CN113881619A - 一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，属于基因工程和合成生物学领域。本发明敲除了大肠杆菌MG1655基因组上O‑抗原基因簇wbbL‑galF，核心糖基因簇rfaD‑waaQ，肠共同抗原基因簇rfe‑rffM，克拉酸基因簇wcaM‑wza和转录结合因子metJ基因，并过表达百日咳CS菌株核心糖，百日咳CS菌株三糖和控制三糖单元长度基因簇，得到重组菌MDCO020/pWpBpD5。在相同发酵条件下，MDCO020/pWpBpD5菌株合成细胞干重是CS菌株的1.63倍；MDCO020/pWpBpD5菌株寡糖抗原的产量是CS菌株的2倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种能合成百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，属于基因工程和合成生物学领域。
背景技术
百日咳杆菌脂寡糖(LOS)由类脂A与十二个单糖构成的寡糖连接而成，远端具有独特的三糖结构单元，包括两种罕见糖2,3-乙酰氨基-2,3-双脱氧-甘露糖醛酸和2-乙酰氨基-4-N-甲基-2,4-双脱氧-岩藻糖。各种百日咳杆菌菌株LOS结构高度保守，在疫苗接种前后的临床分离株中LOS末端三糖结构单元也没有改变，说明LOS末端三糖结构单元是广谱抗百日咳疫苗的理想成分。百日咳患者血清中含有各种抗百日咳杆菌抗体，但只有针对LOS的抗体有杀菌抗体的靶点。LOS末端三糖结构单元是杀菌抗体的靶标位点，能有效地固定补体，与杀菌活性相关性最好。它可以与抗LOS单克隆抗体结合，作为疫苗的一个合适表位靶点。
然而，用百日咳杆菌制备这个新型抗原存在瓶颈问题。首先，百日咳杆菌天然合成的脂寡糖只含有单个末端三糖单元；其次，百日咳杆菌为致病菌，存在安全生产隐患。百日咳杆菌细胞中糖酵解途径和TCA循环存在缺陷，造成其生长缓慢。因此，提供一种简单有效的制备百日咳杆菌寡糖抗原是有迫切需求的。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明在大肠杆菌中敲除基因组上四个与LPS相关的基因簇wbbL-galF，rfaD-waaQ，rfe-rffM和wcaM-wza和结合转录抑制因子基因metJ得到LPS精简菌株MDCO020。随后将携带百日咳杆菌核心糖基因簇的质粒pW，携带有百日咳杆菌三糖单元基因簇的质粒pB和能增加三糖重复单位基因簇的质粒pD5转化到LPS精简菌株MDCO020中，得到重组菌MDCO020/pWpBpD5。通过SDS-PAGE和核磁共振分析(1HNMR)确定了MDCO020/pWpBpD5菌株的LPS结构为在大肠杆菌自身Kdo2-lipidA的结构上加入百日咳杆菌CS菌株的核心寡糖组分以及多个末端三糖单元组分。在相同发酵条件下，MDCO020/pWpBpD5菌株合成细胞干重是CS菌株的1.63倍；MDCO020/pWpBpD5菌株LPS产量是CS菌株的2倍。
本发明的第一个目的是提供一种生产百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的O-抗原基因簇，核心糖基因簇，肠共同抗原基因簇，克拉酸基因簇和结合转录抑制因子基因，并过表达了百日咳杆菌来源的核心糖基因簇和末端三糖基因簇以及铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇。
在一种实施方式中，所述O-抗原基因簇为wbbL-galF。
在一种实施方式中，所述O-抗原基因簇wbbL-galF包含12个基因，分别为wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416534.1"、"NP_416536.1"、"NP_416537.1"、"NP_416538.1"、"NP_416539.1"、"NP_416540.1"、"NP_416541.1"、"NP_416542.1"、"NP_416543.1"、"NP_416544.1"、"NP_416545.1"、"NP_416546.1"。
在一种实施方式中，所述核心糖基因簇为rfaD-waaQ。
在一种实施方式中，所述核心糖基因簇rfaD-waaQ包含14个基因，分别为rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418076.1"、"NP_418077.1"、"NP_418078.1"、"NP_418079.1"、"NP_418080.1"、"NP_418081.1"、"NP_418082.1"、"NP_418083.1"、"NP_418084.1"、"NP_418085.1"、"NP_418086.1"、"NP_418087.1"、"NP_418088.1"、"NP_418089.1"。
在一种实施方式中，所述肠共同抗原基因簇为rfe-rffM。
在一种实施方式中，所述肠共同抗原基因簇rfe-rffM包含12个基因，分别为rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418231.1"、"NP_418232.1"、"YP_026253.1"、"YP_026254.1"、"YP_026255.1"、"NP_418236.1"、"YP_026256.1"、"NP_418238.1"、"NP_418239.1"、"YP_026257.1"、"NP_418241.1"、"NP_418242.1"。
在一种实施方式中，所述克拉酸基因簇为wcaM-wza。
在一种实施方式中，所述克拉酸基因簇wcaM-wza包含20个基因，分别为wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416566.1"、"NP_416565.1"、"NP_416564.1"、"NP_416563.1"、"NP_416562.1"、"NP_416561.1"、"NP_416560.1"、"NP_416559.1"、"NP_416558.1"、"NP_416557.1"、"NP_416556.1"、"NP_416555.1"、"NP_416554.1"、"NP_416553.1"、"NP_416552.1"、"NP_416551.1"、"NP_416550.1"、"NP_416549.1"、"NP_416548.1"、"NP_416547.1"。
在一种实施方式中，所述结合转录抑制因子基因metJ的序列的NCBI上登录号为NP_418373.1。
在一种实施方式中，所述百日咳核心糖基因簇包含基因的序列的NCBI登录号分别为"BPTD_RS11720"、"BPTD_RS11725"、"BPTD_RS11730"、"BPTD_RS11735"、"BPTD_RS11740"、"BPTD_RS11745"、"BPTD_RS11750"、"BPTD_RS11755"、"BPTD_RS11760"、"BPTD_RS11765"、"BPTD_RS11770"、"BPTD_RS11775"。
在一种实施方式中，所述百日咳末端三糖基因簇包含基因的序列的NCBI登录号分别为"BPTD_RS00420"、"BPTD_RS00425"、"BPTD_RS00430"、"BPTD_RS00435"、"BPTD_RS00440"、"BPTD_RS00445"、"BPTD_RS00450"、"BPTD_RS00455"、"BPTD_RS00460"、"BPTD_RS00465"、"BPTD_RS00470"、"BPTD_RS00475"。
在一种实施方式中，所述铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇包含wzz、wzy和wzx，其序列的NCBI登录号分别为NP_251850.1、NP_251844.1和NP_251843.1。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655。
本发明的第二个目的提供一种构建上述重组大肠杆菌的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上的O-抗原基因簇，核心糖基因簇，肠共同抗原基因簇，克拉酸基因簇和结合转录抑制因子基因，并将百日咳杆菌来源的核心糖基因簇和末端三糖基因簇以及铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇分别或共同连接在质粒上。
在一种实施方式中，百日咳杆菌来源的核心糖基因簇连接在表达质粒pWSK29上，末端三糖基因簇连接在表达质粒pBAD33上，铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇连接在表达质粒pDXW-8上。
本发明的第三个目的是提供一种新型百日咳寡糖抗原，所述新型百日咳寡糖抗原为百日咳脂寡糖的超十糖衍生物。
本发明的第四个目的是提供一种生产百日咳寡糖抗原的方法，所述方法为将上述重组大肠杆菌接种于发酵培养基中，进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵培养基含有4～6g/L酵母粉，8～12g/L蛋白胨，8～12g/LNaCl。
在一种实施方式中，所述发酵的反应条件为温度25～30℃，180～220rpm。
本发明的第五个目的是提供百日咳寡糖抗原或上述方法制备的百日咳寡糖抗原在筛选和/或制备抗百日咳药物中的应用。
在一种实施方式中，所述药物包括但不限于化合物抑制剂、小蛋白抑制剂、单克隆抗体。
本发明还提供上述重组大肠杆菌、百日咳寡糖抗原和上述方法在生物医药领域中的应用。
本发明还提供上述重组大肠杆菌、百日咳寡糖抗原和上述方法在制备预防或治疗百日咳的药物中的应用。
有益效果：
(1)本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上四个与LPS相关的基因簇以及一个结合转录抑制因子基因metJ得到LPS精简菌株MDCO020(图1)。精简菌株MDCO020生长状态良好，其LPS结构为Kdo2-lipidA，是LPS最简结构。
(2)将携带百日咳杆菌核心糖基因簇的质粒pW，携带有百日咳杆菌三糖单元基因簇的质粒pB和能增加三糖重复单位基因簇的质粒pD5转化到LPS精简菌株MDCO020中，得到重组菌MDCO020/pWpBpD5。通过SDS-PAGE与核磁共振分析(1H NMR)确定了MDCO020/pWpBpD5菌株的LPS结构为在大肠杆菌自身Kdo2-lipidA的结构上加入百日咳杆菌CS菌株的核心寡糖组分以及多个末端三糖单元组分。
(3)在相同发酵条件下，本发明构建的重组大肠杆菌MDCO020/pWpBpD5菌株合成细胞干重是百日咳杆菌CS菌株的1.63倍；MDCO020/pWpBpD5菌株LPS产量是CS菌株的2倍，即MDCO020/pWpBpD5菌株寡糖抗原产量是CS菌株的2倍。
(4)本发明构建的重组大肠杆菌MDCO020/pWpBpD5菌株发酵生产的百日咳寡糖具有与百日咳杆菌CS菌株的LOS相似的免疫活性。
附图说明
图1：敲除流程图；X为目的基因簇wbbL-galF、rfaD-waaQ、rfe-rffM、wcaM-wza和metJ。
图2：LPS精简菌株MDCO020的构建；a：基因簇wbbL-galF和rfaD-waaQ的敲除；b：基因簇rfe-rffM和wcaM-wza的敲除；c：metJ基因的敲除。
图3：表达质粒的构建；a：表达百日咳杆菌CS菌株核心糖基因簇质粒pW的构建；b：表达百日咳杆菌CS菌株末端三糖基因簇质粒pB的构建；c：表达铜绿假单胞菌PAO1增加三糖重复单位基因簇质粒pD5的构建。
图4：各菌株SDS-PAGE图；a：wbbL-galF基因簇和rfaD-waaQ基因簇敲除验证；b：wza-wcaM基因簇敲除验证；c：rfe-rffM基因簇敲除验证；d：metJ基因簇敲除验证：。
图5：表达质粒验证；a：质粒pW验证；b：质粒pB验证；c：质粒pD5验证。
图6：核磁共振分析MDCO020/pWpBpD5菌株LPS结构中寡糖抗原结构；a：CS菌株与MDCO020/pWpBpD5菌株LPS结构对比；b：菌株MDCO020/pWpBpD5的LPS结构。
图7：免疫双扩散验证MDCO020/pWpBpD5菌株LPS结构中寡糖抗原免疫性能。
图8：CS菌株与MDCO020/pWpBpD5菌株生物量以及LPS产量的对比CS菌株与MDCO020/pWpBpD5菌株生物量和LPS产量比较。
图9：免疫双扩散实验检测抗原免疫性能。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
下述实施例中涉及的方法：
15L发酵罐发酵培养方法：
将菌株涂布于LBACK平皿，28℃培养12～18h后，挑取单菌落于5mL的LBACK液体培养基28℃震荡培养至OD600为1.5，接入500mL的LBACK液体培养基，28℃震荡培养至OD600为3.5。将500mL培养液接入15L LBACK液体培养基中，培养时加入1mM的IPTG和15mM的L-阿拉伯糖，28℃条件下通气培养18h，离心收获菌体。
琼脂扩散实验：将1.0g琼脂糖溶解在100mLPBS(pH 7.4)中。将约3mm厚的琼脂糖倒在干净的平板上。待琼脂糖凝胶冷却后，在琼脂糖凝胶上打出直径3～5mm的小孔。中间通道加入免疫血清，外周通道加入待测样品。将板置于湿箱中并在4℃下放置24小时。然后，在散射光下观察该板。为了最大程度地观察沉淀线，染色液(0.5％(w/v)考马斯亮蓝R-250、40％(v/v)乙醇、10％(v/v)冰醋酸、用50％H2O)对凝胶染色，然后用脱色液(15％(v/v)乙醇、5％(v/v)冰醋酸、80％H2O)洗脱。这一步可以将实验的灵敏度提高10倍。
下述实施例中涉及的培养基如下：
培养基均使用ddH2O配制，配制完成后121℃灭菌15～20min。
LB培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。
LBA培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，Amp 0.05。
LBAC培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，Amp 0.05，Cm 0.025。
LBACK培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，Amp 0.05，Cm 0.025，Kan 0.03。
MSS培养基(g/L)：L-谷氨酸钠10.7，脯氨酸0.24，NaCl 2.5，KCl 0.2，KH2PO4 0.5，MgCl2·6H2O 0.01，CaCl2 0.02，Tris base 6.1，酪素10，2,6-二甲基-β-环糊精1.0.培养基中根据质粒上携带的抗性基因选择添加相应的抗生素。
表1下述实施例涉及的引物序列
表2下述实施例中涉及的菌株和质粒
实施例1敲除质粒的构建
采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除大肠杆菌中与LPS相关的四个基因簇和一个结合转录抑制因子基因metJ，需要构建5个敲除质粒：pTargetF-wbbL-galF、pTargetF-rfaD-waaQ、pTar getF-wza-wcaM、pTargetF-rfe-rffM、pTargetF-metJ，这些质粒的构建过程具体为：
(1)选取20nt与目的基因靶序列互补的N20序列，具体N20序列分别为引物pTargetF-wbbL-galF-F、pTargetF-rfaD-waaQ-F、pTargetF-wza-wcaM-F、pTargetF-rfe-rffM-F、pTargetF-metJ-F的下划线序列，将这些序列修饰到质粒pTargetF正向引物的5’端，分别得到正向引物pTargetF-wbbL-galF-F、pTargetF-rfaD-waaQ-F、pTargetF-wza-wcaM-F、pTargetF-rfe-rffM-F、pTargetF-metJ-F。
以质粒pTargetF为模板，正向引物pTargetF-wbbL-galF-F、pTargetF-rfaD-waaQ-F、pTargetF-wza-wcaM-F、pTargetF-rfe-rffM-F、pTargetF-metJ-F分别同反向引物pTargetF-R进行PCR扩增出引入了N20序列的开环质粒。将PCR扩增产物进行电泳验证并纯化回收。
(2)由于回收产物中可能含有模板质粒pTargetF，会影响后续实验，因此向回收产物中加入DpnⅠ，在37℃反应2h，对模板质粒进行消化。
(3)使用T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)对消化模板质粒后的回收产物进行磷酸化，37℃反应30min，然后65℃热失活10min。
(4)向磷酸化后的反应体系中加入1μLT4 DNA连接酶，于22℃反应4h，获得连接液。反应结束后，取出大肠杆菌JM109感受态细胞于冰上融化，将连接液加入感受态细胞中并轻轻吹吸混匀，冰浴30min。然后将感受态细胞于42℃水浴中热激90s，冰浴2min，迅速加入1mLLB培养基。37℃，100rpm复苏1h，然后涂布在添加50mg/L的奇霉素(Spe)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子。以pTargetF为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证敲除质粒是否成功构建。将正确的转化子接至添加奇霉素(Spe)的LB液体试管中，提取质粒得到敲除质粒pTargetF-gene(pTargetF-wbbL-galF、pTargetF-rfaD-waaQ、pTargetF-wza-wcaM、pTargetF-rfe-rffM、pTargetF-metJ)。
实施例2 LPS精简菌株MDCO020的构建
采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除野生型大肠杆菌MG1655与LPS相关的四个基因簇和metJ基因，获得LPS精简菌株MDCO020。具体敲除流程如下(图2)：
(1)大肠杆菌电转敲除感受态细胞MG1655/pCas的制备
将质粒pCas转化到大肠杆菌MG1655中，得到含有pCas质粒的重组大肠杆菌MG1655/pCas，将大肠杆菌MG1655/pCas在添加30mg/L卡那霉素(Kan)的LB固体平板上活化，接种到LB(Kan+)试管过夜培养得到种子液；将种子液按1％(v/v)转接至25mL LB(Kan+)培养基中，于30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.2，加入500μL L-阿拉伯糖溶液诱导，继续培养至OD600＝0.5，冰浴30min；4℃，4000rpm离心10min收集菌体，用预冷的10％甘油溶液洗涤菌体三次；加入300μL 10％甘油溶液重悬菌体，分装到无菌的1.5mL EP管中，80μL/管。
(2)同源臂敲除片段的构建
提取大肠杆菌MG1655的基因组，以基因组为模板，用敲除目的基因簇wbbL-galF的同源臂引物wbbL-galF-U-F/wbbL-galF-U-R和wbbL-galF-D-F/wbbL-galF-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对wbbL-galF-U-F/wbbL-galF-D-R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段；用敲除目的基因簇rfaD-waaQ的同源臂引物rfaD-waaQ-U-F/rfaD-waaQ-U-R，rfaD-waaQ-D-F/rfaD-waaQ-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对rfaD-waaQ-U-F/rfaD-waaQ-D-R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段；用敲除目的基因簇wza-wcaM的同源臂引物wza-wcaM-U-F/wza-wcaM-U-R，wza-wcaM-D-F/wza-wcaM-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对wza-wcaM-U-F/wza-wcaM-D-R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段；用敲除目的基因簇rfe-rffM的同源臂引物rfe-rffM-U-F/rfe-rffM-U-R，rfe-rffM-D-F/rfe-rffM-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对rfe-rffM-U-F/rfe-rffM-D-R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段；用敲除目的基因簇metJ的同源臂引物metJ-U-F/metJ-U-R，metJ-D-F/metJ-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂，胶回收，并用引物对metJ-U-F/metJ-D-R进行重叠PCR，得到同源臂敲除片段。
(3)基因的电转敲除
用无水乙醇洗涤电击杯三次并吹干，预冷20min。将步骤(1)的大肠杆菌MG1655/pCas感受态细胞置于冰上融化，加入实施例1中的100ng敲除质粒和步骤(2)中的500ng相应的同源臂敲除片段，轻轻吹吸混匀，吸至电击杯的槽中。将电击杯冰浴10min，擦干后电击。然后迅速向电击杯中加入1mL LB培养基，吸出全部菌液至1.5mL EP管中，30℃，100rpm复苏1.5h，在含有30mg/L的Kan和50mg/L Spe的LB平板涂布，并在30℃培养箱中倒置培养。以MG1655为阴性对照，用上游同源臂的正向引物和下游同源臂的反向引物对转化子进行菌落PCR验证。
结果表明：如图4a所示，泳道1为野生型MG1655对照条带，泳道2为wbbL-galF基因簇敲除转化子的条带大小，对比泳道1和泳道2表明wbbL-galF基因簇敲除成功；泳道3为野生型MG1655对照条带，泳道4为rfaD-waaQ基因簇敲除转化子的条带大小，对比泳道3和泳道4表明rfaD-waaQ基因簇敲除成功。如图4b所示，泳道1为野生型MG1655对照条带，泳道2为wza-wcaM基因簇敲除转化子的条带大小，对比泳道1和泳道2表明wza-wcaM基因簇敲除成功；如图4c所示，泳道1为野生型MG1655对照条带，泳道2为rfe-rffM基因簇敲除转化子的条带大小，对比泳道1和泳道2表明rfe-rffM基因簇敲除成功；如图4d所示，泳道1为野生型MG1655对照条带，泳道2为metJ基因簇敲除转化子的条带大小，对比泳道1和泳道2表明metJ基因簇敲除成功。
(4)敲除质粒pTargetF-gene和温敏质粒pCas的去除
将步骤(3)中正确的敲除转化子接至添加30mg/L的Kan和1mM的IPTG的LB试管中，通过IPTG诱导去除敲除质粒pTargetF-gene的酶表达，30℃振荡培养12h，在LB(Kan+)平板上划线分离单菌落。筛选出对壮观霉素敏感的单菌落，即得到去除pTargetF-gene敲除质粒的突变菌株，接至LB(Kan+)试管保种，可直接制备感受态进行连续敲除。将去除敲除质粒的突变菌株接至LB试管，42℃振荡培养，在LB平板上划线分离单菌落。筛选出对卡那霉素敏感的单菌落，即得到去除pCas的无抗突变菌株，接至LB试管保种。
采用CRISP/Cas9的敲除方法成功将四个与LPS相关的基因簇wbbL-galF(包含wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF共12个基因)，rfaD-waaQ(包含rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ共14个基因)，wza-wcaM(包含wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因。)，rfe-rffM(包含rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM共12个基因)和metJ基因从大肠杆菌MG1655的基因组上依次敲除，获得了LPS精简菌株MDCO020。
实施例3表达质粒pW、pB和pD5的构建
(1)百日咳杆菌CS菌株与铜绿假单胞菌PAO1基因组的提取
百日咳杆菌CS菌株与铜绿假单胞菌PAO1基因组的提取不需要溶菌酶的裂解，具体操作分别按照细菌基因组DNA提取试剂盒与质粒DNA提取试剂盒的产品说明步骤完成；提取的基因组DNA通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)质粒pW的构建：
第一步，以百日咳杆菌CS菌株基因组为模板，利用引物U-(BPTD_RS00475)-F和D-(BPTD_RS00475)-R PCR扩增一段1008bp的基因片段，并进行电泳验证及纯化回收；分别用SacI内切酶对载体pWSK29进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物回收并进行电泳验证；将回收后的酶切产物和基因片段混合参照一步克隆试剂盒使用说明书在37℃下反应30min，获得反应液；反应结束后，取出大肠杆菌JM109感受态细胞于冰上融化，将反应液加入感受态中并轻轻吹吸混匀，冰浴30min；然后将感受态于42℃水浴中热激90s，冰浴2min，迅速加入1mL LB培养基；37℃，100rpm复苏1h，然后涂布在添加50mg/L的氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pWSK29为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加氨苄青霉素(Amp)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pWSK29-BPTD_RS00475。
第二步，以百日咳杆菌CS菌株基因组为模板，利用引物U-(CScore)-F和D-(CScore)-RPCR扩增一段15.14kb的基因片段，并进行电泳验证及纯化回收；利用HindIII和KpnI内切酶对质粒pWSK29-BPTD_RS00475进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物分别回收并进行电泳验证；将回收后的酶切产物和基因片段混合参照一步克隆试剂盒使用说明书在37℃下反应30min，获得反应液；将反应液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在添加50mg/L的氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pWSK29-BPTD_00475为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加氨苄青霉素(Amp)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pW(图3a)。
(3)质粒pB的构建：
以百日咳杆菌CS菌株基因组为模板，利用引物U-(CStrisaccharide)-F和D-(CStrisaccharide)-R PCR扩增一段12.24kb的基因片段，并进行电泳验证及纯化回收；利用XbaI内切酶对pBAD33进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物分别回收并进行电泳验证；将回收后的酶切产物和基因片段混合参照一步克隆试剂盒使用说明书在37℃下反应30min，获得反应液；将反应液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在添加30mg/L的氯霉素(Cm)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pBAD33为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加氯霉素(Cm)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pB(图3b)。
(4)质粒pD5的构建：
第一步，以铜绿假单胞菌PAO1菌株基因组为模板，利用引物U-(Pwzz-wzz)-F和D-(wzz)-RPCR扩增出Pwzz-wzz片段，并进行电泳验证及纯化回收；分别用EcoRI和XhoI内切酶对pDXW-8质粒与Pwzz-wzz片段进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物分别回收并进行电泳验证；随后将回收产物混合并加入1μL T4 DNA连接酶，于22℃反应4h，获得反应液；将反应液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在添加30mg/L的卡那霉素(Kan)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pDXW-8为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加卡那霉素(Kan)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pDXW-8-Pwzz-wzz；
第二步，以铜绿假单胞菌PAO1菌株基因组为模板，利用引物U-(wzy-wzx)-F和D-(wzy-wzx)-R PCR扩增出wzy-wzx片段，将PCR扩增产物进行电泳验证及纯化回收；分别用kpnI和HindIII内切酶对pDXW-8-Pwzz-wzz质粒与wzy-wzx片段进行酶切反应，反应温度为37℃，时间30min，随后将酶切产物分别回收并进行电泳验证；随后将回收产物混合并加入1μLT4 DNA连接酶，于22℃反应4h，获得反应液；将反应液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在添加30mg/L的卡那霉素(Kan)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子；以pDXW-8为阴性对照，对转化子进行菌落PCR，验证质粒是否成功构建；将正确的转化子接至添加卡那霉素(Kan)的LB液体试管中，提取质粒得到质粒pD5(图3c)。
实施例4重组菌株MDCO020/pWpBpD5的构建
(1)大肠杆菌MDCO020感受态细胞的制备
接种实施例2中的大肠杆菌MDCO020于LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，将种子液按2％(v/v)接种量转接到50mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养至OD600＝0.4-0.6，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl2洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl2悬浮，加入1mL 30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。
(2)转化1
将100-200ng的实施例3中的质粒pW加入步骤(1)制备的大肠杆菌MDCO020感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2～3min，加入1mL LB培养基复苏，37℃孵育2h，涂布50μg/mL氨苄霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养种子液。得到重组菌株MDCO020/pW。
(3)大肠杆菌MDCO020/pW感受态细胞的制备
接种大肠杆菌MDCO020/pW于LBA液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，将种子液按2％(v/v)接种量转接到50mL LBA液体培养基，37℃，200rpm培养至OD600＝0.4-0.6，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl2洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl2悬浮，加入1mL 30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。
(4)转化2
将100-200ng的实施例3中的质粒pB加入大肠杆菌MDCO020/pW感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2～3min，加入1mL LBA培养基复苏，37℃孵育2h，涂布50μg/mL氨苄霉素和30μg/mL氯霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子于含50μg/mL氨苄青霉素和30μg/L氯霉素的LB液体培养基中培养种子液。得到重组菌株MDCO020/pWpB。
(5)大肠杆菌MDCO020/pWpB感受态细胞的制备
接种大肠杆菌MDCO020/pWpB于LBAC液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，将种子液按2％(v/v)接种量转接到50mL LBAC液体培养基，37℃，200rpm培养至OD600＝0.4-0.6，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl2洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl2悬浮，加入1mL 30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。
(6)转化3
将100-200ng的实施例3中的质粒pD5加入大肠杆菌MDCO020/pWpB感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2～3min，加入1mL LBAC培养基复苏，37℃孵育2h，涂布50μg/mL氨苄霉素、30μg/mL氯霉素和30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子于含50μg/mL氨苄青霉素、30μg/mL氯霉素和30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养种子液。得到重组菌株MDCO020/pWpBpD5。
结果表明：如图5a所示，泳道1为质粒pWSK29对照条带，泳道2为质粒pW的条带大小，对比泳道1和泳道2表明pW构建成功；如图5b所示，泳道1为质粒pBAD33对照条带，泳道2为质粒pB的条带大小，对比泳道1和泳道2表明pB构建成功；如图5c所示，泳道1为质粒pDXW-8对照条带，泳道2为质粒pD5的条带大小，对比泳道1和泳道2表明pD5构建成功。
实施例5菌株LOS的提取与验证
(1)LOS提取纯化方法：将菌株以初始OD600为0.02接种至500mL LB培养基中，37℃培养18h后，离心20min，倒掉上清，收集菌体沉淀。向菌体沉淀中加入20mL水充分悬浮，再加入20mL 68℃预热的90％苯酚，在68℃恒温水浴锅中震荡1h。震荡后冷却至室温，离心20min分相，吸取上相至离心管中，4℃静置12h后，将上清液转移至透析袋中，透析24h。真空冻干得LOS粗样。向LOS粗样中加入9mL水，1mL反应缓冲液(100mM Tris-HCl，25mM MgCl2，1mMCaCl2，pH 7.5)，适量DNase I和RNase A，37℃静置4h(精密天平称量LOS粗样，1mg脂多糖加入1μg酶)。向反应后的溶液中再加入适量的蛋白酶K，37℃静置12h(1mg脂多糖加入1μg酶)。为去除残余的蛋白质，向离心管中加入5mL水饱和苯酚，混合均匀。离心30min分相，吸取上相至透析袋中，在水中透析24h，每隔4h更换一次水，去除溶液中残存的苯酚。将透析袋中的液体倒至离心管中，真空冷冻干燥，得到LOS半纯品。将LOS半纯品复溶于氯仿和甲醇(2:1，v/v)混合液中，12000rpm离心20min，倒掉上清。重复上述操作，吹干复溶于水中，真空冷冻干燥，即得到LOS纯品。
(2)SDS-PAGE法分析LOS：配制20g/L的LOS溶液。在15μL的LOS溶液中加入5μL 4×SDS上样缓冲液(50M Tris-HCL、2％SDS、10％蔗糖和0.01％溴酚蓝，pH 6.8)后，沸水浴加热10min，待样品冷却至室温后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将20μL溶液全部加入凝胶孔中。浓缩胶电流设置为15mA，待条带跑至分离胶于浓缩胶界面时，将电流调至25mA。待样品条带跑至距离胶最底部大约5mm时关闭电源，停止电泳。室温下，使用固定液(30％乙醇和10％乙酸)固定凝胶20min；使用氧化液(30％乙醇、10％乙酸和0.7％过碘酸)处理20min；振荡水洗涤凝胶1h，每隔20min换水，充分水洗。使用银氨溶液(56mL、0.1M NaOH加入4mL浓氨水，补水至230mL，再逐滴加入10mL 20％AgNO3溶液，溶液应呈清亮透明状，若出现沉淀则需重新配制，银氨溶液需要现用现配)处理凝胶10min；振荡水洗涤凝胶30min，每隔10min换一次水。加入显色液(0.05g/L柠檬酸和0.02％甲醛)处理至LOS条带显现出来为止。为防止过度染色，在显现出明显的LOS条带时，立即加入7％冰醋酸，终止反应。
结果表明，如图6a所示，泳道1为野生型百日咳杆菌CS菌株LOS的电泳图，CS菌株的LOS存在两种结构，迁移速度快的为core-kdo2-lipid A结构，迁移速度慢的为trisaccharide-core-kdo2-lipidA结构；泳道2为野生型大肠杆菌MG1655菌株LOS的电泳图，MG1655菌株LPS只有core-kdo2-lipidA一种结构；泳道3为LPS精简菌株MDCO020的LOS结构，菌株MDCO020的LOS结构中只存在Kdo2-lipidA结构，因此其迁移速度较快；图6b为菌株MDCO020/pWpBpD5的LPS结构，其中存在大量高分子量的LPS，这些高分子量的LPS都是在trisaccharide-core-kdo2-lipidA的基础上不断添加三糖所造成的。
实施例6核磁共振分析寡糖抗原结构
将实施例5中的LOS纯品用去离子水稀释为10mg/mL，加入1％冰醋酸，沸水浴90min，终止加热，并调节pH至7.0。4℃离心4h，收集上清，0.45μm过滤上清，收集上清，真空冷冻干燥，即获得不含类脂A的寡糖链样品。寡糖链样品水复溶后，上样于Sephadex G-25Medium层析柱，以水为流动相，按照2mL/mL洗脱，合并多糖吸收部分，真空冷冻干燥，获寡糖链纯化样品。取5mg纯化的寡糖样品用700μL氘代试剂储备液溶解后，转移至5mm的核磁管中，使用600MHz核磁共振波谱仪进行测定。
结果表明，如图7所示，4.7～5.6ppm的峰来自单糖的末端基质氢。3.0～4.4ppm的峰是由环质子引起的。2.87ppm的峰来自于FucNMe的甲基，2.06、2.03、2.01和1.90ppm的峰分别来自于FucNAc、GlcNAc、Man2NAc和Man3NAc的甲基。在1.45ppm处的峰来自Fuc的甲基。这些结果表明MDCO020/pWpBpD5菌株LPS结构中的寡糖结构与百日咳杆菌CS产生的寡糖抗原结构相似。
此外，如图8所示，在相同条件下，在15L发酵罐中分别发酵培养CS菌株与MDCO020/pWpBpD5菌株。发酵百日咳杆菌CS菌株能产生约300g菌体，发酵MDCO020/pWpBpD5菌株能产生约490g菌体；相同条件下采用热酚水法提取菌体LPS或LOS，百日咳杆菌CS菌株一次性能提取到约1g纯品LOS而MDCO020/pWpBpD5菌株能一次性提取到约2g纯品LPS。
实施例7免疫双扩散实验检测抗原免疫性能
百日咳杆菌全细胞超级免疫血清5RBP-5是通过用百日咳杆菌CS菌株免疫家兔获得的。将百日咳杆菌CS菌株接种于MSS培养基中，35℃、5％CO2，发酵96h，离心获得百日咳杆菌细胞，将百日咳杆菌细胞用生理盐水稀释为浓度2×109CFU/mL，加入终体积为2％的甲醛，杀菌4小时制备免疫原。然后，将免疫原加热至37℃，缓慢注入兔耳静脉；之后，每周两次采用不同浓度(0.25、0.5、1、1.5、2和2.5mL)的免疫原，持续4周。第5周采血20mL进行琼脂扩散试验。免疫血清5RBP-5的琼扩效价为1:256。
结果表明，如图9所示，1mg/mL百日咳杆菌CS菌株的LOS和免疫血清5RBP-5产生清晰平滑的免疫沉淀线，而阴性对照盐水不产生线。从MDCO020/pWpBpD5菌株提取不同浓度的LPS(5、2、1和0.5mg/mL)和5RBP-5也产生了免疫沉淀线，表明大肠杆菌MDCO020/pWpBpD5产生的百日咳寡糖抗原具有与百日咳杆菌CS的LOS相似的免疫活性。
虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种生产百日咳杆菌寡糖抗原的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌敲除了大肠杆菌基因组上的O-抗原基因簇，核心糖基因簇，肠共同抗原基因簇，克拉酸基因簇和结合转录抑制因子基因，并过表达了百日咳杆菌来源的核心糖基因簇和末端三糖基因簇以及铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述O-抗原基因簇wbbL-galF包含12个基因，分别为wbbL、wbbK、wbbJ、wbbI、rfc、glf、rfbX、rfbC、rfbA、rfbD、rfbB、galF，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416534.1"、"NP_416536.1"、"NP_416537.1"、"NP_416538.1"、"NP_416539.1"、"NP_416540.1"、"NP_416541.1"、"NP_416542.1"、"NP_416543.1"、"NP_416544.1"、"NP_416545.1"、"NP_416546.1"；
所述核心糖基因簇rfaD-waaQ包含14个基因，分别为rfaD、waaF、waaC、waaU、waaL、waaZ、waaY、waaJ、waaR、waaB、waaS、waaP、waaG、waaQ，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418076.1"、"NP_418077.1"、"NP_418078.1"、"NP_418079.1"、"NP_418080.1"、"NP_418081.1"、"NP_418082.1"、"NP_418083.1"、"NP_418084.1"、"NP_418085.1"、"NP_418086.1"、"NP_418087.1"、"NP_418088.1"、"NP_418089.1"。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述肠共同抗原基因簇rfe-rffM包含12个基因，分别为rfe、wzzE、wecB、wecC、rffG、rffH、rffC、wecE、wzxE、wecF、wzyE、rffM，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_418231.1"、"NP_418232.1"、"YP_026253.1"、"YP_026254.1"、"YP_026255.1"、"NP_418236.1"、"YP_026256.1"、"NP_418238.1"、"NP_418239.1"、"YP_026257.1"、"NP_418241.1"、"NP_418242.1"；
所述克拉酸基因簇wcaM-wza包含20个基因，分别为wza、wzb、wzc、wcaA、wcaB、wcaC、wcaD、wcaE、wcaF、gmd、fcl、gmm、wcaI、manC、manB、wcaJ、wzx、wcaK、wcaL、wcaM共20个基因，其序列的NCBI上登录号依次为"NP_416566.1"、"NP_416565.1"、"NP_416564.1"、"NP_416563.1"、"NP_416562.1"、"NP_416561.1"、"NP_416560.1"、"NP_416559.1"、"NP_416558.1"、"NP_416557.1"、"NP_416556.1"、"NP_416555.1"、"NP_416554.1"、"NP_416553.1"、"NP_416552.1"、"NP_416551.1"、"NP_416550.1"、"NP_416549.1"、"NP_416548.1"、"NP_416547.1"；
所述结合转录抑制因子基因metJ的序列的NCBI上登录号为NP_418373.1。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述百日咳核心糖基因簇包含基因的序列的NCBI登录号分别为"BPTD_RS11720"、"BPTD_RS11725"、"BPTD_RS11730"、"BPTD_RS11735"、"BPTD_RS11740"、"BPTD_RS11745"、"BPTD_RS11750"、"BPTD_RS11755"、"BPTD_RS11760"、"BPTD_RS11765"、"BPTD_RS11770"、"BPTD_RS11775"；
所述百日咳末端三糖基因簇包含基因的序列的NCBI登录号分别为"BPTD_RS00420"、"BPTD_RS00425"、"BPTD_RS00430"、"BPTD_RS00435"、"BPTD_RS00440"、"BPTD_RS00445"、"BPTD_RS00450"、"BPTD_RS00455"、"BPTD_RS00460"、"BPTD_RS00465"、"BPTD_RS00470"、"BPTD_RS00475"；
所述铜绿假单胞菌来源的控制三糖单元长度基因簇包含wzz、wzy和wzx，其序列的NCBI登录号分别为NP_251850.1、NP_251844.1和NP_251843.1。
5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。
6.一种生产百日咳杆菌寡糖抗原的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌接种于发酵培养基中，进行发酵生产。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有4～6g/L酵母粉，8～12g/L蛋白胨，8～12g/L NaCl。
8.权利要求6或7所述方法制备的百日咳寡糖抗原在筛选和/或制备抗百日咳药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物包括但不限于化合物抑制剂、小蛋白抑制剂、单克隆抗体。
10.权利要求1～5任一所述重组大肠杆菌或权利要求6或7任一所述方法在生物医药领域的应用。
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Citations (2)
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| WO2007024756A2 (en) * | 2005-08-20 | 2007-03-01 | Scarab Genomics, Llc | Reduced genome e. coli |
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