CN110387346A - 缺失21个编码胞外多糖合成基因的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了缺失21个编码胞外多糖合成基因的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除大肠杆菌W3110基因组上负责胞外多糖合成和转运的21个基因得到突变菌WJW09，采用WJW09菌株为宿主菌，利用pBHR68异源表达PHB合成基因簇phaCAB，WJW09/pBHR68合成PHB可以达到细胞干重的57.2％，而W3110/pBHR68合成的PHB仅占细胞干重的1.5％。重组菌WJW09/pBHR68的PHB体积产量高达对照菌W3110/pBHR68(1.5％)的38倍。

Description

缺失21个编码胞外多糖合成基因的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及缺失21个编码胞外多糖合成基因的基因工程菌及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。
背景技术
胞外多糖(Extracellular polysaccharides，EPSs)是指被微生物分泌到周围的环境中的含多糖的结构，为革兰氏阴性菌细胞膜外的多糖成分。胞外多糖合成的相关基因以基因簇的形式存在于基因组里，编码糖基转移酶、聚合酶和分支酶，并负责添加修饰成分。在大肠杆菌中，胞外多糖多以克拉酸形式合成，克拉酸附着在细胞外膜外层，由多个糖单元组成，每个糖单元含6个糖分子，这些糖分子的合成也会消耗很多细胞碳源。
生物基材料是解决我国材料需求的一条重要途径，我国2009年的塑料需求量为七千万吨，近年以每年一千万吨的速度增长，为了环保和减少依赖石油，通过合成生物学手段，合成出能高效生产生物基材料—聚羟基脂肪酸酯及其单体的合成菌株。
聚羟基丁酸酯，即PHB，为一种结构较为单一的生物基材料，其已经广泛产业化。其生产菌株主要有大肠杆菌、罗氏真氧菌和嗜盐假单胞菌等，胞内糖类碳源经过糖酵解途径生成乙酰辅酶A，β-酮基硫解酶PhaA催化2个乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A，然后在乙酰乙酰辅酶A还原酶PhaB的作用下还原为(R)-3-羟基丁酰辅酶A，最后由PHA合酶PhaC聚合成PHB。
大肠杆菌作为典型的模式生物菌，其具有分子改造简单，生长快等优点备受欢迎。目前合成PHB的大肠杆菌，常用的宿主有DH5α、JM109和MG1655，以这些宿主构建得到大肠杆菌菌株，并通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善PHB的合成。
Kang,Z.等人在文章《Engineering Escherichia coli for an efficientaerobic fermentation platform》(公开日：2009年10月12日)中，在大肠杆菌MG1655中连续敲除葡萄糖转运系统基因ptsG和杂酸合成旁路基因poxB、pta和iclR后使得PHB合成量由14.91％提高到28.92％，但PHB产量仍较低，需进一步提高。因此，提供一种更为有效的方法，对于进一步提高PHB的合成具有十分重大的意义。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明构建了一株缺失21个编码胞外多糖合成基因的基因工程菌株，从分子水平彻底删除胞外多糖克拉酸的编码基因，获得基因工程菌WJW09。采用WJW09菌株为宿主菌，利用pBHR68异源表达PHB合成基因簇phaCAB，在正常的发酵条件下即可以合成细胞干重57.2％的PHB，PHB体积产量是野生对照菌(1.5％)的38倍。
本发明的第一个目的是提供一种生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)的重组菌，所述重组菌是敲除大肠杆菌基因组上21个编码胞外多糖合成和转运基因，并将β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因转化到菌株中；所述21个编码胞外多糖合成和转运基因分别为wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110。
在一种实施方式中，所述wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF基因序列的NCBI登录号依次为“BAE76576.1”、“BAE76575.1”、“BAA15913.1”、“BAA15912.1”、“BAA15911.1”、“BAE76574.1”、“BAE76573.1”、“BAE76572.1”、“BAA15910.1”、“BAA15909.1”、“BAA15908.1”、“B AA15907.1”、“BAA15906.1”、“BAA15905.1”、“BAA15901.1”“BAA15900.1”、“BAA15899.1”、“BAE76571.1”、“BAA15898.1”、“BAA15897.1”、“BAA15896.1”。
在一种实施方式中，所述β-酮基硫解酶的protein ID为QBK40993.1；所述乙酰辅酶A还原酶的protein ID为QBK40994.1；所述PHB合成酶的protein ID为QBK40992.1。
在一种实施方式中，所述转化是将含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因的PHB合成基因簇phaCAB连接到表达质粒上后，转化到宿主大肠杆菌中。
在一种实施方式中，所述基因簇phaCAB的序列的NCBI登录号为“QBK40992.1”。
本发明的第二个目的是提供一种生产PHB的方法，所述方法是应用所述的重组菌进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。
在一种实施方式中，所述发酵培养基的组成包括：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，10mg/mL维生素B1。
本发明还提供所述重组菌或所述方法在药物制备、材料或环保领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明敲除大肠杆菌W3110基因组上负责胞外多糖合成和转运的21个基因得到突变菌WJW09，采用WJW09菌株为宿主菌，利用pBHR68异源表达PHB合成基因簇phaCAB，WJW09/pBHR68合成PHB可以达到细胞干重的57.2％，而W3110/pBHR68合成的PHB仅占细胞干重的1.5％。重组菌WJW09/pBHR68的PHB体积产量高达对照菌W3110/pBHR68(1.5％)的38倍。
生物材料
野生型大肠杆菌W3110购买自ATCC，保藏编号为ATCC39936。
附图说明
图1：大肠杆菌W3110中胞外多糖合成和转运编码基因簇。
图2：突变菌株WJW09的构建。
图3：WJW09的生长曲线。
图4：工程菌WJW09/pBHR68和W3110/pBHR68细胞胞内合成PHB颗粒的结晶紫染色显微镜照片。
图5：工程菌WJW09/pBHR68和W3110/pBHR68细胞胞内合成PHB颗粒的超薄切片透射电镜照片。
图6：基因工程菌WJW09/pBHR68和W3110/pBHR68合成PHB的摇瓶发酵测定。
具体实施方式
(1)大肠杆菌的电镜观察
①细胞结晶紫染色及光学显微镜观察
离心发酵液，并从菌体部分取0.5μL菌体涂到干净的载玻片上，固定烘干，并滴上一滴0.1％结晶紫染色1min，冲洗烘干后滴香柏油，进行光学显微镜油镜观察，并拍照。
②激光共聚焦纤维镜观察
取发酵菌体0.5mL，将菌体用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤2次，配制尼罗红染液(1μmol尼罗红，溶于1μg/μL的DMSO中)，并重悬菌液后置于37℃暗室中染色30min，用铝箔将EP管包好避免见光。染色结束后，再次用预冷的pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤菌体三次，尽量在黑暗条件下打开操作。在暗室中吸取10μL菌液置于载玻片上并加盖盖玻片，用拇指按压5s以上，接着用指甲油封边，指甲油干燥后关灯黑暗条件下进行激光共聚焦纤维镜观察。首先将玻片倒置于LCFM载物台上，粗调下找到细胞区域，再对准区域调好焦距和激发波长480nm，用LCFM放大一定倍数进行观察。若观察过程中发现细胞有流动现象则应重新制样，并特别注意封边的操作，细胞的固定程度越好，成像越好越清晰。固定好发射光，调整好放大倍数，进行多视野拍照。
③超薄切片电镜观察
采取磷钨酸负染法。首先将菌体收集后，用PBS(pH 7.4)洗涤菌体，并用2.5％的戊二醛(溶剂为终浓度为0.1M的PBS，pH7.4)固定，需要加手套和口罩，加满静置，待5min后用牙签将菌体团挑起，使得固定液充分将菌体固定，再加满固定液，封口，防止运输过程中把菌体打散。然后进行脱水，包埋和超薄切片，最后负染进行电镜观察。
(2)发酵参数测定方法
①OD和pH测定
用去离子水调零，调整稀释倍数至在比色皿中测的OD600在0.2至0.8之间。待示数稳定后记录读数，乘以稀释倍数，即得OD。
对刚取的发酵样品直接进行pH测定，采用pH计测定直接读数。
②残糖测定
SBA-40C生物传感器是通过葡萄糖分子和反应膜上的受体结合所反映出电信号变化来定量葡萄糖浓度的；测定方法是将样品10000rpm离心2min，将20μl上清液加入到总体系为1000μl的待测体系中，并剧烈震荡均匀；准确吸取25μl标样(含有1g/L葡萄糖)快速打入进样孔内，等待仪器平衡后，待指示灯不闪烁后，重复3针以上，均基本一致，视为定标完成；准确吸取25μl样品快速打入进样孔内，记录仪器显示屏指数，除以2即得残糖数值。
③PHB的提取和测定
取不同发酵时间的PHB合成细胞，离心收集5mL细胞，采用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤两次，离心收集后，将细胞转移到预先准确称重的离心管中，包上保鲜膜，并扎出多个小洞，使得水分可以蒸干，又避免菌液喷出，在真空冷冻干燥机中冻干48h至完全干燥，一般触摸管底为常温状态，表明已经完全干透，或者用手指轻弹管底，菌体可以散开并轻易脱离管壁，则视为菌体完全干燥。称重量，计算出干重。
称取1-10mg完全干燥的干菌体，同时称取PHB标准样品约10mg转移至预先准确称重的酯化管中，以便准确计算称得的样品重量。然后进行酯化操作，加入2mL甲醇(含有3％硫酸)和2mL氯仿，加上酯化管盖子并盖紧，期间可以超声，帮助样品散开，使得酯化更彻底，沸水浴6h以上。大约半小时后，即可观察到PHB标样一般以粉末形式迅速熔化。若未观察到半小时后标准品的形态变化与溶解，则应更换整套试剂，甲醇和氯仿的变质都会导致酯化无法正常进行，而更换新开封的试剂往往可以解决上述问题，经过六小时沸水浴后，在通风橱中冷却充分后，小心打开酯化管并加入1mL去离子水，这时需要分别将盖子旋紧并激烈震荡至体系完全充分混匀，此时将酯化管置于通风处中静置3h以上以分相，分相后，上层为水相，下层为有机相，取适量有机相加入到气相样品瓶中，盖紧盖子保持密封，保存在-80℃中。
气相色谱是定量PHB含量的准确灵敏的手段。气相定量采用岛津GC 2010气相色谱，使用安捷伦DB WAX 30m-0.32mm气相色谱柱和火焰离子化检测器，进样温度为250℃。以不同量的商业化PHB作为标样绘制各标准样品的标准曲线。
实施例1敲除质粒的构建
采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除胞外多糖合成及转运基因簇，需要构建1个敲除质粒pTargetF-galF-wza，该质粒的构建过程具体为：
(1)通过网站http://crispr.mit.edu/的分析，选取20nt与目的基因靶序列互补的N20序列(参见表1引物pTargetF-galF-wza-F中下划线序列)。
(2)以质粒pTargetF为模板，使用正向引物pTargetF-galF-wza-F(5’端为步骤(1)中的N20序列)和反向引物pTargetF-R，扩增得到引入了N20序列的开环质粒。将PCR扩增产物进行电泳验证及纯化回收。
(3)由于回收产物中可能含有模板质粒pTargetF，会影响后续实验，使用DpnⅠ酶对模板质粒进行消化。向步骤(2)中得到的PCR回收产物加入中DpnⅠ酶，37℃反应2h。然后加入T4磷酸化激酶，37℃反应30min，然后65℃热失活10min，得到磷酸化的开环质粒。向磷酸化后的反应体系中加入1μL T4DNA连接酶，于22℃反应4h。
(4)将连接液加入大肠杆菌JM109感受态细胞中并轻轻吹吸混匀，冰浴30min。然后将感受态于43℃水浴中热激90s，冰浴2min，迅速加入1mL LB培养基。37℃，100rpm复苏1h，然后涂布在添加50mg/L的奇霉素(Spe)的LB平板上，37℃倒置培养，以筛选敲除转化子。以空白质粒pTargetF为阴性对照，对转化子进行菌落PCR验证，将验证正确的转化子转接至添加奇霉素(Spe)的LB液体试管中，提取质粒得到敲除质粒pTargetF-galF-wza。
表1引物序列
实施例2基因工程菌WJW09的构建
采用CRISPR/Cas9敲除系统敲除胞外多糖合成及转运基因簇获得WJW09，该基因簇包含wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF共21个基因，这些基因序列的NCBI登录号依次为“BAE76576.1”、“BAE76575.1”、“BAA15913.1”、“BAA15912.1”、“BAA15911.1”、“BAE76574.1”、“BAE76573.1”、“BAE76572.1”、“BAA15910.1”、“BAA15909.1”、“BAA15908.1”、“BAA15907.1”、“BAA15906.1”、“BAA15905.1”、“BAA15901.1”“BAA15900.1”、“BAA15899.1”、“BAE76571.1”、“BA A15898.1”、“BAA15897.1”、“BAA15896.1”。具体步骤如下：
(1)同源臂敲除片段的构建
提取大肠杆菌W3110的基因组，以基因组为模板，用敲除目的基因簇wza-galF的同源臂引物galF-wza-U-F/galF-wza-U-R，galF-wza-D-F/galF-wza-D-R分别扩增得到上游同源臂和下游同源臂。将PCR扩增产物纯化，并用DNA胶回收试剂盒进行回收，采用重叠PCR的方法连接上游同源臂和下游同源臂，得到基因簇wza-galF敲除片段(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)。
表2引物序列
(2)大肠杆菌电转敲除感受态的制备
将质粒pCas转化到大肠杆菌W3110中，得到含有pCas质粒的重组大肠杆菌W3110/pCas，将大肠杆菌W3110/pCas在添加30mg/L卡那霉素(Kan)的LB固体平板上活化后，接种到添加Kan的LB液体培养基中过夜培养得到种子液；将种子液按1％转接至25mL LB+Kan培养基中，于30℃，200rpm条件下培养至OD600＝0.2，加入500μL L-阿拉伯糖溶液诱导，继续培养至OD600＝0.5，冰浴30min；4℃，4000rpm离心10min收集菌体，用预冷的10％甘油溶液洗涤菌体三次；加入300μL 10％甘油溶液重悬菌体，分装到无菌的1.5mL EP管中。
(3)基因的电转敲除
向大肠杆菌W3110/pCas感受态细胞中加入100ng实施例1中得到的敲除质粒pTargetF-galF-wza和500ng本实施例步骤(1)中得到的同源臂敲除片段，轻轻吹吸混匀，吸至电击杯的槽中。将电击杯冰浴10min，擦干后电击。然后迅速向电击杯中加入1mL LB培养基，吸出全部菌液至1.5mL EP管中，30℃，100rpm复苏1.5h，在含有30mg/L的Kan和50mg/L的LB平板涂布，并在30℃培养箱中倒置培养。以W3110为阴性对照，用上游同源臂的正向引物galF-wza-U-F和下游同源臂的反向引物galF-wza-D-R对转化子进行菌落PCR验证(图2)。
(4)敲除质粒pTargetF-galF-wza和温敏质粒pCas的去除
将正确的敲除转化子转接至添加30mg/L的Kan和1mM的IPTG的LB试管中，通过IPTG诱导去除敲除质粒pTargetF-galF-wza的酶表达，30℃振荡培养12h，在LB+kan平板上划线分离单菌落。筛选出对壮观霉素敏感的单菌落，即得到去除pTargetF-galF-wza敲除质粒的突变菌株。将去除敲除质粒的突变菌株接至LB试管，42℃振荡培养，在LB平板上划线分离单菌落。筛选出对卡那霉素敏感的单菌落，即得到去除pCas的无抗突变菌株，将其命名为WJW09。
实施例3菌株WJW09的生长状况
LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L。
将WJW09和W3110分别接种到LB培养基中，在37℃下进行培养，测定其生长曲线。
结果表明：如图3所示，菌株WJW09和W3110的生长基本一致，说明21个胞外多糖合成和转运相关基因的敲除不影响细胞生长，可用于工业生产。
实施例4重组菌株W3110/pBHR68、WJW09/pBHR68的构建
(1)质粒pBHR68的构建
质粒pBHR68公开于SCI论文(Spiekermann,P.,Rehm,B.H.,Kalscheuer,R.,Baumeister,D.,Steinbuchel,A.,1999.A sensitive,viable-colony staining methodusing Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other lipid storagecompounds.Arch.Microbiol.171(2),73-80，公开日：1999.01.17)，其含有phaCAB基因簇并含有氨苄青霉素抗性标记，其中phaCAB基因簇含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因。
(2)感受态的制备
分别接种大肠杆菌W3110(ATCC39936)和WJW09于LB液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接到50mL LB液体培养基，37℃，200rpm培养至OD600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的0.01M的CaCl2洗涤3次，最后用1mL 0.01M的CaCl2悬浮，加入1mL 30％甘油混匀，每管200μL分装至预冷的无菌EP管中。
(3)pBHR68质粒的转化
将100-200ng pBHR68质粒加入感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2～3min，加入1mL LB培养基复苏，37℃孵育2h，涂布100μg/mL氨苄霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取转化子于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养种子液。验证正确后分别命名为W3110/pBHR68、WJW09/pBHR68。
实施例5工程菌发酵生产PHB的定性观察
LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L和NaCl 10g/L。
M9G培养基：20g/L葡萄糖(Glucose)，17.1g/L十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，3g/L磷酸二氢钾(KH2PO4)，0.5g/L氯化钠(NaCl)，添加1mM硫酸镁(MgSO4)，0.1mM氯化钙(CaCl2)，10mg/mL维生素B1(VB1)。
(1)种子液培养
分别挑取重组菌W3110/pBHR68、WJW09/pBHR68至25mL LB培养基中，并添加30μg/mL卡那霉素，37℃、200rpm培养5h至对数中期。
(2)发酵合成PHB
培养方法：将种子液(OD600＝1.8左右)按照初始OD600＝0.25转接至常规PHB发酵培养基M9G，并加入卡那霉素使其终浓度为30μg/mL，37℃、200rpm，发酵48h。诱导条件：0小时加入终浓度为0.5mM的IPTG。
(3)细胞的结晶紫染色显微镜观察
收集重组菌W3110/pBHR68、WJW09/pBHR68的24h发酵液，离心1mL，采用200μLddH2O重悬，取2μL滴在载玻片上，酒精灯上固定，自然干燥，滴一滴0.1％的结晶紫溶液染色2min，洗去结晶紫染液，自然干燥，滴香柏油并置于油镜下观察，成像拍照。细胞胞内未被染色为紫色的白色颗粒即为PHB颗粒，细胞体积越大，白色颗粒占体积比例越高，说明胞内合成PHB颗粒越多，产量越高。
结果表明：如图4所示，观察到WJW09/pBHR68细胞体积明显增大，呈长杆状，且几乎每个细胞胞内均含有白色颗粒，而W3110/pBHR68细胞胞内白色颗粒较少，说明PHB合成极少，且细胞体积较WJW09/pBHR68小；说明WJW09/pBHR68细胞可以合成更多PHB颗粒。
(4)发酵细胞的超薄切片电镜观察
采用1.5mL离心管收集2mL发酵24h的菌悬液，pH 7.4PBS缓冲液洗涤2次，加入1.5mL 0.25％戊二醛固定液固定，进行超薄切片制作及观察。
结果表明：如图5所示，WJW09/pBHR68细胞内有较多白色颗粒，而W3110/pBHR68胞内几乎无颗粒，细胞体积较WJW09/pBHR68小。说明WJW09/pBHR68细胞可以合成更多的PHB颗粒。
实施例6PHB产量测定
采取与实施例5相同的发酵方法，对重组菌W3110/pBHR68、WJW09/pBHR68进行发酵，并在不同时间点取样2mL，测定相应的发酵参数。
(1)发酵OD600和细胞干重测定
结果表明：如图6A所示，W3110/pBHR68在发酵24h，OD600达到最高值3.45，而WJW09/pBHR68在24小时OD600为8.29。发酵24h后，W3110/pBHR68的细胞干重(DCW)为1.32g/L，而WJW09/pBHR68细胞的DCW可达到3.14g/L，提高1.38倍。
(2)PHB产量测定
取10mL发酵液离心弃上清后，冷冻菌体，并冷冻干燥。称取一定量冷冻干燥菌体(m0)进行甲酯化，采用已报道的常规甲酯化方法甲酯化，最后进行常规气象色谱定量PHB合成质量(m)，得出PHB占细胞干重比例m/m0。
结果表明：如图6B所示，WJW09/pBHR68合成PHB可以达到细胞干重的57.2％，而W3110/pBHR68合成的PHB仅占细胞干重的1.5％。由于可以合成更多的PHB，WJW09/pBHR68细胞消耗的葡萄糖9.5g/L，比W3110/pBHR68(消耗5.6g/L)多70％，在24h时WJW09/pBHR68细胞的葡萄糖转化系数可以达到21.1％，而W3110/pBHR68仅为0.2％。
表3菌株的摇瓶发酵
虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 缺失21个编码胞外多糖合成基因的基因工程菌及其应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1295
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cagggcctgt aattgaacgg tcaacatggc tttcagcagc caggtgcatc actgcatccg 60
gctgatgctg agcaaaaatc cgtgccattg caggtgcatc gcaaatatcc gcatgttcaa 120
aaacatagcg ttcagaatca gaaacatcag caagtgattc ccggtttccg gcgtacgtta 180
atttatcgac attaacaaca ctatcctgcg tattatttat aatgtgacga actacagctg 240
aaccaataaa tcctgcgcca ccagtaacaa gtattttcac ttaatttatt ccatattact 300
tcagagcatg ctgtgaaata agcggctctc agtttgatta atagaggtat taatgcacgc 360
taccgcccct ggctttacag ctaccagagc actgcatgca tgcctatgat gtgacgagcg 420
ttacccactc gcgctaaacc cgaaaaattc aaacgctaat tgtcttacca atccgctctg 480
gaaacaagga aaatcctgga aaactttgaa taaaacccta ctgctaactc gttgttattc 540
tgatggttta tataaaacaa cggcaggaag attcgcaaca aattactttt gctgcgaatt 600
ttcactgccg ttataatttt cttatcaacc gttacatccg gtcagatttt caggcatcaa 660
tttcattttg gatttcatca ttgtttattt atcactttgg cagagtaatt atcctgtgca 720
ctattaatag caatgtcgcc atgcacattt accttgcagt taattgaata aaaatttaac 780
tggcatcagt cctaaaaaaa ttgatttcat ccgcaggcta ttgacagaat aattcagact 840
ggtctttcag gcatccagac acgctaccgc ccctggcttt ttagctacca atacactgat 900
ttagtttaat ttttcacacc ctctcagcat gcagtcgttg atgagaaagg gttattacgg 960
aaattaactt ccgaatataa ggtgacatta tggtaattga atattggctt tccaataatg 1020
caggaggaag tgttacagct aacggaatag caggcaagat aacaattcgg taattggcta 1080
tttttaagaa ttatattaag tgtcattcaa tatggttttt aggagtttct ttaggttgac 1140
aatatttaat atagtgtctc cacatgcgat atttcttaaa taatgtttta ttattaccac 1200
ttttaattca gggataatgt gaggttatta ccctcaaata atatgagata aatagtgctg 1260
caacattgca tttttgcccc gatttatcca tgatc 1295
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgttacgcga ccgttaagtt gttttagagc tagaaatagc 40
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
actagtatta tacctaggac tgagc 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cagggcctgt aattgaacgg 20
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gatgaaatcc aaaatgaaat tgatgcctga aaatctgacc ggatgtaacg 50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cgttacatcc ggtcagattt tcaggcatca atttcatttt ggatttcatc 50
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gatcatggat aaatcggggc 20

Claims (10)

1.一种生产聚3-羟基丁酸酯(PHB)的重组菌，其特征在于，敲除大肠杆菌基因组上21个编码胞外多糖合成和转运基因，并将β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因转化到菌株中；所述21个编码胞外多糖合成和转运基因分别为wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述wza，wzb，wzc，wcaA，wcaB，wcaC，wcaD，wcaE，wcaF，gmd，wcaG，wcaH，wcaI，manC，manB，wcaJ，wzx，wcaK，wcaL，wcaM，galF基因序列的NCBI登录号依次为“BAE76576.1”、“BAE76575.1”、“BAA15913.1”、“BAA15912.1”、“BAA15911.1”、“BAE76574.1”、“BAE76573.1”、“BAE76572.1”、“BAA15910.1”、“BAA15909.1”、“BAA15908.1”、“BAA15907.1”、“BAA15906.1”、“BAA15905.1”、“BAA15901.1”“BAA15900.1”、“BAA15899.1”、“BAE76571.1”、“BAA15898.1”、“BAA15897.1”、“BAA15896.1”。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述β-酮基硫解酶的protein ID为QBK40993.1；所述乙酰辅酶A还原酶的protein ID为QBK40994.1；所述PHB合成酶的proteinID为QBK40992.1。
5.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述转化是将含有β-酮基硫解酶、乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因的PHB合成基因簇phaCAB连接到表达质粒上后，转化到宿主大肠杆菌中。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述基因簇phaCAB的序列的NCBI登录号为“QBK40992.1”。
7.一种生产PHB的方法，其特征在于，所述方法是应用权利要求1～6任一所述的重组菌进行发酵生产。
8.根据权利要求7所述的方法，所述发酵生产是将所述的重组菌接种到发酵培养基中，以葡萄糖为底物，进行发酵生产。
9.根据权利要求8所述的方法，所述发酵培养基的组成包括：20g/L葡萄糖，17.1g/LNa2HPO4·12H2O，3g/L KH2PO4，0.5g/L NaCl，添加1mM MgSO4，0.1mM CaCl2，10mg/mL维生素B1。
10.权利要求1～6任一所述重组菌或权利要求7～9任一所述方法在药物制备、材料或环保领域的应用。
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