CN110358802B

CN110358802B - 一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法

Info

Publication number: CN110358802B
Application number: CN201910757403.3A
Authority: CN
Inventors: 王长永; 王梦舒; 徐艳艳; 梁洪野; 闫慧; 原秀娟
Original assignee: CHANGCHUN BCHT BIOTECHNOLOGY Co
Current assignee: CHANGCHUN BCHT BIOTECHNOLOGY Co
Priority date: 2019-08-16
Filing date: 2019-08-16
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2039-08-16
Also published as: CN110358802A

Abstract

本发明涉及生物制药技术领域，公开了一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法。本方法将百日咳杆菌发酵培养后，离心收集菌体，菌体用尿素磷酸盐缓冲液抽提；离心收集上清，使用PEG‑8000和硫酸铵分别进行沉淀；沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，采用Q‑Sepharose层析柱处理，使用含氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱出Fim2/3组分。本发明联合PEG8000沉淀、硫酸铵沉淀和Q‑Sepharose层析柱处理三个操作，通过多重手段去除菌毛蛋白Fim2/3中的内毒素，可以在不带入外源物质的前提下，保持有效成分Fim2/3生物活性和回收率，同时将Fim2/3中的内毒素去除至10EU/mg以下。

Description

一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法。

背景技术

百日咳杆菌为卵圆形短小杆菌，属鲍特氏菌属，革兰氏染色阴性。专性需氧，初次分离培养时营养要求较高，需要在包姜培养基上培养才能生长。培养后，可见细小、光滑、凸起、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环。与致病性有关的物质除荚膜、细胞壁脂多糖外，尚有多种生物学活性因子。百日咳外毒素是主要的致病因子，能诱发机体的持久免疫力，并有多种生物活性，如提高小鼠对组织胺、5～羟色胺的敏感性，促进白细胞增多，抑制巨噬细胞功能，损伤呼吸道纤毛上皮细胞导致阵发性痉挛咳嗽等。

国内无细胞百日咳疫苗的主要成分有PT、FHA。FIM2/3是百日咳杆菌的致病因子之一，研究证实FIM2/3在细菌感染过程中对宿主支气管细胞有粘附作用，目前世界上一些国家生产的无细胞百日咳疫苗中含有FIM2/3。

内毒素是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”。脂多糖，是热源的活性部分，含3个不同的化学区：包括内层的引起毒性反应的类脂A区、中层的核心寡糖区和外层的特异性多糖链区。内毒素相对分子质量从几千到几万不等，具有耐热性和化学稳定性，性质极不均一，很难找到一种高效且通用的内毒素去除方法，将其一次性彻底去除，有的甚至经过多个步骤处理后，仍然达不到要求。尤其在生物制品生产过程中，需要有严格的工艺控制，对内毒素进行限量控制。

百日咳杆菌的内毒素产生于百日咳杆菌的细胞外壁，是引起发热等疫苗副反应的主要物质，新的百日咳疫苗抗原纯化方法的改进使得内毒素的去除问题显现出来，百日咳组分生产中应尽量降低内毒素含量，以保证高质量的疫苗生产和使用。可以使用凝胶亲和等方法，来去除内毒素，实际使用时我们发现该方法虽然简易，只需在纯化过程中使用内毒素亲和胶，但是去除内毒素效果并不理想，而且容易引入亲和基团，影响疫苗的安全性。现有技术提供另一种FIM2/3的纯化方法（CN97197609.0），步骤相对繁琐，其包括前后两次超滤步骤及两次柱层析，分别为Sepharose CL6B及PEI硅胶柱，依据现有技术可知过多的纯化步骤可能造成更多目的蛋白损失。《欧洲药典》组分无细胞百日咳疫苗（aP）的内毒素要求为<100EU/剂，未来国内的质量标准对内毒素的要求也不能低于该规定。

因此，急需一种工艺稳定、成本低、去除效果好、收率高，易于扩大生产的去除组分百日咳中的内毒素方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3（Fimbrea2/3，Fim2/3）内毒素的方法，使得所述方法能够获得较高的Fim2/3回收率；

本发明的另外一个发明目的在于提供一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法，使得所述方法去除Fim2/3内毒素的效果更高。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法，包括：

步骤1、将百日咳杆菌发酵培养后，离心收集菌体；

步骤2、所述菌体用含尿素的磷酸盐缓冲液抽提；

步骤3、离心收集上清液，加入PEG-8000进行沉淀；沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，上清液再用硫酸铵进行沉淀；或

离心收集上清液，加入硫酸铵进行沉淀；沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，上清液再用PEG-8000进行沉淀；

步骤4、沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，获得Fim2/3粗提液；

步骤5、Fim2/3粗提液采用Q-Sepharose层析柱处理，使用含氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱出Fim2/3组分。

作为优选，所述步骤1为：

将百日咳杆菌菌种接种于包姜培养基培养，然后再传至活性碳琼脂培养基上培养，接着接种于百日咳液体综合培养基后，摇瓶培养，最后作为发酵罐种子进行发酵罐培养，收获的发酵液离心收集百日咳菌体。

在本发明具体实施方式中，所述步骤1为：

将百日咳杆菌菌种接种于包姜培养基，36℃培养3天后，传至活性碳琼脂培养基上，36℃培养40h后，接种于5L百日咳液体综合培养基（MSS）后，摇瓶培养20h，作为发酵罐种子，投入300L发酵罐（工作体积150L）培养，培养34h后收获。收获的发酵液使用连续流离心机分离上清液和百日咳菌体。

作为优选，步骤2为所述菌体用尿素磷酸盐缓冲液抽提，离心收集上清液，加热处理（沉淀蛋白及核酸），再离心收集上清液。其中，所述含尿素的磷酸盐缓冲液中尿素的浓度为2-6M，可具体选择为2M、4M或6M；所述抽提为在2-8℃下搅拌30min。

作为优选，步骤3所述PEG-8000在上清液中的浓度为3-5%w/v；在本发明具体实施方式中，PEG-8000在上清液中的浓度为3%、4%、4.5%、4.8%或5%。

作为优选，步骤3所述硫酸铵在上清液中的浓度为10-20%w/v；在本发明具体实施方式中，硫酸铵在上清液中的浓度为10%、15%或20%。

作为优选，所述磷酸盐缓冲液为pH7.0-7.5、0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液；在本发明具体实施方式中，所述磷酸盐缓冲液为0.01M、0.02M、0.025M、0.03M、0.04M或0.05M的磷酸盐缓冲液，所述pH值为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5；

作为优选，步骤5所述含氯化钠的磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为0.1-0.3M；在本发明具体实施方式中，所述氯化钠浓度为0.1M、0.2M、0.25M或0.3M。

根据本发明所记载的实验数据，使用PEG8000和硫酸铵均能够显著降低Fim2/3内毒素，配合使用Q-Sepharose层析柱，可将Fim2/3内毒素降至10EU/mg以下，同时方法还保证了Fim2/3有较高的回收率，避免目标蛋白在去除内毒素时出现较大损失；而使用其他同属阴离子交换介质的DEAE-Sepharose层析柱以及多模式交换介质的Capto adhere层析柱处理，无论内毒素含量还是Fim2/3回收率的技术效果均出现了极为显著的下降。

由以上技术方案可知，本发明联合PEG8000沉淀、硫酸铵沉淀以及Q-Sepharose层析柱处理三个主要操作，通过多重手段去除菌毛蛋白Fim2/3中的内毒素，可以在不带入外源物质的前提下，保持有效成分Fim2/3生物活性和回收率，同时将Fim2/3中的内毒素去除至10EU/mg以下。

附图说明

图1所示为本发明不同阶段的样品的SDS-PAGE图；其中，泳道1-4依次为尿素磷酸盐缓冲液抽提液、PEG-8000沉淀后样品、硫酸铵沉淀后样品、层析后样品；

图2所示为各实施例层析后的SDS-PAGE图；其中，1-4依次为实施例1-3和Marker。

具体实施方式

本发明公开了一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体对比试验中，各组除应有的区别外，其余材料等试验环境均保持一致。

在具体实施方式中，将收集的目的蛋白Fim2/3组分检测内毒素含量和蛋白含量，并按下式计算蛋白回收率：

蛋白回收率（%）=（收获纯化液蛋白浓度*收获体积）/（上样样品蛋白浓度*上样体积）*100%

内毒素含量的检测，按照《中国药典》三部（2015版）通则 1143 细菌内毒素检查法方法——凝胶法要求，采用凝胶限度试验法进行检测。细菌内毒素标准品及鲎试剂购自湛江安度斯生物有限公司，灵敏度 0.25EU/ml。

蛋白含量的检测，按照《中国药典》三部（2015版）通则 0731 蛋白质含量测定法第二法福林酚法（Lowry法）进行测定。

以下就本发明所提供的一种去除百日咳组分菌毛蛋白2/3内毒素的方法做进一步说明。

实施例1：本发明所述方法

1）开启1支百日咳杆菌菌种接种于包姜培养基，36℃培养3天后，传至活性碳琼脂培养基上，36℃培养40h后，接种于5L百日咳液体综合培养基（MSS）后，摇瓶培养20h，作为发酵罐种子，投入300L发酵罐（工作体积150L）培养，培养34h后收获。收获的发酵液使用连续流离心机分离上清液和百日咳菌体。

2）将步骤1中获得的百日咳菌体用含2M尿素的pH7.0、0.02M PBS缓冲液溶解后，于2~8℃搅拌30min。

3）离心(10000rpm、30min)，收集上清液后，80℃加热30min后，再离心(10000rpm、30min)，收集上清液。向澄清的上清中加入PEG8000至终浓度3%，轻轻搅拌溶解后，于2~8℃过夜。

4）离心(10000rpm、30min)收集沉淀，再用0.01M PBS（pH7.0）溶解沉淀，再离心（10000rpm、30min），收集上清液。向上清液加入10%的硫酸铵，边搅拌边加入，待完全溶解后，2~8℃过夜。

5）离心(10000rpm、30min)收集沉淀，再用0.01M PBS（pH7.0）溶解沉淀，再离心（10000rpm、30min），收集上清液，获得Fim2/3粗纯液。

6）将上步收集的Fim2/3粗纯液用Q-Sepharose层析柱进行除内毒素，经280nm紫外监测，先用0.01M PBS缓冲液冲洗，除内毒素，再用pH7.0、0.01M PBS +0.1M NaCl缓冲液洗脱，收获Fim2/3组分，SDS-PAGE图见图2；各阶段样品的SDS-PAGE图见图1。

实施例2：本发明所述方法

1）开启1支百日咳杆菌菌种接种于包姜培养基，36.5℃培养3天后，传至活性碳琼脂培养基上，36.5℃培养42h后，接种于5L百日咳液体综合培养基（MSS）后，摇瓶培养20~24h，作为发酵罐种子，投入300L发酵罐（工作体积150L）培养，培养35h后收获。收获的发酵液使用连续流离心机分离上清液和百日咳菌体。

2）将步骤1中获得的百日咳菌体用含4M尿素的pH7.2、0.02M PBS缓冲液溶解后，于2~8℃搅拌30min。

3）离心(10000rpm、30min)，收集上清液后，80℃加热30min后，再离心(10000rpm、30min)，收集上清液。向澄清的上清中加入PEG8000至终浓度4%，轻轻搅拌溶解后，于2~8℃过夜。

4）离心(10000rpm、30min)，收集沉淀，再用0.03M PBS（pH7.2）溶解沉淀，再离心（10000rpm、30min），收集上清液。向上清液加入15%的硫酸铵，边搅拌边加入，待完全溶解后，2~8℃过夜。

5）离心(10000rpm、30min)收集沉淀，再用0.03M PBS（pH7.2）溶解沉淀，再离心（10000rpm、30min），收集上清液，获得Fim2/3粗纯液。

6）将上步收集的Fim2/3粗纯液用Q-Sepharose层析柱进行除内毒素，经280nm紫外监测，先用0.02M PBS缓冲液冲洗，除内毒素，再用pH7.2、 0.02M PBS+0.2M NaCl缓冲液洗脱，收获Fim2/3组分，SDS-PAGE图见图2；各阶段样品的SDS-PAGE图同图1。

实施例3：本发明所述方法

1）开启1支百日咳杆菌菌种接种于包姜培养基，37℃培养3天后，传至活性碳琼脂培养基上37℃培养43h后，接种于5L百日咳液体综合培养基（MSS）后，摇瓶培养23h，作为发酵罐种子，投入300L发酵罐（工作体积150L）培养，培养35h后收获。收获的发酵液使用连续流离心机分离上清液和百日咳菌体。

2）将步骤1中获得的百日咳菌体用含6M尿素的pH7.4、0.02M PBS缓冲液溶解后，于2~8℃搅拌30min。

3）离心(10000rpm、30min )，收集上清液后，80℃加热30min后，再离心(10000rpm、30min)，收集上清液。向澄清的上清中加入PEG8000至终浓度5.0%，轻轻搅拌溶解后，于2~8℃过夜。

4）于次日离心(10000rpm、30min)，收集沉淀，再用0.05M PBS（pH7.5）溶解沉淀，再离心（10000rpm、30min），收集上清液。向上清液加入20%的硫酸铵，边搅拌边加入，待完全溶解后，2~8℃过夜。

5）离心(10000rpm、30min)收集沉淀，再用0.05M PBS（pH7.5）溶解沉淀，再离心（10000rpm、30min），收集上清液，获得Fim2/3粗纯液。

6）将上步收集的Fim2/3粗纯液用Q-Sepharose层析柱进行除内毒素，经280nm紫外监测，先用0.025M PBS缓冲液冲洗，除内毒素，再用pH7.4、0.025M PBS+ 0.3M NaCl缓冲液洗脱，收获Fim2/3组分，SDS-PAGE图见图2；各阶段样品的SDS-PAGE图同图1。

实施例4：蛋白回收率和内毒素含量检测

1、使用PEG和硫酸铵沉淀Fim2/3溶液内毒素的变化

各实施例在使用PEG和硫酸铵沉淀Fim2/3溶液内毒素后的检测结果，见表1；

表1

根据表1结果可以看出，无论使用PEG8000沉淀还是硫酸钠沉淀，两者均能够显著降低目标蛋白内毒素的含量。

2、Fim2/3组分使用Q-Sepharose去除内毒素和回收率结果

在表1硫酸铵沉淀后的基础上，各实施例采用Q-Sepharose去除内毒素后的检测结果，见表2；

表2

由表2可以看出，本发明方法不仅保证了90%以上的目标蛋白回收率，而且将内毒素含量降低至10EU/mg以下，相比现有技术效果更加优异。

3、考察不同聚合度PEG对沉淀Fim2/3的影响

参照实施例1的过程，将步骤3中上清液分成等体积的3份，每份中加入不同的PEG4000、PEG6000、PEG8000至终浓度为4.5%，考察不同PEG对沉淀Fim2/3的影响，回收率检测结果如下表3：

表3

由表3可以看出，根据不同PEG的沉淀结果的回收率，PEG8000的效果最好，确定分子量为8000的PEG为沉淀剂。

4、考察不同层析介质对Fim2/3去除内毒素的影响

参照实施例2过程，将步骤6中的Fim2/3粗纯液分成等体积的3份，分别使用DEAE-Sepharose、Capto adhere、Q-Sepharose去除Fim2/3粗纯液中的内毒素，内毒素检测结果如下表4：

表4

由表4可以看出，根据以上内毒素和回收率的检测结果，选择Q-Sepharose层析柱可以保证目标蛋白回收率在90%以上，同时还能够降低内毒素至10EU/mg以下。

Capto adhere作为多模式交换介质回收率低于50%，内毒素介于100-200EU/mg之间，同样为阴离子交换介质的DEAE-Sepharose层析后的结果同样不甚理想，回收率在85%左右，内毒素含量较高介于250-500 EU/mg之间。

综上，使用PEG8000沉淀、硫酸铵沉淀以及Q-Sepharose层析柱将实施例1至3各样品中目的蛋白Fim2/3的内毒素值降至10EU/mg以下。而且在目前优化的条件下Fim2/3目的蛋白回收率可达90%以上。与同类去除百日咳组分Fim2/3内毒素相比，该方法具有去除效果过好、回收率高的优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种去除Fim2/3内毒素的方法，其特征在于，包括：

步骤1、将百日咳杆菌发酵培养后，离心收集菌体；

步骤2、所述菌体用含尿素的磷酸盐缓冲液抽提，离心收集上清液；

步骤3、步骤2上清液加入PEG-8000进行沉淀；沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，上清液再用硫酸铵进行沉淀；或

步骤2上清液加入硫酸铵进行沉淀；沉淀使用磷酸盐缓冲液抽提，然后离心收集上清液，上清液再用PEG-8000进行沉淀；

所述PEG-8000在上清液中的浓度为3-5%W/V，所述硫酸铵在上清液中的浓度为10-20%W/V；

步骤5、Fim2/3粗提液采用Q-Sepharose层析柱处理，使用PBS冲洗，除内毒素，使用含氯化钠的磷酸盐缓冲液洗脱出Fim2/3组分。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1为：

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤2为所述菌体用尿素磷酸盐缓冲液抽提，离心收集上清液，加热处理，再离心收集上清液。

4.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述含尿素的磷酸盐缓冲液中尿素的浓度为2-6M。

5.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述抽提为在2-8℃下搅拌。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为pH7.0-7.5、0.01-0.05M的磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤5所述含氯化钠的磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为0.1-0.3M。