CN115873881A - 一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产1,3‑丁二醇的基因工程菌。所述菌包含了经过人为修改的5'端非翻译区(UTR)序列，该序列为编码柠檬酸合酶的基因gltA的UTR序列，且该人为修改的UTR序列之前加入了组成型启动子序列，通过该设计可以增强底物乙酰辅酶A的积累，减少进入三羧酸循环的乙酰辅酶A，提高1,3‑丁二醇的产量。并通过添加其他强化前体合成的基因对底盘生物进行进一步改造，最后所得菌株为高产1,3‑丁二醇的基因工程菌。

Description

一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其应用，具体涉及一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其在生产1,3-丁二醇中的应用。

背景技术

1,3-丁二醇(1,3-Butanediol)分子式为C₄H₁₀O₂，化学式量为90.121。它是一种四碳二元醇，可用作有价值的医药中间体，例如抗生素、信息素，也可用作食品添加剂，例如畜用饲料。此外，它是化妆品常用的保湿剂，具有一定的抗菌作用和优良的生物相容性。综上，1,3-丁二醇在医药、食品和化妆品领域具有重要的应用价值。

目前，1,3-丁二醇主要以化学合成的方法生产。然而化学合成法存在以乙醛作为生产原料，造成其副产物多、环境污染等问题。

因此，目前存在的问题需要研究开发一种转化率高、经济性好、易于工业化生产的1,3-丁二醇生物合成技术。

发明内容

本发明的目的之一在于针对现有技术的不足提供一种产1,3-丁二醇的基因工程菌，该菌为高产1,3-丁二醇的基因工程菌，利用该基因工程菌生产1,3-丁二醇，转化率高，经济性好，易于工业化生产。

本发明的目的之二在于提供上述产1,3-丁二醇的基因工程菌在生产1,3-丁二醇中的应用。

为此，本发明第一方面提供了一种产1,3-丁二醇的基因工程菌。

根据本发明的一些实施方式，所述产1,3-丁二醇的基因工程菌为包含经过人工修改的编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的UTR序列的重组大肠杆菌。

根据本发明，所述人工修改为替换编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的UTR序列，并在该UTR序列之前加入组成型启动子序列；优选地，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA的序列如SEQIDNO.36所示，所述UTR序列如SEQIDNO.1所示。

本发明中，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA为大肠杆菌的内源基因；优选地，所做的修改为在大肠杆菌的基因组上的更改；更优选地，所述基因工程菌使用的启动子均为强启动子。

根据本发明的另一些实施方式，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的产 1,3-丁二醇的基因工程菌；优选地，所述底盘微生物改造包括强化1,3-丁二醇的合成途径、竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化，以及辅因子代谢调控基因的表达。

本发明中，所述强化1,3-丁二醇的合成途径包括在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA、经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB、经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T以及在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的内源编码醇脱氢酶的基因yqhd。

在本发明的一些实施例中，所述异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因PhaA来源于钩虫贪铜菌，经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA 的序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的一些实施例中，编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB来源于钩虫贪铜菌，经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB 的序列如SEQIDNO.3所示。

在本发明的一些实施例中，编码醇脱氢酶的基因yqhd来源于大肠杆菌，经过密码子优化的编码醇脱氢酶的基因yqhd的序列如SEQIDNO.4所示。

在本发明的一些实施例中，所述编码丁醛脱氢酶基因Bld来源于蔗几丁醇梭菌，编码丁醛脱氢酶基因Bld的突变体基因Bld-L273T为基因Bld编码的丁醛脱氢酶的第273位的亮氨酸突变为苏氨酸的编码基因，经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T的序列如SEQIDNO.5所示。

本发明中，所述辅因子代谢调控基因包括大肠杆菌内源编码辅因子调节蛋白 NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA、大肠杆菌内源编码辅因子调节蛋白NAD(P) 转氢酶β亚基的基因pntB、大肠杆菌内源编码NAD激酶的基因nadk和异源编码甲酸脱氢酶的基因fdh1中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA来源于大肠杆菌，其序列如SEQIDNO.6所示。

在本发明的一些实施例中，编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶β亚基的基因pntB来源于大肠杆菌，其序列如SEQIDNO.7所示。

在本发明的一些实施例中，编码NAD激酶的基因nadk来源于大肠杆菌，其序列如SEQIDNO.12所示。

在本发明的一些实施例中，异源编码甲酸脱氢酶的基因fdh1来源于酿酒酵母，其序列如SEQIDNO.8所示。

本发明中，所述竞争代谢途径相关基因包括三羧酸循环相关基因；优选地，所述三羧酸循环相关基因包括编码柠檬酸合酶的基因gltA；进一步优选地，编码柠檬酸合酶的基因gltA的序列如SEQIDNO.36所示。

本发明第二方面提供了一种如本发明第一方面所述的基因工程菌在生产1,3- 丁二醇中的应用。

根据本发明，所述应用包括将产1,3-丁二醇的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得1,3-丁二醇；

在本发明的一些实施例中，所述发酵培养条件为：发酵温度为30-37℃，发酵培养时间为72h，IPTG诱导浓度为0.05-1.2mM。

在本发明的一些实施例中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：

步骤S1，对发酵培养液进行离心分离，获得上清液；

步骤S2，用0.22μm的水相滤膜过滤上清液，获得1,3-丁二醇。

本发明人采用大肠杆菌为宿主细胞，通过导入编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶，乙酰乙酰辅酶A脱氢酶，丁醛脱氢酶，醇脱氢酶，NAD(P)转氢酶α亚基，NAD(P) 转氢酶β亚基，NAD激酶和甲酸脱氢酶的基因，并通过敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对大肠杆菌进行底盘微生物改造，构建并获得一种产1,3-丁二醇的基因工程菌，该菌为高产1,3-丁二醇的基因工程菌，利用该基因工程菌生产1,3-丁二醇，转化率高，经济性好，易于工业化生产。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1示出生物合成1,3-丁二醇的反应机理；

图2为原始菌株导入途径质粒后，1,3-丁二醇产量图；

图3为原始菌株导入途径质粒以及辅因子质粒后，1,3-丁二醇产量图；

图4为优势途径质粒与辅因子质粒在不同UTR序列下编码柠檬酸合酶的基因gltA的产量图。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ、术语

本发明所述用语“UTR序列”是一条mRNA链上有多个编码区，5'端、3'端和各编码区之间为非翻译区，具有调控基因转录水平的功能，具有影响聚合酶结合能力的功能。

本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。

本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，或者对其进行包括前体合成途径的强化和竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化的底盘微生物改造产生所需要的蛋白的细菌，如大肠杆菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为重组微生物。

本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。

本发明中所用符号“*”代表使用的基因为突变体。

Ⅱ、实施方案

针对目前生物法合成1,3-丁二醇仍存在转化率低，经济性差等缺点，难以实现工业化的问题，本发明对生物法合成1,3-丁二醇的工艺技术进行了大量的研究。为实现上述生物合成1,3-丁二醇的目标，本发明人采用大肠杆菌为宿主细胞，将经过人为修改的5'端非翻译区(UTR)序列，替换到编码柠檬酸合酶的基因gltA 的天然UTR序列处，且该人为修改的UTR序列之前添加了组成型启动子序列的重组宿主菌。在该宿主菌的基础上，通过导入编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶，乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因，丁醛脱氢酶的基因，醇脱氢酶的基因，NAD(P)转氢酶α亚基的基因，NAD(P)转氢酶β亚基的基因，NAD激酶的基因和甲酸脱氢酶的基因，敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对大肠杆菌进行底盘微生物改造，成功构建并获得一种1,3-丁二醇的基因工程菌，利用该基因工程菌生产1,3-丁二醇转化率高，经济性好，易于工业化生产。由此获得本发明。

因此，本发明第一方面提供了一种1,3-丁二醇合成的新途径，其通过一种高产1,3-丁二醇的基因工程菌，实现以葡萄糖为前体的1,3-丁二醇的高效合成。

为实现上述技术方案，本发明提供了一种能够产1,3-丁二醇的基因工程菌。

根据本发明的一些实施方式，所述产1,3-丁二醇的基因工程菌为包含经过人工修改的编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的UTR序列的重组大肠杆菌。

根据本发明，所述人工修改为替换编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的UTR序列，并在该UTR序列之前加入组成型启动子序列。

本发明中，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA(GenBank:AAA23892.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.36所示，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA(GenBank: AAA23892.1)的天然UTR序列如SEQ No.37所示，所述UTR序列通过筛选获得，其序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述组成型启动子的序列如 SEQIDNO.13所示。

在本发明的一些进一步具体优选的实施例中，添加了启动子序列以及替换了筛选出的UTR序列的编码柠檬酸合酶的基因gltA的完整序列如SEQIDNO.14所示。

本发明中的产1,3-丁二醇的基因工程菌的特征在于：

(1)所述编码柠檬酸合酶的基因gltA为大肠杆菌的内源基因；

(2)所做的修改为在大肠杆菌的基因组上的更改。

(3)所述基因工程菌使用的启动子均为强启动子，所述强启动子包括tac启动子、T7启动子等。

(4)所述大肠杆菌包括大肠杆菌K12或大肠杆菌JM109等。

在本发明的一些具体实施例中，在宿主菌(大肠杆菌)中将经过人为修改的5'端非翻译区(UTR)序列，替换到编码柠檬酸合酶的基因gltA的天然UTR序列处，且该人为修改的UTR序列之前添加了组成型启动子序列。通过筛选UTR序列，得到一株可以积累前体底物乙酰辅酶A的菌株，即获得一株高产1,3-丁二醇的菌株。

根据本发明的另一些实施方式，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的产 1,3-丁二醇的基因工程菌，所述底盘微生物改造包括强化1,3-丁二醇的合成途径、竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化，以及辅因子代谢调控基因的表达。

本发明中，所述前体合成途径的强化包括在基因工程菌中过表达前体合成途径的关键基因，其通过增强前体乙酰辅酶A的积累，进而实现1,3-丁二醇从葡萄糖或木糖等简单碳源的高效合成。

本发明中，所述强化1,3-丁二醇的合成途径包括在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA、经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB、经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T以及在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的内源编码醇脱氢酶的基因yqhd。

基于上述容易理解，本发明中所涉及的产1,3-丁二醇的基因工程菌为表达经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA、经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB、经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T以及在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的内源编码醇脱氢酶的基因yqhd的重组宿主菌。

在本发明的一些实施例中，所述异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因PhaA来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)；

来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)的编码乙酰乙酰辅酶A 硫解酶的基因PhaA(GenBank:AAA21972.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；

经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA的序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的一些实施例中，编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)，所述来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)的编码乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB (GenBank:AAA21973.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB的序列如SEQIDNO.3所示。

在本发明的一些实施例中，编码醇脱氢酶的基因yqhd来源于大肠杆菌(Escherichia coli(strain K12))，经过密码子优化的编码醇脱氢酶的基因yqhd的序列如SEQIDNO.4所示。

在本发明的一些实施例中，所述编码丁醛脱氢酶基因Bld来源于蔗几丁醇梭菌(Clostridium saccharoper butylacetonicum N1-4(HMT))，所述来源于蔗几丁醇梭菌的编码丁醛脱氢酶的基因Bld(GenBank:AAP42563.1)的核苷酸序列如 SEQIDNO.11所示；编码丁醛脱氢酶基因Bld的突变体Bld*基因Bld-L273T为基因Bld编码的丁醛脱氢酶的第273位的亮氨酸突变为苏氨酸的编码基因，经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T的序列如 SEQIDNO.5所示。

本发明中，所述辅因子代谢调控基因包括大肠杆菌内源编码辅因子调节蛋白 NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA、大肠杆菌内源编码辅因子调节蛋白NAD(P) 转氢酶β亚基的基因pntB、大肠杆菌内源编码NAD激酶的基因nadk和异源编码甲酸脱氢酶的基因fdh1中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA来源于大肠杆菌，来源于大肠杆菌的编码NAD(P)转氢酶α亚基的基因 pntA(GenBank:CAB37089.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。

在本发明的一些实施例中，编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶β亚基的基因pntB来源于大肠杆菌，来源于大肠杆菌的编码NAD(P)转氢酶β亚基的基因 pntB(GenBank:CAB37090.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。

在本发明的一些实施例中，编码NAD激酶的基因nadk来源于大肠杆菌，来源于大肠杆菌的编码NAD激酶的基因nadk(GenBank:AAA79785.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。

在本发明的一些实施例中，异源编码甲酸脱氢酶的基因fdh1来源于酿酒酵母，来源于酿酒酵母的编码甲酸脱氢酶的基因fdh1(GenBank:CAA99720.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。

根据本发明，通过敲除或弱化竞争代谢途径相关基因进行底盘微生物改造，由此可以调控碳代谢流向，使代谢通量更多的流向1,3-丁二醇的合成，籍此使更多的底物流向1,3-丁二醇的合成，从而获得高产1,3-丁二醇的大肠杆菌基因工程菌。

本发明中，所述竞争代谢途径相关基因包括三羧酸循环相关基因；优选地，所述三羧酸循环相关基因包括编码柠檬酸合酶的基因gltA；进一步优选地，编码柠檬酸合酶的基因gltA的序列如SEQIDNO.36所示。

本发明采用大肠杆菌为宿主细胞，通过导入编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因，编码乙酰辅酶A脱氢酶的基因基因，编码丁醛脱氢的酶的基因，编码醇脱氢的酶的基因，NAD(P)转氢酶α亚基，NAD(P)转氢酶β亚基，NAD激酶与甲酸脱氢酶的基因，以及强化前体合成途径，敲除或弱化竞争代谢途径相关基因对大肠杆菌进行底盘微生物改造，成功构建并获得了高1,3-丁二醇的基因工程菌。

在本发明的一些具体实施例中，通过在宿主菌(例如，原始或改造过的大肠杆菌K12、JM109等)中高效表达1,3-丁二醇合成途径中相关酶的基因，优选来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)的编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA(GenBank:AAA21972.1)的经密码子优化后的基因，来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC17699)的编码乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因 PhaB(GenBank:AAA21973.1)的经密码子优化后的基因，来源于蔗几丁醇梭菌 (Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4(HMT))的编码丁醛脱氢酶的基因 Bld(GenBank:AAP42563.1)的经密码子优化后的基因，在实施中使用的是编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体Bld*，即Bld-L273T，来源于大肠杆菌(Escherichia coli(strain K12))的编码醇脱氢酶的基因yqhd(GenBank:AAA69178.1)的经密码子优化后的基因，来源于大肠杆菌(Escherichia coli(strain K12))的编码NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA(GenBank:CAB37089.1)的经密码子优化后的基因，来源于大肠杆菌(Escherichia coli(strain K12))的编码NAD(P)转氢酶β亚基的基因pntB(GenBank:CAB37090.1)的经密码子优化后的基因，来源于大肠杆菌 (Escherichia coli(strainK12))的编码NAD激酶的基因nadk(GenBank: AAA79785.1)的经密码子优化后的基因，来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)的编码甲酸脱氢酶的基因fdh1的经密码子优化后的基因。

本发明中，利用高产1,3-丁二醇的大肠杆菌作为宿主生产1,3-丁二醇，通过人为修改编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的序列可以增强乙酰辅酶A 的积累，减少进入三羧酸循环的乙酰辅酶A，提高1,3-丁二醇的产量。

本发明中对表达质粒的种类没有特殊要求，可根据宿主的选择进行相应的调整，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因和表达载体经过酶切处理后连接，之后不再赘述。

在一些具体优选的实施例中，大肠杆菌菌株Trans10(购于北京全式金生物技术有限公司)用于载体构建，大肠杆菌JM109(DE3)(上海唯地生物技术有限公司)则作为发酵用菌株。

在一些例子中，通过同源重组的方式替换编码柠檬酸合酶的基因gltA的UTR 序列，用于构建不同UTR序列的引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.15-19 所示。

表1 构建重组UTR序列的相关引物

注：下划线处为UTR序列，斜体为启动子序列。加粗序列为选中序列

在一些例子中，例如，可以利用基因组更改方案构建基因工程菌，和/或，利用基因PhaA,PhaB,Bld*,yqhd,pntA,pntB,nadk,fdh1构建基因工程菌。用于构建重组质粒的相关引物如表1所示，相应的序列如SEQ No.20-35所示。

表2 构建重组质粒的相关引物(基因PhaA，PhaB，Bld*，yqhd，pntA，pntB， nadk和fdh1)

/>

注：下划线处为核糖体结合位点序列。

本发明第二方面所涉及的如本发明第一方面所述的基因工程菌在生产1,3-丁二醇中的应用，其可以理解为利用如本发明第一方面所述的基因工程菌生产1,3- 丁二醇的方法。

根据本发明，所述应用包括将产1,3-丁二醇的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得1,3-丁二醇。

在本发明的一些实施例中，将产1,3-丁二醇的基因工程菌接入发酵培养基进行发酵培养包括：将产1,3-丁二醇的基因工程菌接入发酵培养基，在30-37℃，优选为30℃下，200rpm，培养72小时，获得发酵培养液；在OD600＝0.6左右时，加入终浓度为0.0.5-1.2mM，优选为0.1mM的IPTG进行诱导。

在本发明的另一些实施例中，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：

步骤S1，以12000rpm的转速对发酵培养液进行离心分离，获得上清液；

步骤S2，用0.22μm的水相滤膜过滤上清液，获得1,3-丁二醇。

本发明中对于发酵培养基没有特别的限定，只要是用于生产1,3-丁二醇的发酵培养基即可，优选地，所述发酵培养基为M9培养基，其配方为：葡萄糖18g/L, 酵母粉3g/L,Na₂PO₄·7H₂O 12.8g/L,KH₂PO₄ 3.0g/L,NaCl 0.5g/L,NH₄cl 1.0g/L,MgSO₄·7H2O 0.25g/L,CaCl₂0.11g/L,生物素1mM，硫胺素1mM，另外加微量元素溶液10mL。微量元素配方为：FeCl₃·6H₂O 0.83g/L,ZnCl₂ 84mg/L,CuCl₂·2H₂O 13mg/L,CoCl₂·2H₂O 10mg/L,H₃BO₄10mg/L,MnCl₂·4H₂O 1.6mg/L。

Ⅲ、实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。

实施例1：UTR序列的替换

本实施例中所用到的引物如前文中表1所示。

使用Red同源重组的方式进行编码柠檬酸合酶的基因gltA的UTR序列的替换，通过目标片段的导入进行同源重组，在此过程中，编码柠檬酸合酶的基因gltA 的UTR序列被人为设计的UTR序列所替换。目标片段为PCR产物，通过表2 中的F端引物与通用R端引物进行设计。

实施例2：重组质粒构建

本实施例中所用到的引物及核糖体结合位点如前文中表2所示。

委托华大基因对来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)的编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA(GenBank:AAA21972.1，密码子优化后的核苷酸序列为SEQNo.2所示)，对来源于钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator ATCC 17699)的编码乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB(GenBank:AAA21973.1，密码子优化后的核苷酸序列为SEQ No.3所示)，对来源于蔗几丁醇梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4(HMT))的编码丁醛脱氢酶的基因Bld(GenBank: AAA21973.1，经过特定序列突变(L273T)后密码子优化后的核苷酸序列为SEQ No.5所示)进行全基因合成，获得携带有PhaA,PhaB,Bld*基因的pUC57质粒 (pUC57-PhaA，pUC57-PhaB，pUC57-Bld*)。分别利用PhaA-F/PhaA-R， PhaB-F/PhaB-R和Bld*-F/Bld*-R作为引物，以pUC57-PhaA，pUC57-PhaB和 pUC57-Bld*作为模板，进行目的基因PhaA，PhaB与Bld*的扩增。

本实施例中所用到的引物及核糖体结合位点如前文中表2所示。除委托华大基因合成的基因外，剩余基因为以基因组为模板进行PCR扩增所得。

编码醇脱氢酶的基因yqhd(GenBank:AAA69178.1)的核苷酸序列为SEQ No.4所示，编码NAD(P)转氢酶α亚基的基因(GenBank:CAB37089.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。编码NAD(P)转氢酶β亚基的基因(GenBank: CAB37090.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。编码NAD激酶的基因(GenBank: AAA79785.1)的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。所述基因yqhd，pntA，pntB， nadk为来源于大肠杆菌(Escherichia coli(strain K12))的基因。

编码甲酸脱氢酶的基因fdh1(GenBank:CAA99720.1)的核苷酸序列如 SEQIDNO.8所示。编码甲酸脱氢酶的基因fdh1为来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288c)的基因。

分别利用 yqhd-F/yqhd-R,pntA-F/pntA-R,pntB-F/pntB-R,nadk-F/nadk-R,fdh1-F/fdh1-R,以基因组为模板进行扩增。

上述扩增的全部基因，先经过回收处理之后，用吉布森连接酶进行连接，将 目标基因连接到经过限制性内切酶酶切过的质粒上。将基因PhaA,PhaB,Bld*,yqhd 四个基因插入到质粒pCDF-tac中，获得质粒pCDF-tbytp。将基因 fdh1,nadk,pntA,pntB四个基因插入到质粒pACYC-Duet-1中，获得质粒pACYC-fnp。

实施例2：重组菌株的制备

制备大肠杆菌的感受态细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于电转化。将构建好的质粒pCDF-tbytp100-200ng加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀，冰浴5-10min。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，快速加入LB培养基，[蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L， 116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。]，并将混合物转移到 1.5mL离心管中置于37℃摇床中孵育1-1.5小时，之后将菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃培养12-16h。制备成生产1,3-丁二醇的菌株VT01(见表3)

制备大肠杆菌的感受态细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于电转化。将构建好的质粒pCDF-tbytp与pACYC-fnp100-200ng加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀，冰浴5-10min。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，快速加入LB培养基，[蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaCl 5g/L，116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。]，并将混合物转移到1.5mL离心管中置于37℃摇床中孵育1-1.5小时，之后将菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃培养12-16h。制备成生产1,3-丁二醇的菌株VT02 (见表3)。

制备经过人为修改过的编码柠檬酸合酶的基因gltA的UTR序列的重组菌株的感受态细胞，并分装100μL于1.5mL的EP管用于电转化。将构建好的质粒 pCDF-tbytp与pACYC-fnp100-200ng加入到含有100μL感受态细胞的1.5mL离心管中，混合均匀，冰浴5-10min。接着利用电转仪将质粒电转进入感受态细胞中。电转完成后，快速加入LB培养基，[蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L， 116℃灭菌25min。对应的固体培养基添加1.8％-2％琼脂。]，并将混合物转移到 1.5mL离心管中置于37℃摇床中孵育1-1.5小时，之后将菌液涂到含有相应抗生素的平板上，37℃培养12-16h。制备成生产1,3-丁二醇的菌株VT03(见表3)。

表3 质粒和菌株

表3中，pCDF-tac以及pACYC-Duet-1为实验室保存载体。

实施例3：生产1,3-丁二醇菌株的发酵

(1)产1,3-丁二醇基因工程菌株的摇瓶培养

在生产1,3-丁二醇的菌株VT01/VT02/VT03的平板上挑取单菌落，接到4mL 的带有抗性的液体LB中，37℃下培养12-16h，之后将菌液转接到30mL的M9 培养基中(葡萄糖18g/L,酵母粉3g/L,Na₂PO₄·7H₂O 12.8g/L,KH₂PO₄ 3.0g/L,NaCl 0.5g/L,NH₄Cl 1.0g/L,MgSO₄·7H₂O 0.25g/L,CaCl₂0.11g/L,生物素1mM，硫胺素1mM，另外加微量元素溶液10mL。微量元素配方为：FeCl₃·6H₂O 0.83g/L,ZnCl₂ 84mg/L,CuCl₂·2H₂O 13mg/L,CoCl₂·2H₂O10mg/L,H₃BO₄ 10mg/L,MnCl₂·4H₂O 1.6mg/L)，在发酵培养条件为37℃，200rpm的情况下发酵培养，在OD₆₀₀＝0.6-0.8 左右时，加入终浓度0.1mM的IPTG进行诱导。之后将发酵条件更改为37℃， 200rpm，培养时间为72小时。取样并用高压液相色谱测定1,3-丁二醇的浓度。菌株cgN的最终产量如图2和图3和图4所示，菌株的最终产量如图4所示。

(2)生物量测定

取发酵液加入适量无菌蒸馏水稀释至OD₆₀₀＝0.2～0.8之间，取1mL稀释后的发酵液至于比色皿中，利用分光光度计在600nm波长下进行吸光度测定。

(3)样品处理与检测

将上述发酵液在4℃，12000rpm条件下离心10min。取上清液过0.22μm的水相滤膜。之后利用高压液相色谱对产物进行定性定量分析。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

序列表

<110> 北京化工大学

<120> 一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其应用

<130> RB2102341-FF

<160> 37

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> （编码柠檬酸合酶的人为设计的UTR序列）

<400> 1

tgctgatgct cctttgagct attgc 25

<210> 2

<211> 1182

<212> DNA

<213> （经过密码子优化的编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA）

<400> 2

atgactgacg ttgttattgt ttccgccgca cgtactgcgg taggtaagtt cggtggttct 60

ctggcgaaaa tcccagctcc ggaactgggc gcagtcgtca ttaaagctgc gctggaacgt 120

gcaggtgtaa aaccggagca ggtttctgag gtaatcatgg gccaggttct gaccgcgggt 180

tctggccaaa atcctgcacg tcaggctgcc atcaaagctg gcctgcctgc tatggtgcct 240

gcaatgacca tcaacaaggt atgcggttct ggcctgaaag cagtaatgct ggctgcaaac 300

gctattatgg ctggtgacgc ggaaatcgtg gtcgctggtg gtcaggaaaa catgtctgct 360

gcacctcacg ttctgccggg ttctcgtgat ggcttccgta tgggcgacgc gaaactggtt 420

gatactatga tcgtcgacgg cctgtgggat gtttacaacc agtaccacat gggtattacc 480

gcggagaacg tagcgaaaga atatggtatc actcgtgaag cacaagatga gttcgcagtt 540

ggctcccaaa acaaagcaga agctgcgcag aaagctggca aattcgatga agaaatcgtg 600

ccggtactga tcccgcaacg caaaggtgac cctgtggcct tcaaaactga cgaattcgtg 660

cgtcagggcg ctaccctgga ctccatgtct ggtctgaaac cggcattcga taaagccggt 720

actgtgaccg cagcaaacgc tagcggtctg aacgacggcg cagcagctgt tgtcgttatg 780

tctgccgcca aagcgaaaga actgggtctg actccactgg ctacgatcaa gtcctacgct 840

aacgccggtg tcgatcctaa agtcatgggt atgggtccgg ttccggcctc taaacgtgcg 900

ctgagccgtg ctgaatggac cccacaggat ctggacctga tggaaattaa tgaagccttc 960

gctgcacagg ccctggctgt ccatcagcag atgggttggg ataccagcaa agtgaacgtt 1020

aacggtggtg ccatcgcaat tggccaccca atcggcgcgt ctggttgtcg tatcctggta 1080

accctgctgc acgaaatgaa acgtcgtgat gctaaaaaag gtctggcttc tctgtgtatc 1140

ggtggtggta tgggtgttgc actggccgta gagcgtaaat aa 1182

<210> 3

<211> 741

<212> DNA

<213> （经过密码子优化的编码乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB）

<400> 3

atgacccagc gcattgcgta tgtgaccggc ggcatgggcg gtattggtac cgcgatttgc 60

caacgcctgg cgaaagatgg ctttcgcgtg gtggcgggct gtggccctaa tagccctcgt 120

cgtgaaaaat ggctggaaca gcagaaagcg ctgggctttg attttattgc gagcgaaggc 180

aacgtggcgg attgggatag caccaaaacc gcgtttgata aagtgaaaag cgaagtgggc 240

gaagtggatg tgctgattaa caacgcgggc attacccgcg atgtggtgtt tcgcaaaatg 300

acccgcgcgg attgggatgc ggtgattgat accaacctga ccagcctgtt taacgtgacc 360

aaacaggtga ttgatggcat ggcggatcgc ggctggggcc gtattgttaa cattagcagc 420

gtgaacggcc agaaaggcca gtttggccag accaactata gcaccgcgaa agcgggcctg 480

catggcttta ccatggcgct ggcgcaagaa gtggcgacca aaggcgttac cgtgaacacc 540

gtgagccctg gctatattgc gaccgatatg gtgaaagcga ttcgccagga tgtgctggat 600

aaaattgtgg cgaccattcc ggtgaaacgc ctgggcttac ctgaagaaat tgcgagcatt 660

tgcgcgtggc tgagcagcga agaaagcggc tttagcaccg gcgcggattt tagcctgaac 720

ggcggcttac atatgggcta a 741

<210> 4

<211> 1164

<212> DNA

<213> （经过密码子优化的编码醇脱氢酶的基因yqhd）

<400> 4

atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct 60

ggtttacgcg aacaaattcc tcacgatgct cgcgtattga ttacctacgg cggcggcagc 120

gtgaaaaaaa ccggcgttct cgatcaagtt ctggatgccc tgaaaggcat ggacgtgctg 180

gaatttggcg gtattgagcc aaacccggct tatgaaacgc tgatgaacgc cgtgaaactg 240

gttcgcgaac agaaagtgac tttcctgctg gcggttggcg gcggttctgt actggacggc 300

accaaattta tcgccgcagc ggctaactat ccggaaaata tcgatccgtg gcacattctg 360

caaacgggcg gtaaagagat taaaagcgcc atcccgatgg gctgtgtgct gacgctgcca 420

gcaaccggtt cagaatccaa cgcaggcgcg gtgatctccc gtaaaaccac aggcgacaag 480

caggcgttcc attctgccca tgttcagccg gtatttgccg tgctcgatcc ggtttatacc 540

tacaccctgc cgccgcgtca ggtggctaac ggcgtagtgg acgcctttgt acacaccgtg 600

gaacagtatg ttaccaaacc ggttgatgcc aaaattcagg accgtttcgc agaaggcatt 660

ttgctgacgc taatcgaaga tggtccgaaa gccctgaaag agccagaaaa ctacgatgtg 720

cgcgccaacg tcatgtgggc ggcgactcag gcgctgaacg gtttgattgg cgctggcgta 780

ccgcaggact gggcaacgca tatgctgggc cacgaactga ctgcgatgca cggtctggat 840

cacgcgcaaa cactggctat cgtcctgcct gcactgtgga atgaaaaacg cgataccaag 900

cgcgctaagc tgctgcaata tgctgaacgc gtctggaaca tcactgaagg ttccgatgat 960

gagcgtattg acgccgcgat tgccgcaacc cgcaatttct ttgagcaatt aggcgtgccg 1020

acccacctct ccgactacgg tctggacggc agctccatcc cggctttgct gaaaaaactg 1080

gaagagcacg gcatgaccca actgggcgaa aatcatgaca ttacgttgga tgtcagccgc 1140

cgtatatacg aagccgcccg ctaa 1164

<210> 5

<211> 1408

<212> DNA

<213> （经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld*即Bld-L273T）

<400> 5

atgattaaag ataccctggt tagcatcacg aaagacctga aactgaaaac taatgtggaa 60

aacgctaacc tgaaaaacta taaagatgat tccagctgtt tcggcgtttt cgagaacgtt 120

gaaaacgcga tcagcaatgc agtgcacgcc cagaaaatcc tgtctctgca ctacacgaag 180

gaacaacgtg aaaaaatcat caccgaaatc cgtaaagctg ctctggaaaa taaagaaatc 240

ctggccacta tgatcctgga ggaaacccat atgggtcgct acgaagataa aattctgaaa 300

cacgaactgg ttgccaaata cactccgggc acggaagatc tgacgaccac tgcgtggtct 360

ggtgataacg gtctgaccgt agttgaaatg agcccgtacg gcgtaattgg cgctatcact 420

ccgagcacca accctacgga aaccgttatc tgcaacagca tcggcatgat cgctgcgggt 480

aacaccgtgg tgttcaacgg tcacccgggc gctaaaaaat gtgtggcgtt cgcagttgaa 540

atgatcaaca aggcgatcat ctcctgtggc ggtccggaaa acctggtaac cactattaag 600

aacccaacca tggactccct ggacgctatc atcaaacacc cgtccattaa actgctgtgt 660

ggtactggcg gcccaggtat ggtgaaaact ctgctgaact ccggtaaaaa agcgattggc 720

gctggtgcag gtaaccctcc ggtaattgtt gacgataccg cagacattga aaaggctggt 780

aagtctatca tcgagggttg ttccttcgat aataataccc cgtgcatcgc tgaaaaggaa 840

gtatttgtat tcgaaaacgt cgctgacgac ctgatctcca acatgctgaa aaacaacgct 900

gtaatcatta acgaagatca agttagcaaa ctgatcgatc tggtgctgca aaaaaacaac 960

gaaacccagg agtactccat taataaaaaa tgggtaggta aagatgcgaa actgttcctg 1020

gacgaaattg acgtcgaatc tccttcttcc gtaaaatgta ttatctgtga agtttctgcc 1080

cgccacccat tcgttatgac tgaactgatg atgccgatcc tgccaatcgt gcgtgtaaaa 1140

gacatcgatg aagcaattga atacgctaaa atcgctgaac agaaccgtaa acattctgcg 1200

tacatttaca gcaaaaacat cgacaacctg aatcgttttg aacgtgaaat cgacactacc 1260

attttcgtta aaaacgctaa atcctttgcg ggcgttggct acgaggcaga gggttttacc 1320

actttcacga tcgcaggtag caccggcgaa ggtattactt ctgcacgtaa cttcactcgt 1380

cagcgccgct gcgtactggc tggttaaa 1408

<210> 6

<211> 1533

<212> DNA

<213> （编码NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA）

<400> 6

atgcgaattg gcataccaag agaacggtta accaatgaaa cccgtgttgc agcaacgcca 60

aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120

caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180

aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240

gcgttactga atcctgggac aacgctggtg agttttatct ggcctgcgca gaatccggaa 300

ttaatgcaaa aacttgcgga acgtaacgtg accgtgatgg cgatggactc tgtgccgcgt 360

atctcacgcg cacaatcgct ggacgcacta agctcgatgg cgaacatcgc cggttatcgc 420

gccattgttg aagcggcaca tgaatttggg cgcttcttta ccgggcaaat tactgcggcc 480

gggaaagtgc caccggcaaa agtgatggtg attggtgcgg gtgttgcagg tctggccgcc 540

attggcgcag caaacagtct cggcgcgatt gtgcgtgcat tcgacacccg cccggaagtg 600

aaagaacaag ttcaaagtat gggcgcggaa ttcctcgagc tggattttaa agaggaagct 660

ggcagcggcg atggctatgc caaagtgatg tcggacgcgt tcatcaaagc ggaaatggaa 720

ctctttgccg cccaggcaaa agaggtcgat atcattgtca ccaccgcgct tattccaggc 780

aaaccagcgc cgaagctaat tacccgtgaa atggttgact ccatgaaggc gggcagtgtg 840

attgtcgacc tggcagccca aaacggcggc aactgtgaat acaccgtgcc gggtgaaatc 900

ttcactacgg aaaatggtgt caaagtgatt ggttataccg atcttccggg ccgtctgccg 960

acgcaatcct cacagcttta cggcacaaac ctcgttaatc tgctgaaact gttgtgcaaa 1020

gagaaagacg gcaatatcac tgttgatttt gatgatgtgg tgattcgcgg cgtgaccgtg 1080

atccgtgcgg gcgaaattac ctggccggca ccgccgattc aggtatcagc tcagccgcag 1140

gcggcacaaa aagcggcacc ggaagtgaaa actgaggaaa aatgtacctg ctcaccgtgg 1200

cgtaaatacg cgttgatggc gctggcaatc attctttttg gctggatggc aagcgttgcg 1260

ccgaaagaat tccttgggca cttcaccgtt ttcgcgctga cctgcgttgt cggttattac 1320

gtggtgtgga atgtatcgca cgcgctgcat acaccgttga tgtcggtcac caacgcgatt 1380

tcagggatta ttgttgtcgg agcactgttg cagattggcc agggcggctg ggttagcttc 1440

cttagtttta tcgcggtgct tatagccagc attaatattt tcggtggctt caccgtgact 1500

cagcgcatgc tgaaaatgtt ccgcaaaaat taa 1533

<210> 7

<211> 1389

<212> DNA

<213> （编码NAD(P)转氢酶β亚基的基因pntB）

<400> 7

atgtctggag gattagttac agctgcatac attgttgccg cgatcctgtt tatcttcagt 60

ctggccggtc tttcgaaaca tgaaacgtct cgccagggta acaacttcgg tatcgccggg 120

atggcgattg cgttaatcgc aaccattttt ggaccggata cgggtaatgt tggctggatc 180

ttgctggcga tggtcattgg tggggcaatt ggtatccgtc tggcgaagaa agttgaaatg 240

accgaaatgc cagaactggt ggcgatcctg catagcttcg tgggtctggc ggcagtgctg 300

gttggcttta acagctatct gcatcatgac gcgggaatgg caccgattct ggtcaatatt 360

cacctgacgg aagtgttcct cggtatcttc atcggggcgg taacgttcac gggttcggtg 420

gtggcgttcg gcaaactgtg tggcaagatt tcgtctaaac cattgatgct gccaaaccgt 480

cacaaaatga acctggcggc tctggtcgtt tccttcctgc tgctgattgt atttgttcgc 540

acggacagcg tcggcctgca agtgctggca ttgctgataa tgaccgcaat tgcgctggta 600

ttcggctggc atttagtcgc ctccatcggt ggtgcagata tgccagtggt ggtgtcgatg 660

ctgaactcgt actccggctg ggcggctgcg gctgcgggct ttatgctcag caacgacctg 720

ctgattgtga ccggtgcgct ggtcggttct tcgggggcta tcctttctta cattatgtgt 780

aaggcgatga accgttcctt tatcagcgtt attgcgggtg gtttcggcac cgacggctct 840

tctactggcg atgatcagga agtgggtgag caccgcgaaa tcaccgcaga agagacagcg 900

gaactgctga aaaactccca ttcagtgatc attactccgg ggtacggcat ggcagtcgcg 960

caggcgcaat atcctgtcgc tgaaattact gagaaattgc gcgctcgtgg tattaatgtg 1020

cgtttcggta tccacccggt cgcggggcgt ttgcctggac atatgaacgt attgctggct 1080

gaagcaaaag taccgtatga catcgtgctg gaaatggacg agatcaatga tgactttgct 1140

gataccgata ccgtactggt gattggtgct aacgatacgg ttaacccggc ggcgcaggat 1200

gatccgaaga gtccgattgc tggtatgcct gtgctggaag tgtggaaagc gcagaacgtg 1260

attgtcttta aacgttcgat gaacactggc tatgctggtg tgcaaaaccc gctgttcttc 1320

aaggaaaaca cccacatgct gtttggtgac gccaaagcca gcgtggatgc aatcctgaaa 1380

gctctgtaa 1389

<210> 8

<211> 1131

<212> DNA

<213> （编码甲酸脱氢酶的基因fhd1）

<400> 8

atgtcgaagg gaaaggtttt gctggttctt tacgaaggtg gtaagcatgc tgaagagcag 60

gaaaagttat tggggtgtat tgaaaatgaa cttggtatca gaaatttcat tgaagaacag 120

ggatacgagt tggttactac cattgacaag gaccctgagc caacctcaac ggtagacagg 180

gagttgaaag acgctgaaat tgtcattact acgccctttt tccccgccta catctcgaga 240

aacaggattg cagaagctcc taacctgaag ctctgtgtaa ccgctggcgt cggttcagac 300

catgtcgatt tagaagctgc aaatgaacgg aaaatcacgg tcaccgaagt tactggttct 360

aacgtcgttt ctgtcgcaga gcacgttatg gccacaattt tggttttgat aagaaactat 420

aatggtggtc atcaacaagc aattaatggt gagtgggata ttgccggcgt ggctaaaaat 480

gagtatgatc tggaagacaa aataatttca acggtaggtg ccggtagaat tggatatagg 540

gttctggaaa gattggtcgc atttaatccg aagaagttac tgtactacga ctaccaggaa 600

ctacctgcgg aagcaatcaa tagattgaac gaggccagca agcttttcaa tggcagaggt 660

gatattgttc agagagtaga gaaattggag gatatggttg ctcagtcaga tgttgttacc 720

atcaactgtc cattgcacaa ggactcaagg ggtttattca ataaaaagct tatttcccac 780

atgaaagatg gtgcatactt ggtgaatacc gctagaggtg ctatttgtgt cgcagaagat 840

gttgccgagg cagtcaagtc tggtaaattg gctggctatg gtggtgatgt ctgggataag 900

caaccagcac caaaagacca tccctggagg actatggaca ataaggacca cgtgggaaac 960

gcaatgactg ttcatatcag tggcacatct ctggatgctc aaaagaggta cgctcaggga 1020

gtaaagaaca tcctaaatag ttacttttcc aaaaagtttg attaccgtcc acaggatatt 1080

attgtgcaga atggttctta tgccaccaga gcttatggac agaagaaata a 1131

<210> 9

<211> 1182

<212> DNA

<213> （编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA）

<400> 9

atgactgacg ttgtcatcgt atccgccgcc cgcaccgcgg tcggcaagtt tggcggctcg 60

ctggccaaga tcccggcacc ggaactgggt gccgtggtca tcaaggccgc gctggagcgc 120

gccggcgtca agccggagca ggtgagcgaa gtcatcatgg gccaggtgct gaccgccggt 180

tcgggccaga accccgcacg ccaggccgcg atcaaggccg gcctgccggc gatggtgccg 240

gccatgacca tcaacaaggt gtgcggctcg ggcctgaagg ccgtgatgct ggccgccaac 300

gcgatcatgg cgggcgacgc cgagatcgtg gtggccggcg gccaggaaaa catgagcgcc 360

gccccgcacg tgctgccggg ctcgcgcgat ggtttccgca tgggcgatgc caagctggtc 420

gacaccatga tcgtcgacgg cctgtgggac gtgtacaacc agtaccacat gggcatcacc 480

gccgagaacg tggccaagga atacggcatc acacgcgagg cgcaggatga gttcgccgtc 540

ggctcgcaga acaaggccga agccgcgcag aaggccggca agtttgacga agagatcgtc 600

ccggtgctga tcccgcagcg caagggcgac ccggtggcct tcaagaccga cgagttcgtg 660

cgccagggcg ccacgctgga cagcatgtcc ggcctcaagc ccgccttcga caaggccggc 720

acggtgaccg cggccaacgc ctcgggcctg aacgacggcg ccgccgcggt ggtggtgatg 780

tcggcggcca aggccaagga actgggcctg accccgctgg ccacgatcaa gagctatgcc 840

aacgccggtg tcgatcccaa ggtgatgggc atgggcccgg tgccggcctc caagcgcgcc 900

ctgtcgcgcg ccgagtggac cccgcaagac ctggacctga tggagatcaa cgaggccttt 960

gccgcgcagg cgctggcggt gcaccagcag atgggctggg acacctccaa ggtcaatgtg 1020

aacggcggcg ccatcgccat cggccacccg atcggcgcgt cgggctgccg tatcctggtg 1080

acgctgctgc acgagatgaa gcgccgtgac gcgaagaagg gcctggcctc gctgtgcatc 1140

ggcggcggca tgggcgtggc gctggcagtc gagcgcaaat aa 1182

<210> 10

<211> 741

<212> DNA

<213> （编码乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB）

<400> 10

atgactcagc gcattgcgta tgtgaccggc ggcatgggtg gtatcggaac cgccatttgc 60

cagcggctgg ccaaggatgg ctttcgtgtg gtggccggtt gcggccccaa ctcgccgcgc 120

cgcgaaaagt ggctggagca gcagaaggcc ctgggcttcg atttcattgc ctcggaaggc 180

aatgtggctg actgggactc gaccaagacc gcattcgaca aggtcaagtc cgaggtcggc 240

gaggttgatg tgctgatcaa caacgccggt atcacccgcg acgtggtgtt ccgcaagatg 300

acccgcgccg actgggatgc ggtgatcgac accaacctga cctcgctgtt caacgtcacc 360

aagcaggtga tcgacggcat ggccgaccgt ggctggggcc gcatcgtcaa catctcgtcg 420

gtgaacgggc agaagggcca gttcggccag accaactact ccaccgccaa ggccggcctg 480

catggcttca ccatggcact ggcgcaggaa gtggcgacca agggcgtgac cgtcaacacg 540

gtctctccgg gctatatcgc caccgacatg gtcaaggcga tccgccagga cgtgctcgac 600

aagatcgtcg cgacgatccc ggtcaagcgc ctgggcctgc cggaagagat cgcctcgatc 660

tgcgcctggt tgtcgtcgga ggagtccggt ttctcgaccg gcgccgactt ctcgctcaac 720

ggcggcctgc atatgggctg a 741

<210> 11

<211> 1407

<212> DNA

<213> （编码丁醛脱氢酶的基因Bld）

<400> 11

atgattaaag acacgctagt ttctataaca aaagatttaa aattaaaaac aaatgttgaa 60

aatgccaatc taaagaacta caaggatgat tcttcatgtt tcggagtttt cgaaaatgtt 120

gaaaatgcta taagcaatgc cgtacacgca caaaagatat tatcccttca ttatacaaaa 180

gaacaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattagaaaa taaagagatt 240

ctagctacaa tgattcttga agaaacacat atgggaagat atgaagataa aatattaaag 300

catgaattag tagctaaata cactcctggg acagaagatt taactactac tgcttggtca 360

ggagataacg ggcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gcgttatagg tgcaataact 420

ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagta taggcatgat agctgctgga 480

aatactgtgg tatttaacgg acatccaggc gctaaaaaat gtgttgcttt tgctgtcgaa 540

atgataaata aagctattat ttcatgtggt ggtcctgaga atttagtaac aactataaaa 600

aatccaacta tggactctct agatgcaatt attaagcacc cttcaataaa actactttgc 660

ggaactggag ggccaggaat ggtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720

gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780

aagagtatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840

gtatttgttt ttgagaacgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900

gtaattataa atgaagatca agtatcaaag ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960

gaaactcaag aatactctat aaataagaaa tgggtcggaa aagatgcaaa attattctta 1020

gatgaaatag atgttgagtc tccttcaagt gttaaatgca taatctgcga agtaagtgca 1080

aggcatccat ttgttatgac agaactcatg atgccaatat taccaattgt aagagttaaa 1140

gatatagatg aagctattga atatgcaaaa atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200

tatatttatt caaaaaatat agacaaccta aataggtttg aaagagaaat cgatactact 1260

atctttgtaa agaatgctaa atcttttgcc ggtgttggtt atgaagcaga aggctttaca 1320

actttcacta ttgctggatc cactggtgaa ggaataactt ctgcaagaaa ttttacaaga 1380

caaagaagat gtgtactcgc cggttaa 1407

<210> 12

<211> 879

<212> DNA

<213> （编码NAD激酶的nadk）

<400> 12

atgaataatc atttcaagtg tattggcatt gtgggacacc cacggcaccc cactgcactg 60

acaacacatg aaatgctcta ccgctggctg tgcacaaaag gttacgaggt catcgttgag 120

caacaaatcg ctcacgaact gcaactgaag aatgtgaaaa ctggcacgct cgcggagatt 180

gggcaactag ctgatctcgc ggtagtcgtt ggtggcgacg gtaatatgct gggcgcggca 240

cgcacactcg cccgttacga tattaaagtt attggaatca accgtggcaa cctgggtttc 300

ctgactgacc ttgaccccga taacgcccag caacagttag ccgatgtgct ggaaggccac 360

tacatcagcg agaaacgttt tttgctggaa gcgcaagtct gtcagcaaga ttgccagaaa 420

cgcatcagca ccgcgataaa tgaagtggtg cttcatccag gcaaagtggc gcatatgatt 480

gagttcgaag tgtatatcga cgagatcttt gcgttttctc agcgatctga tggactaatt 540

atttcgacgc caacaggctc caccgcctat tccctctctg caggcggtcc tattctgacc 600

ccctctctgg atgcgattac cctggtgccc atgttcccgc atacgttgtc agcacgacca 660

ctggtcataa acagcagcag cacgatccgt ctgcgttttt cgcatcgccg taacgacctg 720

gaaatcagtt gcgacagcca gatagcactg ccgattcagg aaggtgaaga tgtcctgatt 780

cgtcgctgtg attaccatct gaatctgatt catccgaaag attacagtta tttcaacaca 840

ttaagcacca agctcggctg gtcaaaaaaa ttattctaa 879

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> （人为编码的柠檬酸合酶的基因的UTR序列的启动子序列）

<400> 13

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagc 35

<210> 14

<211> 1344

<212> DNA

<213> （人为编码的柠檬酸合酶的基因gltA的UTR序列的启动子序列以及UTR序列以及基因gltA）

<400> 14

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagctgctg atgctccttt gagctattgc 60

atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 120

ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 180

ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 240

gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 300

tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 360

tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 420

ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 480

gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 540

gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 600

attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 660

atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 720

gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 780

accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 840

tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 900

tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 960

ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 1020

gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1080

atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1140

aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1200

accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1260

agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1320

tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1344

<210> 15

<211> 84

<212> DNA

<213> （引物U1）

<400> 15

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcataca gcggaaaagg agcatcttcg 60

atggctgata caaaagcaaa actc 84

<210> 16

<211> 85

<212> DNA

<213> （引物U2）

<400> 16

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcgcccg atgctccttt aattgacagg 60

atggctgata caaaagcaaa actca 85

<210> 17

<211> 88

<212> DNA

<213> （引物U3）

<400> 17

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcgaccg atgctccttt gtctctagcg 60

atggctgata caaaagcaaa actcaccc 88

<210> 18

<211> 88

<212> DNA

<213> （引物U4）

<400> 18

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcttagg atgctccttt cagacacccg 60

atggctgata caaaagcaaa actcaccc 88

<210> 19

<211> 88

<212> DNA

<213> （引物U5）

<400> 19

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagctgctg atgctccttt gagctattgc 60

atggctgata caaaagcaaa actcaccc 88

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> （引物PhaA-F）

<400> 20

cggcggctta catatgggct aaaggagata taccatgact gacgttgtta ttgtttccg 59

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> （引物PhaA-R）

<400> 21

ttgcactggc cgtagagcgt aaataacgaa ttcgagctcc gtcgacaa 48

<210> 22

<211> 48

<212> DNA

<213> （引物PhaB-F）

<400> 22

ttgtttaact ttaaggagaa ggatatacat gacccagcgc attgcgta 48

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> （引物PhaB-R）

<400> 23

ttagcccata tgtaagccgc cg 22

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> （引物Bld*-F）

<400> 24

gtttaacttt aaggagaagg atatacatga ttaaagatac cctggttagc atcac 55

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> （引物Bld*-R）

<400> 25

tttaaccagc cagtacgcag c 21

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> （引物yqhd-F）

<400> 26

gctgcgtact ggctggttaa aaggagatat accatgaaca actttaatct gcacacccc 59

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> （引物yqhd-R）

<400> 27

gatgattaat tgtcaaattt cctaatgcag gagttagcgg gcggcttcgt 50

<210> 28

<211> 55

<212> DNA

<213> （引物fdh1-F）

<400> 28

ttgtttaact ttaataagga gatataccat ggatgaccaa agttctggca gttct 55

<210> 29

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物fdh1-R）

<400> 29

cgcgccgagc tcgaattcgg atccggatcc ttatttttct gcttcaccg 49

<210> 30

<211> 53

<212> DNA

<213> （引物nadk-F）

<400> 30

atatacatat ggcagatctc aattgatgaa taatcatttc aagtgtattg gca 53

<210> 31

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物nadk-R）

<400> 31

ttattaaagt tttagaataa tttttttgac cagccga 37

<210> 32

<211> 54

<212> DNA

<213> （引物pntA-F）

<400> 32

aattattcta aaactttaat aaggagatat aatgcgaatt ggcataccaa gaga 54

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物pntA-R）

<400> 33

ctaatcctcc agacatatgt taccccttaa tttttgcgga acattttca 49

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物pntB-F）

<400> 34

ggggtaacat atgtctggag gattagtt 28

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> （引物pntB-R）

<400> 35

tgctcagcgg tggcagcagc ctaggttaca gagctttcag gattgcatc 49

<210> 36

<211> 1284

<212> DNA

<213> （编码柠檬酸合酶的基因gltA）

<400> 36

atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60

ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120

ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180

gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240

tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300

tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360

ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420

gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480

gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540

attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600

atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660

gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720

accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780

tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840

tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900

ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960

gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1020

atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1080

aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1140

accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1200

agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1260

tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284

<210> 37

<211> 50

<212> DNA

<213> （编码柠檬酸合酶的基因gltA的天然UTR序列）

<400> 37

aaatttaagt tccggcagtc ttacgcaata aggcgctaag gagaccttaa 50

Claims (10)

1.一种产1,3-丁二醇的基因工程菌，其为包含经过人工修改的编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的UTR序列的重组大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述人工修改为替换编码柠檬酸合酶的基因gltA的5'端非翻译区的UTR序列，并在该UTR序列之前加入组成型启动子序列；优选地，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA的序列如SEQ ID NO.36所示，所述UTR序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码柠檬酸合酶的基因gltA为大肠杆菌的内源基因；优选地，所做的修改为在大肠杆菌的基因组上的更改；更优选地，所述基因工程菌使用的启动子均为强启动子。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过底盘微生物改造的产1,3-丁二醇的基因工程菌；优选地，所述底盘微生物改造包括强化1,3-丁二醇的合成途径、竞争代谢途径相关基因的敲除或弱化，以及辅因子代谢调控基因的表达。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述强化1,3-丁二醇的合成途径包括在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA、经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB、经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T以及在重组大肠杆菌中过表达经过密码子优化的内源编码醇脱氢酶的基因yqhd。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因PhaA来源于钩虫贪铜菌，经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因PhaA的序列如SEQ ID NO.2所示；编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB来源于钩虫贪铜菌，经过密码子优化的编码异源乙酰乙酰辅酶A脱氢酶的基因PhaB的序列如SEQ ID NO.3所示；编码醇脱氢酶的基因yqhd来源于大肠杆菌，经过密码子优化的编码醇脱氢酶的基因yqhd的序列如SEQ ID NO.4所示；所述编码丁醛脱氢酶基因Bld来源于蔗几丁醇梭菌，编码丁醛脱氢酶基因Bld的突变体基因Bld-L273T为基因Bld编码的丁醛脱氢酶的第273位的亮氨酸突变为苏氨酸的编码基因，经过密码子优化的编码丁醛脱氢酶的基因Bld的突变体基因Bld-L273T的序列如SEQ ID NO.5所示。

7.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述辅因子代谢调控基因包括大肠杆菌内源编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA、大肠杆菌内源编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶β亚基的基因pntB、大肠杆菌内源编码NAD激酶的基因nadk和异源编码甲酸脱氢酶的基因fdh1中的一种或几种。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶α亚基的基因pntA来源于大肠杆菌，其序列如SEQ ID NO.6所示；编码辅因子调节蛋白NAD(P)转氢酶β亚基的基因pntB来源于大肠杆菌，其序列如SEQ ID NO.7所示；编码NAD激酶的基因nadk来源于大肠杆菌，其序列如SEQ ID NO.12所示；异源编码甲酸脱氢酶的基因fdh1来源于酿酒酵母，其序列如SEQ ID NO.8所示。

9.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述竞争代谢途径相关基因包括三羧酸循环相关基因；优选地，所述三羧酸循环相关基因包括编码柠檬酸合酶的基因gltA；进一步优选地，编码柠檬酸合酶的基因gltA的序列如SEQ ID NO.36所示。

10.一种如1-9中任意一项所述的基因工程菌在生产1,3-丁二醇中的应用；优选地，所述应用包括将产1,3-丁二醇的基因工程菌接入发酵培养基，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化，制得1,3-丁二醇；

优选地，所述发酵培养条件为：发酵温度为30-37℃，发酵培养时间为72h，IPTG诱导浓度为0.05-1.2mM；

进一步优选地，对所获得的发酵培养液进行分离纯化包括：

步骤S1，对发酵培养液进行离心分离，获得上清液；

步骤S2，用0.22μm的水相滤膜过滤上清液，获得1,3-丁二醇。

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