CN114480315B - 一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其在布立西坦合成中的应用 - Google Patents

一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其在布立西坦合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种Baeyer‑Villiger单加氧酶及其在布立西坦合成中的应用。所述Baeyer‑Villiger单加氧酶优选选自具有具有SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽中的任意一种。经本发明的Baeyer‑Villiger单加氧酶催化，能够经济高效、绿色环保地合成(R)‑4‑丙基‑二氢呋喃‑2‑酮，在此基础上经一步反应即可制备高光学纯度的布立西坦原料药。本发明提供的制备布立西坦路线避免了传统工艺中所用到的手性拆分和繁琐的分离提纯，适用于工业生产，具备显著的成本优势。

Description

一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其在布立西坦合成中的 应用
技术领域
本发明属于原料药合成技术领域，具体涉及一种Baeyer-Villiger单加氧酶及其在布立西坦合成中的应用。
背景技术
布立西坦(Brivaracetam)属于第三代抗癫痫药物，属于新型的突触囊泡蛋白2A(SV2A)高亲和性配体，同时对电压依赖性钠离子通道有一定的抑制作用。2016年，布立西坦获得FDA批准用于治疗癫痫发作，其对于全身性癫痫发作具有较好的疗效。
专利CN1882535A公布了一种布立西坦的化学合成制备方法，合成路线如下：
上述方法在合成得到布立西坦消旋体后，利用色谱柱对其进行光学异构体纯化分离，从而获得光学纯的布立西坦。但是上述合成方法需要丢弃至少一半的非对映异构体，原子经济性差。另外，由于色谱柱价格昂贵且进样量有限，各光学异构体物理性质相近。因此采用色谱柱分离纯化效果较差，批量处理能力小、工业放大成本高，难以实现低成本大规模生产。
中国医药工业研究总院周超的硕士论文《抗癫痫药布瓦西坦的合成研究》公布了一种布立西坦的合成制备方法，其合成路线如下：
上述合成方法存在以下缺点：(1)步骤繁琐；使用噁唑烷酮作为手性诱导基团，其价格较高，且要经历装配和脱除步骤，经济成本较高；(2)第二步需要-70℃的反应条件，反应条件较为苛刻，难以实现大规模生产；(3)第三步使用双氧水，作为过氧化物有爆炸风险；(4)第四步使用二甲硫醚硼烷，有爆炸风险，且具有刺鼻气味，有安全环保风险。
上述两种合成方法均为使用纯化学法制备布立西坦。现有技术中还存在将酶催化法和化学法相结合进而合成布立西坦的方法。例如，原研公司报道了一种布立西坦的合成制备方法，其合成路线如下：
上述合成方法存在以下缺点：(1)步骤繁琐，线性步骤长达9步，才可制得终产物布立西坦；(2)关键步骤酶催化制备关键中间体，收率仅为42％，对映体过量百分数仅为97.7％，(3)由此异构体出发得到的终产物布立西坦，对映体过量百分数仅为95.9％，难以满足药用要求。
因此需要提供一种发展高效、低成本、环境友好以及手性纯度高的合成布立西坦的工艺路线。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供给了一种Baeyer-Villiger单加氧酶以及利用该酶合成布立西坦的方法。本发明中利用所述Baeyer-Villiger单加氧酶合成布立西坦的工艺路线具有发展高效、低成本和环境友好等优点；且由此路线生产的布立西坦原料药杂质少、手性纯度高和成本低廉。
为此，本发明第一方面提供了一种Baeyer-Villiger单加氧酶，其选自下组中所述多肽中的任意一种；
(A)具有SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽；
(B)具有与SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5中任一所示氨基酸序列至少80％，优选至少90％，更优选至少95％同源性的多肽，且具有SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽的催化活性；
(C)将SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的多肽，且保留SEQ IDNo:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽的催化活性。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述Baeyer-Villiger单加氧酶选自具有SEQID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽中的任意一种；优选选自具有SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽中的任意一种；更优选选自具有SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的一些实施方式中，所述催化活性为催化底物3-丙基环丁酮反应合成化合物(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。相应的反应式如下：
本发明中利用上述Baeyer-Villiger单加氧酶催化3-丙基取代环丁酮的不对称Baeyer-Villiger反应，产物是R构型。
本申请的发明人，在众多的Baeyer-Villiger单加养酶(BVMO)中筛选到能够催化3-丙基取代环丁酮生成R构型产物的酶。具体地，从如下酶中筛选：BVMO-P1-C06、BVMO-P1-C08、BVMO-P3-A10、BVMO-P3-A12、BVMO-P3-C07、CDX-003、CHMO from A.calcoaceticus、CAMO from C.radicicola、STMO from R.rhodochrous、CHMO from Xanthobacter sp.、CHMO from Brachymonas、CHMO from Brevibacterium、typ1、CPMO from Comamonas、CHMOfrom Acinetobacter sp.、CHMO from Arthrobacter sp.、CHMO from Rhodococcus.。考虑产物构型和反应转化率，优选CHMO from Acinetobacter sp.(CHMOAcineto)，然后进行酶的理性设计和定点突变，进而获得了本申请所述的Baeyer-Villiger单加氧酶。
具体的突变体构建方式为：通过分子动力学模拟构建5个饱和突变库，包括：A(143，144，145)、B(243，244，245)、C(276，277，278)、D(280，281，282)和E(431，432，433)。进行定点突变，获得优势突变体L143A、L143V、L244G、L244A、F277P、F277V、F277W、F432L和F432I。进行迭代组合突变，包括但不限于任意两个组合或任意三个组合或任意四个组合或任意五个组合或任意六个组合，筛选出五个优势突变体：L143A/L244A、L143V/F277V、L244A/F432I、L143V/L244A/F432I、L244G/F277V/F432L，分别为具有SEQ ID No:1、SEQ IDNo:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5所示氨基酸序列的多肽。
本发明第二方面提供了一种制备如本发明第一方面所述的Baeyer-Villiger单加氧酶的方法，其包括如下步骤：
S1，构建包含编码所述Baeyer-Villiger单加氧酶的基因的表达系统；
S2，诱导所述表达系统表达所述的Baeyer-Villiger单加氧酶。
在本发明的一些实施方式中，所述诱导的方式为：在所述表达系统的培养液中加入诱导物；优选地，所述诱导物为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；进一步优选地，所述诱导物在所述培养液中的浓度为0.1-0.5mM，例如为0.2mM。
本发明中，所述培养液可以为LB液体培养基，其组成和制备方法为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min。
在本发明的一些实施方式中，所述表达系统为大肠杆菌BL21。在本发明的一些具体实施方式中，所述大肠杆菌BL21可以为大肠杆菌BL21(D3)。
在本发明的另一些实施方式中，所述表达的温度为16～25℃，表达的时间为16～24h。在本发明的一些具体实施方式中，所述表达的温度可以为20℃，表达的时间可以为20h。
在本发明的一些具体实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
(1)将野生型Baeyer-Villiger单加氧酶基因(CHMOAcineto基因)插入pEt-22b(+)质粒多克隆位点区的限制性酶切位点Nde I和BamH I之间，获得携带野生型CHMOAcineto基因的质粒；
(2)根据所述Baeyer-Villiger单加氧酶的各突变位点设计引物，以野生型CHMOAcineto基因的质粒为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行定点突变，获得包括编码所述Baeyer-Villiger单加氧酶的基因的质粒；
(3)将步骤(2)获得的质粒经CaCl2法转化至大肠杆菌BL21(D3)中以获得表达系统，用于蛋白表达；转化至大肠杆菌DH5中用于质粒扩增。
(4)转化后涂布，氨苄青霉素抗性用于阳性克隆筛选。挑单菌落于一级LB培养液中37℃进行培养，待OD600至0.6-0.8时，取一级种子液按照1％接种量接至二级种子液，37℃继续进行发酵培养，待OD600至0.2-0.3时，加入IPTG(0.1-0.5mM)诱导目的基因的可溶性表达，表达温度为16-25℃，表达时间为16-24h。
(5)表达后，冷冻离心弃去培养液，按50mg/mL将湿菌体溶于50mM PB缓冲液(pH＝7.4)。
本发明中，可以直接利用上述包含湿菌体的缓冲溶液于25℃与底物(3-丙基环丁酮)进行全细胞反应。反应完全后，超声细胞破碎仪进行细胞破碎，离心，加入乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩即得(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。
本发明第三方面提供了一种利用如本发明第一方面所述的Baeyer-Villiger单加氧酶或者第二方面所述方法制备的Baeyer-Villiger单加氧酶合成布立西坦中间体的方法，所述布立西坦中间体为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括：使包括Baeyer-Villiger单加氧酶和3-丙基环丁酮(化合物1)的反应体系发生Baeyer-Villiger插氧反应，生成布立西坦中间体(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮(化合物2)。相应的反应式如下：
经由本发明所述方法合成的关键中间体(化合物2)可制备高光学纯度的布立西坦原料药。
在本发明的一些具体实施方式中，使包括表达Baeyer-Villiger单加氧酶的湿菌体的缓冲溶液和3-丙基环丁酮(化合物1)的全细胞反应体系发生Baeyer-Villiger插氧反应，进而合成生成布立西坦中间体(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮(化合物2)。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度为20～25℃，所述反应的时间为5～8h。在本发明的一些具体实施方式中，所述反应的温度可以为25℃，所述反应的时间可以为8h。本发明中，3-丙基环丁酮(化合物1)可以通过下述工艺路线进行合成：
具体的反应步骤为：
(1)在锌粉催化下，1-戊烯(化合物3)和三氯乙酰氯(化合物4)反应生成2,2-二氯-3-丙基-1-环丁酮(化合物5)；
(2)在锌粉催化下，2,2-二氯-3-丙基-1-环丁酮(化合物5)在酸性条件下生成3-丙基环丁酮(化合物1)。
在本发明的一些实施方式中，所述反应体系中还包括葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
本发明中，Baeyer-Villiger单加氧酶是FAD/NADPH辅酶双依赖型酶，催化循环由NADPH被氧化成NADP+启动。随着反应的进行，反应体系中NADP+将会蓄积，导致催化反应停止。因此，通过在体系中添加GDH(葡萄糖脱氢酶)或FDH(甲酸脱氢酶)构建辅酶循环体系将NADP+还原为NADPH，在Baeyer-Villiger单加氧酶自身酶活力提高的基础上，进一步提高催化性能，实现(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮的公斤级制备。
可以通过与GDH(葡萄糖脱氢酶)或FDH(甲酸脱氢酶)共表达，构建辅酶NADP+循环系统。在得到优势突变体后，进行了BtGDH共表达及催化反应的初步尝试。在Baeyer-Villiger单加氧酶优势突变体-BtGDH共催化下，底物浓度可提高至80～120mM，以85～100％的收率得到(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，且保持高对映选择性(99.9％ee)。
本发明第四方面提供了一种合成布立西坦的方法，其包括：将如本发明第三方面所述方法合成的布立西坦中间体(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮(化合物2)与L-2-氨基丁酰胺进行反应，进而合成所述布立西坦(化合物6)。相应的反应路线为：
本发明中，上述反应在高温条件下进行。在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度为90～100℃，时间为5～8小时。
本发明中，上述反应在有机溶剂中进行，所述有机溶剂选自甲苯和DMF(二甲基甲酰胺)中的至少一种，优选为同时包括甲苯和DMF的混合有机溶剂。所述混合有机溶剂中，甲苯和DMF的体积比可以为1:(1～3)，优选为1:2。
本发明中，上述反应中(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮(化合物2)与L-2-氨基丁酰胺的用量为本领域的常规用量，本领域的技术人员可以进行常规选择。一般地，上述反应中(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮(化合物2)与L-2-氨基丁酰胺的摩尔量为1:1左右。
布立西坦合成的关键技术难点为呋喃酮4-位手性碳的建立。已有的路线采取的方法包括：
(1)合成消旋体后，柱层析分离：此路线需要丢弃至少一半的非对映异构体，原子经济性差；柱层析分离难度大，工业放大生产成本高。
(2)噁唑烷酮作为手性诱导基团：步骤繁琐，反应条件苛刻；噁唑烷酮价格较高，且要经历装配和脱除步骤，成本较高。
(3)原研公司报道的酶催化方法：所制得的终产物，手性纯度过低，难以满足药用要求。
本发明的发明人通过研究，发展了将Baeyer-Villiger单加氧酶用于布瓦西坦中间体合成的酶催化方法。在此基础上获得了一种环境友好、收率高、成本低的合成布立西坦中间体的方法，进而制备布立西坦原料药。本发明的技术特点为：经Baeyer-Villiger单加氧酶催化，经济高效、绿色环保地合成(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，在此基础上由(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮经一步反应即可制备高光学纯度的布立西坦原料药。通过本发明仅经4步，即可制备得到满足药用要求的布立西坦原料药，此路线避免了传统工艺中所用到的手性拆分和繁琐的分离提纯，适用于工业生产，具备显著的成本优势。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著的《分子克隆实验室指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
实施例1：3-丙基环丁酮(化合物1)的制备
工艺路线如下：
将三氯乙酰氯(2.24mL，20mmol)与三氯氧磷(1.02mL,11.0mmol)溶于乙醚(10mL)中，之后将此溶液缓慢滴入装有1-戊烯(1.09mL，10mmol)、乙醚(20mL)和锌铜试剂(Zinc-Copper couple，CAS#:53801-63-1,1.96g，30.0mmol)的烧瓶中。加热到40℃搅拌反应2小时，之后自然冷却到室温搅拌反应8小时。之后将此溶液用硅藻土过滤，滤液中加入正己烷80mL以沉淀出氯化锌盐。过滤得到澄清溶液，再用水，饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水依次洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，蒸除溶剂。得淡黄色油状物5(1.69g)，收率94％，直接进行下一步反应。
将化合物5(1.69g)溶于醋酸10mL中，加入锌粉2.4g，室温搅拌反应2小时，之后升温至100C反应6小时。冷却至室温后加入水20mL稀释，之后使用乙醚(20mL)萃取。有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，溶液过硅胶闪柱之后得无色油状物1(0.97g)，收率92％，直接进行下一步反应。
实施例2：Baeyer-Villiger单加氧酶的制备
1.1酶基因的获取
选取CHMO from Acinetobacter sp.(CHMOAcineto)，进行酶的理性设计和定点突变。根据NCBI检索到的上述单加氧酶序列，全合成野生型CHMO from Acinetobacter sp.单加氧酶基因(CHMOAcineto基因)。
2.2酶基因的构建和转化
将步骤1.1合成的CHMOAcineto基因插入pEt-22b(+)质粒多克隆位点区的限制性酶切位点Nde I和BamH I之间，获得携带野生型CHMOAcineto基因的质粒。根据序列1-5所示氨基酸序列的蛋白的各突变位点分别设计引物，以野生型CHMOAcineto基因的质粒为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行定点突变，获得分别编码具有序列1-5所示氨基酸序列的蛋白的Baeyer-Villiger单加氧酶的基因的质粒。将上述质粒经CaCl2法分别转化至大肠杆菌BL21(D3)中培养，用于蛋白表达。
2.3酶基因的表达
LB液体培养基配制：按照蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC1 10g/L的组成，用去离子水溶解相应组分后定容，121℃灭菌20min，待用。
转化后涂布，氨苄青霉素抗性用于阳性克隆筛选。挑单菌落于一级LB培养液中37℃进行培养，待OD600至0.6～0.8时，取一级种子液按照1％接种量接至二级种子液，37℃继续进行发酵培养，待OD600至0.2～0.3时，加入IPTG(0.2mM)诱导目的基因的可溶性表达，表达温度为20℃，表达时间为20h。
表达后，冷冻离心弃去培养液，按50mg/mL将湿菌体溶于50mM PB缓冲液(pH＝7.4)，获得分别包括上述5种Baeyer-Villiger单加氧酶的全细胞缓冲溶液，存于–20-0℃，备用。
实施例3：(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮(化合物2)的制备
工艺路线如下：
在500mL锥形瓶中加入100mL实施例2中获得的全细胞缓冲溶液与100mmol环酮底物，反应8h后，超声细胞破碎仪破碎细胞，离心，用乙酸乙酯(100mL*3)萃取，合并有机相将萃取液旋蒸抽去溶剂，含有0.2mg/mL十二烷的乙酸乙酯再次溶解，萃取液用气象色谱检测产物产率以及对映体过量值，结果如表1所示。
表1
酶种类 转化率(％) 产物ee值(％)
L143A/L244A(SEQ ID No:1) 98.9 99.7
L143V/F277V(SEQ ID No:2) 99.2 99.8
L244A/F432I(SEQ ID No:3) 99.1 99.9
L143V/L244A/F432I(SEQ ID No:4) 99.5 99.9
L244G/F277V/F432L(SEQ ID No:5) 99.5 99.9
从表1可知，采用本发明的Baeyer-Villiger单加氧酶合成(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮，具有很高的转化率，且获得的日标产物ee值可达99％。
实施例4：布立西坦(化合物6)的制备
工艺路线如下：
称量10g化合物2溶于甲苯：DMF混合溶剂20ml:40ml中，室温下加入L-2-氨基丁酰胺10.37g。升温反应至100℃搅拌6小时。经HPLC监测，化合物2反应完全。减压浓缩蒸除溶剂，得粘稠油状粗品。将粗品溶于二氯甲烷60ml中，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。经正庚烷：乙酸异丙酯1:1重结晶，即可得高纯度布立西坦(化合物6)12.4g，产物液相纯度高达99.92％。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
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<213> 人工序列（L143A/L244A）
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Met Ser Gln Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Val Gln Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Ala Gly Thr Trp Tyr Trp
35 40 45
Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys
50 55 60
Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Leu Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu
85 90 95
Lys His Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Gln Ser
100 105 110
Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr
115 120 125
Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Leu Gly Ala Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Asn Leu Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly
145 150 155 160
Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Phe Glu Gly
165 170 175
Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile
180 185 190
Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser
195 200 205
Ala Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Asp Pro Leu Ser Glu Glu Asp
210 215 220
Val Lys Lys Ile Lys Asp Asn Tyr Asp Lys Ile Trp Asp Gly Val Trp
225 230 235 240
Asn Ser Ala Ala Ala Phe Gly Leu Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met
245 250 255
Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Lys Ala Val Phe Glu Lys Ala Trp Gln
260 265 270
Thr Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ala
275 280 285
Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys
290 295 300
Ile Ala Glu Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro
305 310 315 320
Gln Asp Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn
325 330 335
Thr Phe Asn Arg Asp Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro
340 345 350
Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe
355 360 365
Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Val Asp
370 375 380
Gly Asn Tyr Val Arg Met Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Met
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Thr Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Leu Gly Pro Asn Gly Pro Phe
420 425 430
Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Asp
435 440 445
Thr Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Thr
450 455 460
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465 470 475 480
Met Thr Leu Phe Pro Lys Ala Gln Ser Trp Ile Phe Gly Ala Asn Ile
485 490 495
Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Phe Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu
500 505 510
Tyr Arg Ser Ala Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Glu Gly Phe
515 520 525
Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ile Lys Gln Pro Ala Asn Ala
530 535 540
<210> 2
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列（L143V/ F277V）
<400> 2
Met Ser Gln Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Val Gln Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Ala Gly Thr Trp Tyr Trp
35 40 45
Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys
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Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Leu Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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355 360 365
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370 375 380
Gly Asn Tyr Val Arg Met Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Met
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Thr Val
405 410 415
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465 470 475 480
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515 520 525
Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ile Lys Gln Pro Ala Asn Ala
530 535 540
<210> 3
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列（L244A/F432I）
<400> 3
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1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Val Gln Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Ala Gly Thr Trp Tyr Trp
35 40 45
Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys
50 55 60
Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Leu Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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260 265 270
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275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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515 520 525
Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ile Lys Gln Pro Ala Asn Ala
530 535 540
<210> 4
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列（L143V/L244A/F432I）
<400> 4
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1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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325 330 335
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Thr Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Leu Gly Pro Asn Gly Pro Ile
420 425 430
Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Asp
435 440 445
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Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ile Lys Gln Pro Ala Asn Ala
530 535 540
<210> 5
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列（L244G/F277V/F432L）
<400> 5
Met Ser Gln Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
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Ser Ala Pro Asn Leu Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly
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Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Phe Glu Gly
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Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser
195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe
355 360 365
Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Val Asp
370 375 380
Gly Asn Tyr Val Arg Met Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Met
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Thr Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Leu Gly Pro Asn Gly Pro Leu
420 425 430
Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Asp
435 440 445
Thr Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Thr
450 455 460
Lys Glu Ala Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Ala Asn Ile Ala Glu
465 470 475 480
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485 490 495
Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Phe Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu
500 505 510
Tyr Arg Ser Ala Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Glu Gly Phe
515 520 525
Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Ile Lys Gln Pro Ala Asn Ala
530 535 540

Claims (15)

1.一种Baeyer-Villiger单加氧酶，其选自下组中所述多肽中的任意一种，氨基酸序列如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的Baeyer-Villiger单加氧酶，其特征在于，所述Baeyer-Villiger单加氧酶选自氨基酸序列如SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4或SEQ IDNo:5所示的多肽中的任意一种。
3.根据权利要求2所述的Baeyer-Villiger单加氧酶，其特征在于，所述Baeyer-Villiger单加氧酶选自氨基酸序列如SEQ ID No:4或SEQ ID No:5所示的多肽。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的Baeyer-Villiger单加氧酶，其特征在于，所述催化活性为催化底物3-丙基环丁酮反应合成化合物(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。
5.一种制备如权利要求1-4中任意一项所述的Baeyer-Villiger单加氧酶的方法，其包括如下步骤：
S1，构建包含编码所述Baeyer-Villiger单加氧酶的基因的表达系统；
S2，诱导所述表达系统表达所述的Baeyer-Villiger单加氧酶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导的方式为：在所述表达系统的培养液中加入诱导物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导物为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导物在所述培养液中的浓度为0.1-0.5mM。
9.根据权利要求5-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述表达系统为大肠杆菌BL21；和/或
所述表达的温度为16～25℃，表达的时间为16～24h。
10.一种利用如权利要求1-4中任意一项所述的Baeyer-Villiger单加氧酶或者权利要求5-9中任意一项所述方法制备的Baeyer-Villiger单加氧酶合成布立西坦中间体的方法，所述布立西坦中间体为(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法包括：使包括Baeyer-Villiger单加氧酶和3-丙基环丁酮的反应体系发生Baeyer-Villiger插氧反应，生成布立西坦中间体(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：所述反应的温度为20～25℃，所述反应的时间为5～8小时。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述反应体系中还包括葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
14.一种合成布立西坦的方法，其包括：如权利要求1-4中任意一项所述的Baeyer-Villiger单加氧酶或者权利要求5-9中任意一项所述方法制备的Baeyer-Villiger单加氧酶和3-丙基环丁酮发生Baeyer-Villiger插氧反应，合成的布立西坦中间体(R)-4-丙基-二氢呋喃-2-酮与L-2-氨基丁酰胺进行反应，进而合成所述布立西坦。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为90～100℃，时间为5～8小时。
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