각한 영햐을 끼칠 수 있다. 이러한 질환에 대처하기 위해, 불활성화 후 백일해균의 전체배양 균체 (불활성화된 백신)를 사용하는 것이 통상적으로 되어 왔다. 그러나, 백신화 우치에서의 국부 반응 및 부반응, 예컨대 열병과 같은 것이 보고되었으며 이러한 문제를 해결하기 위한 사회적 요청이 있어 왔다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 백신으로서 백일해균으로부터 분리한 보호 성분을 사용하려는 다수의 시도가 있었다. 예를 들면, 백일해 독소(Pertussis toxin; PT), 백일해 섬유상 적혈구 응집소(Pertussis filamentous hemagglutinin;FHA), 백일해 외막 단백(Pertactin; PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(Pertussis fimbriae;FIM)와 같이 백일해균으로부터 추출한 후, 엔도톡신 (ET)을 제거함으로써 제조한 비세포성 백일해 백신(ACP 백신)을 실용화할 수 있으나, 하기의 결점으로 인해 만족할 만하지 못하다.
백일해 독소(PT), 백일해 섬유상 적혈구 응집소 (FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM)는 모두 이미 인증된 실용성을 갖는 백일해 균의 보호 성분으로서, 개별의 방법으로 분리된다.
백일해 독소(PT)은 리간드로서 인간의 헵토글로빈을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다. [Biochemica et Biophysica Acta, 580권, p.175(1979)]. 그러나, 인간 헵토글로빈은 인간 혈액으로부터 채집되기 때문에 헤파티티스 비루스에 의해 오염될 수 있으며; 동물 혈장을 사용하는 경우도 동일하다. 또다른 방법으로는 리간드로서 변성 세롤로플라즈민을 사용하는 친화성 크로마토그래피이다(일본특허공개 제62135/1987). 이 방법은 비루스의 오염 문제는 없으나, 세로로플라즈민에 의한 백신 오염 및 고독성 및 소디움 티오시아네이트 및 기타의 단백질 변성 효과를 갖는 용출액의 잠재적 채내 보유를 포함하는 몇몇 문제가 발생한다.
백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA) 에 있어서, 히드록시에퍼타이트(수산화 인희석)겔을 사용하는 정제 방법이 사용가능하다 [Infection and Immunity, 41권, p313 (1983) 및 EP-A-231083, EP-A-427462, EP-A-462534; 일본 특허공개 제234031/1987, 169893/1992, 368337/1993 호]. 그러나, 이 방법은 컬럼 크로마토 그래피는 시간이 오래 걸리며 히드록시애퍼타이트의 고가로 인해 비경제적이다.
백일해 외막 단백에 있어서 (PRN, 69K-OMP), 리간드로서 마우스 혈장을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있으나 [Infection and Immunity, 56권 p.3189 (1988)], 상기와 같은 문제가 있다.
백일해 선모(FIM) 에 있어서, 백일해균 균체 추출물을 황산암모늄 및 염화 마그네슘으로 염석하여 정제할 수 있으나[ Infection and Immunity, 48권, p.442(1985)], 이 방법은 지수율로 인해 백신 생산 효율이 작다.
수산화알루미늄 젤로 흡착함으로써 그램-음성 박테리아 백신을 제조하는 방법이 있다(WO 93/10216). 이 방법은 다량의 수산화알루미늄 겔을 필요로 하며, 이것은 방어성분 및 그램-음성 박테리아에서 유래하는 엔도톡신을 흡착한다. WO93/10216의 방법으로 수득한 백신은 희석된 백신때문에 체내로 배출되는 엔도톡신에 의해 열병 및 엔도톡신 쇼크와 같은 부작용의 위험이 있다.
백일해균에서 유래되는 각각의 방어성분을 분리하지 않고 성분 혼합물로서 포함되는 백일해 백신 제조에 있어서, 인산칼슘 겔을 사용하는 방법을 사용할 수 있다(EP-A-291968, 일본특허공개 제52726/1989). 그러나, 이 방법은 1 M 의 염화나트륨의 존재하에 방어성분을 흡착하지 않는 인산칼슘을 형성한다.
상기와 같이, 백일해균의 각각의 방어성분을 분리하기 위해 전혀 다른 방법을 사용하여야 한다. 이러한 접근은 힘든 조작으로 인해 대규모 백신의 제조에는 적당하지 않으며, 실용화하기가 어렵다. 또한, 선행 기술에 개시된 방어성분을 분리하는 통상의 방법은 물질 또는 시약이 병원성 또는 독성을 갖는다는 문제점을 갖는다.
본 발명은 백일해균(Bordetella pertussis)의 방어성분의 분리방법에 관한 것이다. 백일해 백신은 본 발명의 방법으로 분리한 방어성분을 적절히 혼합함으로써 제조될 수 있다.
상기의 상황에 대하여, 본 발명가들은 백일해균의 방어성분을 효율적으로 분리하는 방법을 연구하였으며, 백일해균의 방어성분을 과량의 인산이온의 존재하에 칼슘이온을 백일해균 배양액 중에 첨가함으로써 형성된 인산칼슘 겔에 대한 흡착능의 차이를 근거로 백일해균 배양물로부터 효율적으로 분리할 수 있음을 발견하였다. 본 발명가들은 이러한 발견을 근거로 더욱 연구하여, 인산칼슘 겔 처리 및 염에 의한 용출 및 가열과 결합된 방어성분 분리의 효율적이고 안전한 방법을 개발하였다. 따라서, 본 발명은 : (1)인산이온의 존재하에 칼슘이온을 배양액에 첨가함으로써 형성된 인산칼슘 겔과 백일해균을 접촉시킴으로써, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM), 및 백일해 독소(PT)으로 구성된군으로부터 1종 이상을 분리하는 방법.
(2) 백일해균 배양물을 균체 및 배양액으로 분리하고, (A), (B), (C)및 (D)중 하나 이상을 실시함으로써, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM), 및 백일해 독소(PT)으로 구성된 군으로부터의 1종 이상을 분리하는 방법:
(A)분리된 균체를 염 용액으로 용출하고, 용출된 상청액에 제1항에 인산칼슘 겔을 접촉시킴으로써 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)를 분리하는 공정,
(B)상기 공정(A)의 용출 처리후 발생하는 균체 잔류물에 염 용액을 가하여 가온한 후, 제1항의 인산칼슘 겔을 접촉시킴으로써 수득되는 상청액에서 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 분리하는 공정,
(C)상기 공정(A)의 용출 처리후 발생하는 균체 잔류물에 염 용액을 가하여 가온한 후, 그의 상청액에 제1항의 인산캄슘 겔을 접촉시키고, 염 용액으로 용출한 후의 상청액에서 백일해 선모(FIM)를 분리하는 공정,
(D)배양물 또는 분리된 배양액을 제1항의 인산칼슘 겔에 접촉시킨 후, 그의 상청액에서 백일해 독소(PT)를 분리하는 공정,
(3)상기 (2)의 방법에 있어서, 공정(A)에서, 상청액에 인산칼슘 겔을 접촉시키고 염 용액으로 용출시켜 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 분리하는 방법.
(4)상기 (2)의 방법에 있어서, 공정(B)에서, 인산칼슘 겔과 접촉시킨 후의 상청액을 이온 교환 겔과 접촉시켜 백일해 외막 단배(PRN, 69K-OMP)을 분리하는 방법.
(5)상기 (2)의 방법에 있어서, 공정(C)에서, 인산칼슘 겔과 접촉시킨 후의 상청액을 제거하고, 생성된 잔류물을 염 용액으로 용출시켜 백일해 선모(FIM)를 용출 분리하는 방법.
(6)상기 (2)의 방법에 있어서, 공정(D)에서, 상청액에 이온 교환 겔을 접촉시켜 백일해 독소(PT)를 분리하는 방법.
(7)상기 (2)의 방법에 있어서, 공정(A)및 (C)에서 사용한 염용액이 알칼리금속염을 함유하는 완충액인 방법.
(8)상기 (7)의 방법에 있어서, 염용액이 0.01-1.0M 염화나트륨을 함유하는 완충액인 방법.
(9)상기 (1)또는 (2)의 방법에 있어서, 인산이온의 존재하에 pH7-9의 배양물 또는 상청액에 칼슘이온을 첨가함으로써 인산칼슘 겔을 생성하는 방법.
(10) 상기 (9)의 방법에 있어서, 인산이온과 칼슘이온의 당량비가 칼슘이온 1당량당 인산이온이 1.25-30 당량인 방법.
(11) 상기 (9)의 방법에 있어서, 0.05-0.1M인산 완충액의 존재하에 칼슘 이온원으로서 0.1-2w/v %의 아세트산 칼슘을 첨가함으로써 인산칼슘 겔을 생성하는 방법.
(12)상기 (1) 또는 (2)의 방법에 있어서, 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM)로 구성된 군으로부터의 1종 이상을 분리한 후, 황산암모늄의 존재하에 엔도톡신을 수산화알루미늄 겔을 흡착시켜 제거하는 방법.
(13)상기 (1)또는 (2)의 방법에 있어서, 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM)로 구성된 군으로부터의 1종 이상을 분리한 후, 엔도톡신을 띠 원심분리에 의해 제거하는 방법.
(14) 성분 PT;FHA;FIM 이 4~6;8~10:1의 조성비로 혼합되어 있는 백일해 백신.
(15)성분 PT: FHA : PRN : FIM 이 2~6;4~10:1~2: 1의 조성비로 혼합되어 있는 백일해 백신.
발명을 실행하기 위한 최상의 유형
본 발명에 사용되는 백일해균종은 모두 백일해균의 방어성분인 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP) 및 백일해 선모 (FIM) 및 백일해 독소 (PT)으로 구성된 균으로부터의 1종 이상을 생산할 수 있는 한 제한을 받지 않는다. 유용한 종으로는 백일해균 토하마 페이스 1종 [Infection and Immunity, 6권, p.89, (1972)](일본 도오쿄, National Institute of Health, Ministry of Social Welfare(NIHJ 1052)에 보관, 1980년 8월 13일부터 오오사까, Institute for Fermentation 에 허가번호 IFO 14073으로 기탁됨), 백일해균 야마구찌 페이스 1종, 백일해균 페이스 1종 18-323 및 백일해균 페이스 1종 165과 같은 공지의 종을 포함하며, 백일해균 토하마 페이스 1종( IFO 14073)이 생산성 면에서 바람직하다. 백일해균은 공지의 방법으로 배양할 수 있다. 유용한 배지로는 코헨-휠러 배지, 스테이너-숄트 배지 및 기타의 액체 배지와 같은 공지의 기본 배지를 포함하며, 스테이너-숄트 배지가 바람직하다. 방어성분 및 엔도톡신(ET)을 함유하는 용액은 정지 배양 또는 탱크 배양으로 수득한 배양물일 수 있다. 본 발명에서, 배양물은 상기 백일해균을 배양함으로써 생성된 배양 균체 또는 배양액을 의미한다. 또한, 본 발명에서 성청액은 염용액의 존재하에 균체를 가열하거나 하기와 같이 염용액으로 인산캄슘 겔로부터 흡착된 방어성분을 용출시킴으로써 생성된 배양액 또는 상청액을 의미한다. 균체는 배양 균체 및 균체 잔류물을 포함한다. 본 발명에서, 백일해균 배양물을 균체 및 배양 상청액으로 분리하기 위해 사용하는 방법은 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 인산칼슘 겔은 기성겔이 아니라, 바람직하게는 과량의 인산이온의 존재하에 칼슘이온을 첨가함으로써 처리할 배양물 또는 상청액내에 생성된 인산칼슘 겔이다(인사이드 겔 생성법으로 언급할 수 있음). 제조된 인산칼슘 겔이기는 하지만(예, 시판되는 히드록시애퍼타이트 겔), 상기의 기성의 히드록시 애퍼타이트 겔을 사용하는 이전의 방법(아웃사이드 겔 생성법으로 언급할 수 있음)과 비교할 때, 인산칼슘 겔을 사용하는 본 방법은 이하에서 처럼, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA) 및 백일해 선모(FIM)에 대한 흡착 효율 및 그들의 회수 효율 모두가 높다. 또한, 본 발명에서 사용하는 인산칼슘 겔은 겔 처리 및 재생 공정이 없기 때문에 조작 효율이 더 좋으며 비용면에서 더욱 유리하다. 또한, 백일해균의 각 방어성분을 인산이온 대 칼슘이온의 비를 적절히 선택함으로써 인산칼슘 겔로 선택적으로 흡착시킬 수 있다. 인산칼슘 겔로 처리할 배양물 또는 상청액이 충분량의 인산이온을 함유하지 않는 경우, 적절하종도의 인산염 완충액을 첨가하여 칼슘이온의 첨가전에 인산이온을 제공한다. 예컨대, 1M의 인산염 완충액을 첨가함으로써, 최종 인산이온의 농도를 0.02-0.2M, 바람직하게는 0.05-0.1M 로 조절한다.
첨가한 칼슘이온 원은 예컨대 아세트산칼슘, 염화칼슘 및 질산칼슘과 같은 가용성 칼슘염이며, 아세트산칼슘으로부터 유래하는 칼슘이온이 바람직하다. 인산이온 대 칼슘이온의 비에 있어서는, 칼슘이온에 비해 인산이온이 과량인 것이 바람직하다. 비는 하기와 같이 백일해균의 각 방어성분마다 적절히 선택할 수 있다.
상기 방법(A)에서, 백일해 섬유상 적혈구 응집소 (FHA)은 하기와 같이 분리한다 : 배양액, 즉, 배양 상청액을 원심 분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 백일해균 배양물로부터 제거하고, 1/10 내지 1/20 부피(배양 브로쓰의 양에 대해)(최종 균체 농도 50-100 십억균체/m1에 상응)의 염용액을 균체에 첨가하여 헤마글루티닌을 용출시킨다. 이 경우, 사용하는 염용액은 바람직하게는 알칼리금속염 또는 알카리 토금속염을 보충한 완충액이며, 구체적으로는 0.25-1.0M 의 알칼리금속염 또는 알라칼리토금속염을 보충한 0.04-0.08 M의 인산염 완충액이며, 0.5-1.0M의 알칼리금속염을 보충한 0.05M의 인산염 완충액이 가장 바람직하다.
완충액에 첨가된 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화마그네슘이다. 예컨대, 0.5-1.0M 의 염화나트륨을 보충한 1/10내지 1/20부피(배양 브로쓰에 대해)의 0.04-0.08 M 인산염 완충액(pH 7-9), 더욱 바람직하게는 1M의 염화나트륨을 보충한 인산염 완충액(pH 8)를 채집한 균체에 첨가한 후, 4℃ 내지 실온, 바람직하게는 8-15 ℃에서 1-60 분간, 바람직하게는 1-30분간 완만하게 교반한 후, 1-2일간 정지함으로써 헤마글루티닌을 용출시키는 것이 바람직하다. 용출된 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 함유하는 용액을 그 후 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 처리하여 상청액을 회수한다. (이 처리에 의해 수득한 균체 잔류물은 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM))를 분리하는 데 사용한다). 이렇게 수득한 상청액을 그 후 인산칼슘 겔과 접촉시킨다.
인산이온 및 칼슘이온의 비에 대해서는, 칼슘이온에 비해 인산이온이 과량인 것이 바람직하다. 예컨대, 이들 이온의 당량비는 칼슘이온 1당량당 바람직하게는 1.25-30당량, 더욱 바람직하게는 1.5-7.5 당량이다. 이 양적 비는 칼슘이온 1M 에 대한 인산이온 0.8-20M, 더욱 바람직하게는 칼슘이온 1M에 대한 인산이온 1-5M의 몰비로 표현할 수 있다. 예컨대, 상기 농도 범위(0.02-0.2 M, 바람직하게는 0.05-0.1M) 에서의 농도에서 인산이온을 함유하는 용액(pH 7-9)에, 칼슘염을 첨가하여 최종 농도를 4-70 mM, 바람직하게는 8-50 mM(예, 아세트산 칼슘을 첨가하여 최종 농도가 0.1-0.8 w/v %, 바람직하게는 0.2-0.6 w/v %)으로 한후, 4℃ 내지 실온, 바람직하게는 8-15 ℃에서 1 내지 4시간, 바람직하게는 1 내지 2시간동안 완만한 반응을 행하여 인산캄슘 겔을 생성한다.
첨가된 인산칼슘 겔의 양이 최종 농도가 0.8w/v %을 초과한다면, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)이 첨가된 아세트산칼슘 겔이 흡착될지라도, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA) 만을 선택적으로 흡착하기 위해, 최종 농도가 상기 농도범위내가 되도록 하는 양으로 아세트산칼슘 겔을 첨가하는 것이 바람직하다. 반응의 종결 후, 상청액은 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 제거하고; 생성되는 겔 침전물을 채집한다. 이 침전물에, 1/10 내지 1/20 부피(배양 브로쓰의 양에 대해)의 염 용액을 첨가하여, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 용출한다. 이경우, 사용하는 염요액은 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 용출시키는데 사용한 동일한 염요액일 수 있다. 1-2M의 염화나트륨을 보충한 1/10내지 1/20 부피(배양 브로쓰의 양에 대해)의 0.05-0.1M의 인산염 완충액(pH 7-9), 더욱 바람직하게는 1-1.5M의 염화나트륨을 보충한 0.1M 의 인산염 완충액 (pH 7-9), 더욱 바람직하게는 1-1.5M 의 염화나트륨을 보충한 0.1M의 인산염 완충액(pH8)를 상기 겔 침전물에 첨가한 후, 4℃ 내지 실온에서 1 내지 2시간 동안 완만한 교반을 하여 헤마글루티닌을 용출시키는 것이 바람직하다. 교반의 종결후, 침전물을 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 제거하여 상등액내의 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 회수한다. 필요시, 황산암모늄 염석 또는 초여과막을 이용하여 상청액을 농축시키고 탈염시킬 수 있다. 상기 처리로 수득한 상청액에 하기의 수산화알루미늄 겔 처리 또는 띠 원심분리를 행함으로써, 선택적으로 제거된 엔도톡신을 갖는 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 실질적인 손실없이 분리할 수 있다.
상기 방법(B) 또는 (C)에서, 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM)는 하기와 같이 본리한다. : 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 함유하는 용액의 용출로부터 생성되는 균체 잔류물을 1/10 내지 1/20 부피(배양 브로쓰의 양에 대해)(최종 균체 농도 50-100 십억균체/ml에 상응)의 염용액의 존재하에 가열하여 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM)를 추출한다. 그러나, 0.15-0.25 M의 염화나트륨을 보충한 0.01 M의 인산염 완충액(pH 7)가 가장 바람직하다. 가열은 온수중에서 40 내지 80℃, 바람직하게는 50-60 ℃에서 60 내지 120분간, 바람직하게는 80-90 분간 실행하는 것이 바람직하다. 가열 추출된 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)및 백일해 선모(FIM)를 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 상청액중에서 회수한다. 이렇게 수득한 상청액을 그 후 인산칼슘 겔과 접촉시킨다. 이 경우, 인산칼슘 겔 처리는 상기 방법(A)에 따라 실행할 수 있으나; 하기 농도 범위에서 실행하는 것이 바람직하다. 예컨대, 1M의 인산염 완충액 등을 첨가함으로써 필요에 따라, 0.05-0.1 M, 바람직하게는 0.1M의 농도로 조절된 인산이온을 함유하는 용액(pH 7-9)에, 칼슘염을 첨갛여 최종 농도가 40-180 mM, 바람직하게는 55-150mM(예, 아세트산칼슘을 첨가하여 최종 농도가 1-2 w/v %, 바람직하게는 1.3-1.7 w/v% 가됨)이 되도록 한 후, 4℃ 내지 실온, 바람직하게는 8-15 ℃에서 1내지 4시간, 바람직하게는 1 내지 2시간 완만한 반응을 행하여 인산칼슘 겔을 생성시킨다. 반응 종결 후, 생성 침전물 및 상청액을 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 분리방법으로 각각으로부터 분리하여 실질적으로 손실이 없이 상청액 중의 백일해 외막 단백(PRN, 69K -OMP)및 겔 잔류물 중의 백일해 선모(FIM)를 회수한다.
상기의 처리에 의해 수득한 조정제된 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 추가로 공지의 방법, 바람직하게는 이온 교환 겔 처리로 정제할 수 있으며; 조정제된 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 황산암모늄 염석 또는 초여과막을 사용하여 미리 농축시킨 후 탈염하는 것이 바람직하다. 본 발명에서, 유용한 이온 교환 겔은 음이온 교환 겔 및 양이온 교환 겔을 포함하며 양이온 교환 겔이 바람직하다. 이온 교환 겔과의 접촉은 컬럼 크로마토그래피법이나 배치법으로 실행할 수 있다. 이 처리에 의해, 불순물, 즉, 조정제된 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)중 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)이외의 물질이 흡착되며; 용출액을 채집하여 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 함유하는 용액을 수득한다. 컬럼 크로마토그래피법에서, 컬럼을 이온 교환 겔로 채우고, 이를 통해 출발 물질, 즉, 조정제된 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)이 100-500 ml/㎠/시의 유속으로 통과한다. 배치법에서, 조정제된 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 용기에 정치하고, 여기에 이온 교환 겔을 직접 첨가한 후, 약 30분 내지 약3 시간, 바람직하게는 약 1 시간 교반하여 불순물, 즉, 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)이외의 물질을 흡착시킨다. 이러한 불순물 흡착은 pH 5.0-8.0이고 전기전도성이 100-300umho (0.1-0.3mS)의 완충액, 예컨대, 0.01-0.02 M의 인산염 완충액(pH 5.5-6.0)를 사용하여 실행한다. 상기 처리에 의해 수득한 상청액에 하기의 수산화알루미늄 겔 처리 또는 띠 원심분리 처리를 행함으로써 제거된 엔도툭신을 갖는 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 손실없이 분리할 수 있다.
상기 처리에 의해 수득한 조 백일해 선모(FIM)를 함유하는 겔 잔류물에 1/10 내지 1/20 부피(배양 브로쓰의 양에 대해)의 염용액을 첨가하여, 백일해 선모 (FIM)를 용출시킨다. 이 경우에도, 염용액은 상기 (A)방법의 것과 동일할 수 있다. 예컨대, 1/10 내지 1/20 부피 (배양 브로쓰의 양에 대해)의 1-2 M의 염화나트륨을 보충한 0.05-0.1M 인산염 완충액 (pH 7-9), 바람직하게는 1-1.5 M의 염화나트륨을 보충한 0.1 M인산염 완충액(pH 8)를 첨가한 후, 4℃ 내지 실온에서 1 내지 2시간 동안 완만한 교반을 하여 백일해 선모(FIM)를 용출시키는 것이 바람직하다. 교반의 종결 후, 침전물을 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 제거하여 상청액중의 백일해 선모 (FIM)를 회수한다. 상기 처리로 수득한 상청액에 하기의 수산화알루미늄 겔 처리 또는 띠 원심분리를 행함으로써, 선택적으로 제거된 엔도톡신을 갖는 백일해 선모(FIM)를 실질적으로 손실없이 분리할 수 있다.
상기 방법(D)에서, 백일해 독소(PT)은 하기와 같이 분리하다; 백일해균 배양물을 이 공정 중의 배양된 균체 및 배양 상청액내로 분리하지 않고 사용할 수 있을지라도, 효율성의 면에서 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 백일해균 배양물로부터 상청액을 회수하고, 상청액을 초여과막 등을 사용하여 약 10-20배로 농축시킨 후, 원심분리 또는 이 공정 전에 기타의 방법으로 상청액을 채집하는 것이 바람직하다. 그 후 이 상청액을 인산칼슘 겔과 접촉시킨다. 이 경우, 인산칼슘 겔 처리는 상기 공정(A)와 동일한 방법으로 실행할 수 있으나, 이 처리는 하기의 농축 범위에서 실행하는 것이 바람직하다. 예컨대, 필요에따라 1M의 인산염 완충액 등을 첨가함으로써 최종 인산이온 농도가 0.05-0.1M, 바람직하게는 0.1 M로 조절된, 인산이온을 함유하는 용액(pH 7-9)에 칼슘이온을 첨가하여 최종 농도가 40-180 mM, 바람직하게는 55-150 mM(예, 아세트산 칼슘을 첨가하여 최종 농도가 1-2w/v %, 바람직하게는 1.3-1.7 w/v %)로 한 후, 4℃ 내지 실온, 바람직하게는 8-15 ℃에서 1 내지 4시간, 바람직하게는 1 내지 2시간 완만한 반응을 행하여 인산칼슘 겔을 생성시킨다. 반응의 종결 후, 생성 침전물 및 상청액을 원심분리 또는 여과와 같은 공지의 방법으로 서로 분리하여, 실질적으로 손실이 없이 상청액 중의 백일해 독소(PT)을 회수한다. 상기 처리에 의해 수득한 조정제된 백일해 독소(PT)을 이온교환 겔 처리로 추가로 정제하며; 조정제된 백일해 독소(PT)은 미리 농축시켜 황산암모늄 염석 또는 초과여막을 사용하여 탈염시키는 것이 바람직하다. 여기서 사용하는 이온 교환 겔은 예컨대 음이온 교환겔 및 양이온 교환겔이며, 바람직하게는 양이온 교환 겔이다. 이온 교환 겔과의 접촉은 컬럼 크로마토그래피법 또는 배치법에 의해 달성할 수 있다. 이 처리에 의해, 조정제된 백일해 독소 중의 백일해 독소(PT)을 겔에 흡착시키고, 적당한 완충액로 세척하여 불순물을 용출 및 제거한 후, 백일해 독소(PT)을 적당한 pH 및 이온 강도의 완충액로 용출 및 분리한다. 컬럼 크로마토그래피법에서, 컬럼을 이온 교환 겔로 충진시키고, 이를 통해, 출발 물질, 즉, 조정제된 백일해 독소(PT)을 100-500 ml/㎠/시의 유속으로 통과시켜 톡신 흡착을 발생시킨다. 배치법에서, 조정제된 백일해 독소(PT)을 용기내에 정치하고, 여기에 이온 교환 겔을 직접 첨가한 후, 약 30분 내지 3시간, 바람직하게는 약 1시간 동안 교반하여 톡신 흡착을 발생시킨다. 조정제된 백일해 독소(PT)의 이러한 흡착은 5.0-6.0의 pH 레벨 및 100-300 umho(0.1-0.3 ms)의 전기전도성을 갖는 완충액, 예컨대,0.01-0.02 M의 인산염 완충액(pH 5.5-6.0)를 사용하여 실행한다. 백일해 독소(PT)이 흡착된 이온 교환 겔로부터의 용출은 7.0-7.5의 pH레벨 및 1,000~2,000umho(1-2mS)의 전기전도성을 갖는 완충액, 예컨대, 0.1-0.2M 의 인산염 완충액(pH 7.0-7.5)를 사용하여 실행할 수 있다. 상기의 처리에 의해 수득한 용출물에 하기의 수산화알루미늄 겔 처리 또는 띠 원심분리 처리를 행함으로써, 선택적으로 제거된 엔도톡신을 갖는 백일해 독소(PT)을 실질적인 손실 없이 분리할 수 있다.
본 발명에서, 엔도톡신 제거를 위한 수산화알루미늄 겔 처리는 황산암모늄의 존재하에 미리 제조한 수산화알루미늄 겔과 접촉시킴으로써 선택적으로 엔도톡신만을 흡착하기 위해 실행한다. 그러나, 사용량이 WO93/10216에서 사용한 것의 1/10미만인 수산화알루미늄 겔은 백일해균의 방어성분 중 어느 것도 거의 흡착하지 않는다. 대개 이 처리는 황산암모늄 염석 또는 초여과막법과 같은 공지의 방법으로 농축시킨 후 실행하는 것이 바람직하다. 미리 제조한 수산화알루미늄 겔에 유용한 알루미늄 이온은 황산암모늄 및 염화암모늄과 같은 가용성 알루미늄 화합물의 것을 포함하며, 염화알루미늄의 알루미늄 이온이 바람직하다. 수산화알루미늄 겔은 수산화나트륨 2M 용액을 25-190 mM의 알루미늄 염 용액(예, 0.9-4.5 %염화 알루미늄 용액)에 첨가하여 pH 가 7.0-7.5가 되게 한 후, 4℃ 내지 실온에서 1 내지 3시간 완만한 반응을 행함으로써 목적하는 수산화알루미늄 겔을 생성시키는 것이 바람직하다. 이어서 상기 처리로 수득한 수산화알루미늄 겔을 처리하여 여과 또는 원심분리와 같은 공지의 방법으로 생성 겔 침전물을 회수하고, 반응 종결후 유리 알루미늄 이온을 제거한다. 황산암모늄 염석과 같은 공지의 방법으로 농축시킨 백일해균의 방어성분을 원심분리로 회수하고; 침전물을 0.25 M의 염화나트륨을 보충한 0.25 M의인산염 완충액(pH 7.0-7.5)중에 용해시킨다. 백일해균의 이러한 방어성분에 포화 황산암모늄 용액을 첨가하여 최종 농도가 2.0-8.0v/v %가 되게 한 후, 미리 제조 및 회수한 수산화알루미늄 겔을 첨가하여 최종 농도가 0.1-1.0mg/ml, 바람직하게는 0.2-0.5mg/ml로 하고, 4℃ 내지 실온에서 30분 내지 1시간 완만한 반응을 행한다. 반응의 종결 후, 수산화알루미늄 겔을 여과 또는 원심분리와 같은 공지의 방법으로 제거하여, 실질적으로 손실없이 제거된 엔도톡신을 갖는 백일해균의 방어성분을 분리한다.
본 발명에서, 띠 원심분리 처리는 엔도톡신을 제거하기 위해 실행하며, 황산암모늄 염석과 같은 공지의 방법에 의해 농축시킨 후 실행하는 것이 바람직하다. 띠 원심분리법은 수크로스 밀도구배 원심분리, 염화세슘 밀도구배 원심분리 및 타르타르산 칼륨 밀도구배 원심분리를 포함하며, 수크로스 밀도구배 원심분리가 바람직하다. 예컨대, 수크로스 밀도구배 원심분리를 0-30 w/v%의 수크로스 밀도구배 및 60,000 내지 122,000 G의 Rmax에서 약 10 내지 24시간 실행하는 경우, 제거된 엔도톡신을 갖는 백일해균의 방어성분을 분리할 수 있다.
PT는 [British Journal of Experimental Pathology, 44권, p.177(1963)]에 기술된 종래의 해독 기술을 사용하여 해독한다. 예컨대 FHA, PRN 및 FIM은 일본 특허공개 제 52726/1989호에 기술된 방법으로 불활성화할 수 있다. 공지의 백일해 백신보다 우수한 개선된 정제 백일해 성분 백신은 본 발명에서 수득한 백일해균의 방어성분을 임의의 목적하는 비로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 즉, 정제된 각각의 성분을 수득하지 않고, 전체 균체 또는 함께 정제된 비세포성 백신 중에서 안정한 각 성분들의 비를 변경하는 것은 불가능하며, 한편, 각 성분이 본 발명에서 효율적으로 정제되기 때문에 백일해 백신으로서 인간에 있어서 최적 반응을 보이는 최적치를 주도록 본 발명에서의 항원비는 선택할 수 있다. 정제된 백일해 성분 백신은 가능한 한 적은 양의 총단백질로 더욱 효과적인 면역 발생성을 부여하는 방법으로 방어성분들을 배합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 정제된 백일해 성분 백신은 이들 성분 모두, 즉, FHA, FIM 및 PT을 포함하며, 또한 바람직하지 못한 부작용을 주지 않는 PRN과 같은 기타의 약제학적으로 허용가능한 성분들을 포함할 수 있다.
이들 성분들을 배합하여 본 발명의 정제된 백일해 성분 백신을 제조하는 경우, 그의 비는 이하의 실시예에 예시되어 있다. 본 발명의 성분 백신은 PT;FHA;FIM의 비가 약 4-6 : 8-10:1,바람직하게는 5-6 : 8-10:1 이며, 예컨대 20-30㎍-단백질/ml의 PT, 40-50 ㎍-단백질/ml의 FHA 및 5-10 ㎍-단백질/ml 의 FIM, 바람직하게는 25-30 ㎍-단백질/ml의 PT, 40-50 ㎍-단백질/ml의 FHA 및 5-10 ㎍-단백질/ml 의 FIM을 포함한다. 상기의 성분 백신은 또한 5-10㎍-단백질/ml의 PRN을 포함할 수 있으며, PT:FHA:PRN:FIM 의 비가 2-6:4-10:1-2:1, 바람직하게는 5-6:8-10:2:1 이다. 즉, 25-30㎍-단백질/ml의 PT, 40-50 ㎍-단백질/ml 의 FHA 및 10㎍-단백질/ml의 PRN 및 5㎍-단백질/ml 의 FIM을 포함한다
본 발명의 상기 효과는 하기로 요약할 수 있다. : 본 발명의 방법은 백일해균의 모든 목적하는 방어성분에 동일힌 정제 방법을 사용하는 것을 특징으로 한다. 이것은 선행 기술의 방법에서와 같이 각 성분들에 대해 각기 다른 노력이 수반되는 공정의 필요성을 없애며, 따라서 고효율 및 고회수율의 성분 정제에 공업적 규모의 제조에 매우 이로운 면을 제공한다. 또한, 리물리스(Limulus)시험으로 결정한 엔도톡신 함랴은 본 발명에서 수득한 백일해균의 모든 방어성분에 있어서 총 단백질 100㎍ 당 1ng 이하이며, 매우 높은 실용적인 가치를 제공한다. 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 백일해 독소(PT)의 효과적인 조합을 포함하느 개선된 정제 백일해 성분 백신을 제조할 수 있다.
본 발명을 이하기술된 실시예 및 참조예로써 더욱 상세히 설명할 것이다. 이에 국한되는 것은 아니다. 하기의 설명에서, 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 엔도톡신은 각각 PT, FHA, 69K-OMP, FIM 및 ET로 언급한다.
[실시예 1]
백일해균 토하마 페이스 1종을 배양하여 스테이너 숄트 배지를 사용한 록스병(Roux bottle)정지 배양(450ml, 35℃, 5일)후 탱크 교반 배양(40ml, 35℃, 2일)에 으해 최종 농도가 2십억 균체/ml가 되게 하여 백일해균 배양물을 수득한다.
균체 배양물을 초과여막을 사용하여 1/10부피로 농축시키고, 이어서 원심분리하여 상청액과 균체를 분리한다. 상청액에, 1M 의 인산염 완충액(pH 8.0)를 첨가하여최종 농도가 0.1M이 되게 한 후, 아세트산 칼슘 용액을 첨가하여 최종 농도가 1.6w/v %가 되게 한 후 실온에서 1시간 교반한다. 이 인산칼슘 겔 용액을 여과한다. 생성 여액을 농축시키고 탈염하여 초여과막을 사용하여 전기전도성이 200umho가 되게 한 후, 슬포프로필 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Tosoh사제)을 통과시킨 후, 0.01M인산염 완충액(pH 6.0)로 세척하고, 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)로 용출시켜 백일해 독소(PT)을 수득한다. 다음으로, 균체를 1 M의 염화나트륨이 보충된 0.05M의 인산염 완충액(pH8.0)1/10부피(배양 브로쓰의 대해)중에 분산시킨 후 원심분리하여 성청액과 균체를 수득한다. 상청액에, 아세트산 칼슘 용액을 첨가하여 최종 농도가 0.5w/v %로 한후, 실온에서 1시간 교반한다. 이 인산칼슘 겔 용액을 여과하고; 생성되는 겔 층을 채집한다. 겔 층을 1M의 염화나트륨이 보충된 0.1M의 인산염 완충액(pH 8.0)로 용출하여 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)을 수득한다. 별도로,균체를 0.15M의 염화나트륨이 보추된 0.01M의 인산염 완충액(pH 7.0) 1/10부피(배양 브로쓰의 대해)중에 분산시킨 후, 60℃의 온수중에 90분간 가열한 후, 원심분리하여 상청액을 수득한다. 상청액에 1M의 인산염 완충액(pH 8.0)를 첨가하여 최종 농도가 0.1M이 되게 한 후, 아세트산 칼슘 용액을 첨가하여 최종 농도가 1.6w/v %가 되게 한 후 실온에서 1시간 교반한다. 이 인산칼슘 겔 용액을 여과하고; 여액 및 겔층을 채집한다. 여액을 농축시키고 초여과막을 사용하여 탈염하여 전기전도성이 200umho가 되게 한 후, 슬포프로필 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Tosoh 사제)을 통과시키고; 용출액을 채집하여 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 수득한다. 별도로, 겔 층을 1M의 염화나트륨이 보충된 0.1M의 인산염 완충액(pH 8.0)로 용출시켜 백일해 선모(FIM)를 수득한다.
대조 샘플을 하기와 같이 제조한다; 황산암모늄을 배양 브로쓰 1ml당 220g으로 첨가한 후, 충분히 교반한다. 4℃에서 약 14일간 정지한 후, 혼합물을 원심분리하고; 상청액은 폐기하고, 침전물을 채집한다. 이렇게 수득한 침전물에 1M의 염화나트륨이 보충된 0.05M의 인산염 완충액(pH 8.0) 1/10부피(배양 브로쓰에 대해)를 첨가한 후, 충분히 교반한다. 4℃에서 4일간 정치한 후, 혼합물을 재차 원심분리하고; 상청액을 채집하여 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM)을 함유하는 용액을 수득한다.
각 샘플 중의 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 함량을 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM)의 정제된 제품으로서 참조로 하여 ELISA에 의해 결정한다. 결과를 ㎍ 단백질/ml단위로서 나타낸다.
단백질 함량 결정; 가열된 트리클로로아세트산으로 침전시킨 단백질을 소외혈청 알부민(Fraction V, 와꼬 퓨어 케미칼사제)을 참조로 사용하여 로우리법으로 정량화한다. 결과는 ㎍ 단백질/ml단위로서 나타낸다.
록스병 배양 브로쓰 및 탱크 배양 브로쓰의 결과를 표 1 및 2에 각각 나타낸다.
이들 수치로부터 각 방어성분이 효율적으로 분리되며, 탱크 배양 브로쓰의 경우, 록스병 배양 브로쓰에서는 낮은 생산성으로 제조되던 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP) 및 백일해 선모(FIM)가 다량으로 회수됨을 명백히 알 수 있다.
[참조예 1]
실싱ㅖ 1에서 제조한 대조 용액에 아세트산칼슘을 가하여 최종 종도가 0.5w/v %가 되게 한 후, 실온에서 1시간 교반한다. 이 칼슘 용액을 여과함으로써 수득한 영액에 포화 황산암모늄 용액의 반량을 가하고; 혼합물을 4℃에서 7일간 정치한다. 이 황산암모늄 염석 생성물을 원심분리하고; 생성 침전물을 채집한 후 0.25M의 염화나트륨이 보충된 0.025M의 인산염 완충액(pH 7.0)중에 재현탁시켜 출발 물질을 수득한다. 이 출발 물질에, 최종 농도가 0.4mg/ml로 미리 제조한 수산화알루미늄 겔을 가하고; 원심분리로 회수한 수산화알루미늄 겔을 황산암모늄을 가하여 최종 농도가 0, 2, 4, 또는 8w/v %가 되게 한 후, 실온에서 30분간 완만한 교반을 한다. 반응의 종결 후, 수산화알루미늄 겔을 원심분리로 제거하여 상청액을 분리한다. 각 상청액에 대해 하기 방법으로 헤마글루티닌 활성 및 엔도톡신 함량을 분석한다. 결과는 표 3에 나타낸다.
헤마글루티닌 활성의 측정 : 샘플을 0.01M의 인산염 완충액 식염액으로 순차로 2배 희석하고, 0.6v/v%칙 (chick)부동 적혈구 균체를 가하여 헤마글루티닌화를 발생시킨다. 헤마글루티닌화를 나타내는 각 샘플의 최대 희석 속도를 헤마글루티닌 적정 HA로 간주한다. 엔도톡신(ET)의 함량의 결정 : E. coli(Difco 055-B5)을 참조종으로서 사용하여 ET함량을 리물루스 시험(와꼬 케미칼 사제)으로써 결정한다. 결과는 ng/ml 단위로 나타낸다. 표3으로부터 황산암모늄의 존재하에 미리 제조한 수산화알루미늄 겔로써 샘플을 처리함으로써 활성 첨가물의 손실이 없이 엔도톡신을 선택적으로 제거할 수 있음이 명백하다.
[실시예 2]
실시예 1에서 수득한 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 의 각각에, 포화황산암모늄 용액의 반량을 가한 후, 충분히 교반한다. 4℃에서 1주간 정치한후, 혼합물을 재차 원심분리하고; 생성 침전물을 채집한다.
이 침전물을 0.25M의 염화나트륨이 보충된 0.025M의 인산염 완충액(pH7.0)중에 용해시켜 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 의 용액을 수득한다. 각 용액에 포화 황산암모늄 용액을 가하여 최종 농도가 4.0 v/v %가 되게 한다. 이 혼합물에, 미리 제조, 회수한 수산화알루미늄 겔을 가하여 최종 농도가 0.4mg/ml가 되게 한 후, 실온에서 30분간 완만히 교반한다. 반응의 종결 후, 수산화알루미늄 겔을 원심분리로 제거하여 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 를 수득한다.
백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 의 함량을 실시예 1과 동일한 방법으로 결정하고; 엔도톡신의 함량은 참조예 1과 동일한 방법으로 결정한다. 결과는 표 4에 나타낸다.
이 표로부터 실질적으로 어떠한 방어성분의 손실도 없이 엔도톡신을 선택적으로 제거할 수 있으며, 100㎍ 단백질/ ml당 엔도톡신의 함량은 모든 성분에 대해 1ng/ml이하이다.
[실시예 3]
실시예 1에서 수득한 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 의 각각에, 포화황산암모늄 용액의 반량을 가한 후, 충분히 교반한다. 4℃에서 1주간 정치한후, 혼합물을 재차 원심분리하고; 생성 침전물을 채집한다. 이 침전물을 1M의 염화나트륨이 보충된 0.05M의 인산염 완충액(pH8.0)중에 용해시킨 후, 1M의 염화나트륨이 보충된 0.05M의 인산염 완충액 (pH 8.0)를 사용하여 튜브법으로 투석하여 백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 의 용액을 수득한다. 농축 투석물에 1-30 w/w %의 수크로스 밀도구배 및 64,900G의 Rmax에서 약 18시간 수크로스 그래디언트 밀도 원심분리를 행한다. 원심분리 종결 후, 34 w/w % 수크로스를 낮은 회전 속도에서 로터에 공급하여 분획물을 채집한다.
백일해 독소(PT), 백일해 섬유상적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 의 함량을 실시예 1과 동일한 방법으로 결정하고; 엔도톡신의 함량은 참조예 1과 동일한 방법으로 결정한다. 결과는 표 5에 나타낸다.
이 표로부터 실질적으로 어떠한 방어성분의 손실도 없이 엔도톡신을 선택적으로 제거할 수 있으며, 100㎍ 단백질/ ml당 엔도톡신의 함량은 모든 성분에 대해 1ng/ml이하이다.
[실시예 4]
실시예 3에서 수득한 PT에 라이신과 같은 아미노산을 첨가하면서 포르말린을 가하여 최종 농도가 0.4v/v %가 되게 한 후, 혼합하고 배양기에 39℃에서 21-35일간 정치한다.
실시예 3에서 수득한 FHA, 69K-OMP 및 FIM의 각각에 포르말린을 가하여 최종 농도가 0.4v/v%가 되게 한 후, 혼합하고 배양기에 39℃에서 7일간 정치한다.
상기와 같이 처리한 각각의 이들 성분을 0.15M의 염화나트륨을 보충한 4mM의 인산염 완충액(pH 7.0)로 투석하여 해독된 PT, 불활성화된 FHA, 불활성화된 69K-OMP 및 불활성화된 FIM을 수득한다.
이들 해독되거나 불활성화된 성분들을 표 6 및 7에 나타낸 몇몇 비율로 배합한 후, 염화알루미늄을 가하여 최종 농도가 0.2mg/ml가 되게 하여 각각 백신을 수득한다.
이들 배합된 백신을 사용한 마우스의 대뇌내 효능의 실험 결과는 표6 및 7에 나타낸다. 생물학적 제품에 대한 일본인의 최저 요구치의 방법(일본 생물학적 약품 제조 협회)에 따라 실험을 실행한다.
이들 수치로부터 불활성화된 69K-OMP 및 불활성화된 FIM 모두는 마우스 대뇌내 효능에 적은 영향을 미치며, 해독 PT를 25㎍ 단백질/ml 이상 함유하는 배합백신 사이에는 어떠한 상당한 차이도 관찰하지 않았다.
[실시예 5]
마우스 에어로졸 감염 보호 효능 실험을 실시예4에서 수득한 배합 백신으로써 실행한다. 1/3으로 희석한 각 백신을 각 희석된 것의 0.2ml로써 4주된 마우스에 피하내로 투여한다. 투여 4주 후, 각 마우스에 에어로졸 챔버를 사용하여 백일해균의 18-323 페이스 1종으로 감염시킨 후, 10일 후에, 각 마우스의 복부를 열어 기관과 폐를 각각의 감염된 마우스로부터 꺼낸다.
각각의 균질화된 조직의 표본을 보르데-겐구(Bordet-Gengou)한천에 적용한다. 한천을 35℃에서 5 시간 배양한 후 백일해균의 콜로니 수를 계수한다.
비투여 마우스의 콜로니수를 근거로 하여, 보호 투여량을 계산한다.
기관의 경우 75%의 보호 투여량이 계산되었고, 폐의 경우 50%보호 투여량이 계산되었다. 결과를 ㎍ 단백질로 나타낸다.
또한 성장 저해유을 고튜여량의 투여군에서 계산한다. 성장 저해율 등식은 다음과 같다.
결과는 표 8에 나타난다.
이 표로부터 불활성화된 69K-OMP 및 불활성화된 FIM 모두는 마우스 대뇌내 효능에 적은 영향을 미치며, 에어로졸 감영효능에 대해 보호 효과를 나타낸다는 것이 명백하다.
[시험예 1]
FHA 및 FIM에 대한 인산칼슘 겔(인사이드 겔)및 히드록시애퍼타이트 겔(아웃사이드 겔)사이의 흡착능의 차이.
실시예 1에서 기술한 방법으로 제조한 룩스병 정지 배양. 균체 배양물을 초여과막을 사용하여 1/10부피로 농축시키고, 원심분리하여 상청액(샘플 a) 및 균체를 분리한다. 균체를 1M의 염화나트륨을 보충한 0.05M 의 인산염 완충액(pH 8.0) 1/10 부피 중에 분산시키고 잘 교반한다. 이를 4℃에서 4일간 정치한 후 원심분리하여 PT, FHA, 69K-OMP 및 FIM을 포함하여 용출된 상청액(샘플 b)을 수득한다.
배양 상청액(샘플a)과 용출된 상청액(샘플 b)을 하기 1) 또는 2)와 같이 처리한다.
1) 인산칼슘 겔(인사이드 겔)형성 처리
샘플에 1M의 인산염 완충액(pH 8)를 첨가하고, 아세트산칼슘 용액을 첨가하여 최종 농도가 0.5w/v %, 1.0 w/v % 또는 2.0 w/v %가 되게 하고 실온에서 1시간 완만하게 교반한 후, 1000rmp 에서 10분간 원심분리하여 상청액 및 겔 잔류물을 수득한다. 겔 잔류물을 1M의 염화나트륨을 보충한 0.1M인산염 완충액(pH 8.0)로 용출시켜 용출액을 수득한다.
2) 히드록시애퍼타이트 겔(아웃사이드 겔)처리
히드록시애퍼타이트 겔 (BDH 케미칼 사제)을 0.01 M의 인산염 완충액(pH 8.0)로 평형화한다. 겔을 20w/v %, 10 w/v % 또는 50 w/v %가 되게 하고 실온에서 1시간 완만하게 교반한 후, 1000rmp 에서 10분간 원심분리하여 상청액 및 겔 잔류물을 수득한다. 겔 잔류물을 1M의 염화나트륨을 보충한 0.1M인산염 완충액(pH 8.0)로 용출시켜 용출액을 수득한다.
각 샘플 중의 FHA 또는 FIM의 함량을 하우스 참조로서 FHA 또는 FIM을 사용하여 ELISA에 의해 결정한다. 분석 결과를 ㎍단백질/ml 단위로 나타낸다. 단백질 함량; 가열된 트리클로로아세트산으로 침전시킨 단백질을 참조로서 소의 혈청 알부민(Fraction V, 와꼬 케미칼사제)을 사용하여 로우리법으로 정량화한다.
결과는 ㎍단백질/ml 단위로 나타낸다.
FHA 및 FIM에 대한 겔에의 흡착율 및 회수율을 각각 하기의 등식으로써 계산한다.
인산칼슘 겔(인사이드 겔)은 FHA 와 FIM을 강하게 흡착하거나, 히드록시애퍼타이트 겔은 FIM에 대해 적은 흡착 효과를 갖는다. 또한 히드록시애퍼타이트겔은 인산칼슘 겔과 비교하여 FHA에 대해 적은 흡착 효과를 가지며 첨가한 부피에 영향을 받는다.
본 발명의 방법은 백일해균의 모든 목적하는 방어성분의 정제에 동일한 방법을 사용함을 특징으로 한다. 그러므로 각 성분을 고효율 및 고회수율로써 정제할 수 있으며, 공업적 제조에 매우 유리한 면을 갖는다. 또한 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM)및 백일해 독소(PT)의 효과적인 배합을 포함하는 개선 및 정제된 백일해 성분을 효과적으로 생산할 수 있다.
Claims (22)
- 백일해균 배양물에, 인산이온의 존재하에 칼슘이온을 첨가하여 생성되며, 특히 황산암모늄의 비존재하에서 형성되는 인산칼슘 겔을 접촉시키는 것을 특징으로 하는, 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 백일해 독소 (PT)로 구성된 균으로부터 1종 이상을 분리하는 방법.
- 백일해균 배양물을 균체와 배양액으로 분리한 후, 하기 공정(A), (B), (C), 및 (D)중 하나 이상을 실시하는 것을 특징으로 하는 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 백일해 독소(PT)로 구성된 군으로부터 1종 이상을 분리하는 방법 :(A)분리된 균체를 염 용액으로 용출하고, 용출된 상청액에 제1항에 인산칼슘 겔을 접촉시킴으로써 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)를 분리하는 공정,(B)상기 공정(A)의 용출 처리후 발생하는 균체 잔류물에 염 용액을 가하여 가온한 후, 제1항의 인산칼슘 겔을 접촉시킴으로써 수득되는 상청액에서 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 분리하는 공정,(C)상기 공정(A)의 용출 처리후 발생하는 균체 잔류물에 염 용액을 가하여 가온한 후, 그의 상청액에 제1항의 인산캄슘 겔을 접촉시키고, 염 용액으로 용출한 후의 상청액에서 백일해 선모(FIM)를 분리하는 공정,(D)배양물 또는 분리된 배양액을 제1항의 인산칼슘 겔에 접촉시킨 후, 그의 상청액에서 백일해 독소(PT)를 분리하는 공정.
- 제 2항에 있어서, 공정 (A) 에서, 상청액에 인산칼슘 겔을 접촉시킨 후, 염 용액으로 용출시켜 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)를 용출 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
- 제 2항에 있어서, 공정 (B) 에서, 인산칼슘 겔을 접촉시킨 후의 상청액을 이온 교환 겔과 접촉시켜 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)를 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
- 제 2항에 있어서, 공정 (C) 에서, 인산칼슘 겔과 접촉시킨 후, 상청액을 제거하고, 생성된 잔류물을 염용액으로 용출시켜 백일해 선모(FIM)를 용출 분리하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
- 제 2항에 있어서, 공정 (D) 에서, 상청액에 이온 교환 겔을 접촉시킨 후 백일해 독소 (PT)를 용출 분리취득하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
- 제2항에 있어서, 공정(A) 및 (C)에서 사용된 염용액이 알칼리금속염을 함유하는 완충액임을 특징으로 하는 분리방법.
- 제7항에 있어서, 염용액이 0.01-1.0M의 염화나트륨을 함유하는 완충액임을 특징으로 하는 분리방법.
- 제1항에 있어서, 인산칼슘 겔이 인산이온의 존재하에 pH 7-9의 배양물 또는 그의 상청액에 칼슘이온을 첨가함으로써 형성됨을 특징으로 하는 분리방법.
- 제9항에 있어서, 인산이온과 칼슘이온의 당량비가 칼슘이온 1량에 대해 인산이온이 1.25-30당량인 것을 특징으로 하는 분리방법.
- 제9항에 있어서, 인산칼슘 겔이 0.05-0.1M의 인산 완충액의 존재하에 칼슘이온원으로서 아세트산 칼슘 0.1-2w/v%를 첨가함으로써 생성됨을 특징으로 하는 분리방법.
- 제1항에 있어서, 백일해 독소 (PT) 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 로 구성된 균으로부터 1종 이상을 분리한 후, 황산암모늄의 존재하에 엔도록신을 수산화알루미늄 겔에 흡착시켜 제거함을 특징으로 하는 분리방법.
- 제1항에 있어서, 백일해 독소 (PT) 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 로 구성된 균으로부터 1종 이상을 분리한 후, 엔도톡신을 띠 원심분리에 의해 제거함을 특징으로 하는 분리방법.
- PT : FHA : FIM의 성분이 4~6 : 8~10 : 1의 조성비로 혼합됨을 특징으로 하는 백일해 백신.
- PT : FHA : PRN : FIM의 성분이 2~6 : 4~10 : 1~2 :1 의 조성비로 혼합됨을 특징으로 하는 백일해 백신.
- 제 2항에 있어서, 인산칼슘 겔을 인산이온의 존재하에 pH 7-9의 배양물 또는 그이 상청액에 칼슘이온을 첨가함으로써 형성됨을 특징으로 하는 분리 방법.
- 제2항에 있어서, 백일해 독소 (PT) 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 로 구성된 군으로부터 1종 이상을 분리한 후, 황산암모늄의 존재하에 엔도록신을 수산화알루미늄 겔에 흡착시켜 제거함을 특징으로 하는 분리방법.
- 제2항에 있어서, 백일해 독소 (PT) 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 로 구성된 군으로부터 1종 이상을 분리한 후, 엔도록신을 띠 원심분리에 의해 제거함을 특징으로 하는 분리방법.
- 백일해균 배양물을 균체와 배양액으로 분리한 후, 하기 공정(A), (B), (C), 및 (D)중 하나 이상을 실시하는 것을 특징으로 하는 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA), 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP), 백일해 선모(FIM) 및 백일해 독소(PT)로 구성된 군으로부터 1종 이상을 분리하는 방법 :(A)분리된 균체를 염 용액으로 용출하고, 칼슘이온 1당량 당 1.25~30 당량의 인산이온은 존재하의 pH 7-9의 상청액에, 칼슘이온을 컴가하여 생성시킨 인산칼슘 겔을 접촉시킴으로써 백일해 섬유상 적혈구 응집소(FHA)를 분리하는 공정,(B)상기 공정(A)의 용출 처리후 생기는 균체 잔류물에 염 용액을 가하여 가온한 후, 칼슘이온 1당량 당 1.25-30당량의 인산이온 존재하의 pH 7-9의 상청액에, 칼슘이온을 첨가하여 생성시킨 인산칼슘 겔을 접촉시킴으로써 수득되는 상청액에서 백일해 외막 단백(PRN, 69K-OMP)을 분리하는 공정,(C)상기 공정(A)의 용출 처리후 발생하는 균체 잔류물에 염 용액을 가하여 가온한 후, 칼슘이온 1당량 당 1.25-30당량의 인산이온 존재하의 pH 7-9의 상청액에, 칼슘이온을 첨가하여 생성시킨 인산캄슘 겔을 접촉시키고, 염 용액으로 용출한 후의 상청액에서 백일해 선모(FIM)를 분리하는 공정,(D)칼슘이온 1당량 당 1.25-30당량의 인산이온 존재하의 pH 7-9의 배양물 또는 분리배양액을, 칼슘이온을 첨가하여 생성시킨 인산칼슘 겔에 접촉시킨 후, 그의 상청액에서 백일해 독소(PT)를 분리하는 공정.
- PT : FHA : FIM 의 성분이 5 : 10 : 1 의 조성비로 혼합됨을 특징으로 하는 백일해 백신.
- PT : FHA : PRN : FIM 의 성분이 5 ~6 : 8~10 : 2 : 1 의 조성비로 혼합됨을 특징으로 하는 백일해 백신
- PT : FHA : PRN : FIM 의 성분이 5 : 10 : 2 : 1 의 조성비로 혼합됨을 특징으로 하는 백일해 백신
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