CN109971802B - 一种酶法拆分制备(s)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶法拆分制备(S)‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸及其衍生物的新方法，所述方法为：以外消旋1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸(1)或外消旋6,7‑二甲氧基‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸(2)为底物，利用离体的D‑氨基酸氧化酶或胞内表达D‑氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，选择性催化(R)‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸或(R)‑6,7‑二甲氧基‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸的氧化脱氢反应，(S)‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸或(S)‑6,7‑二甲氧基‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸未被催化，保留在反应体系中，由此制备获得(S)‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸或(S)‑6,7‑二甲氧基‑1,2,3,4‑四氢异喹啉‑1‑甲酸。本发明方法转化率>49％，ee值>99％，具有反应条件温和、立体选择性强、反应效率高、工艺相对简单等特点。

Description

一种酶法拆分制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法
技术领域
本发明涉及一种酶法拆分制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的新方法。
背景技术
1,2,3,4-四氢异喹啉类化合物是一类非常重要的药物中间体，被广泛应用于多种药物的合成。近年来，Hu等(Discovery of a small-molecule inhibitor and cellularprobe of Keap1-Nrf2 protein-protein interaction[J].Bioorg Med Chem Lett,2013,23(10):3039-43.)以(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸为起始化合物，合成一种靶向Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)的抑制剂，从而有望用于癌症，糖尿病，阿尔兹海默症，帕金森等疾病的治疗和预防。而大部分具有药用价值的异喹啉碱都含有6，7-二甲氧基(如罂粟碱、吐根碱等)，有利于降低药物分子的疏水性，提高成药性，如6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
现有技术中，制备光学纯(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的方法主要为化学手性合成法。化学手性合成法从手性原料出发合成(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸，如Kurata等光学纯烯烃异喹啉为起始原料经臭氧分解和NaBH4原位还原、四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)氧化以及三氟乙酸介导的N-叔丁氧羰基去保护作用三步不对成合成(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸(Synthesis of Optically Pure(R)-and(S)-Tetrahydroisoquinoline-1-and-3-Carboxylic Acids[J].Synthesis,2015,47(09):1238-44.)。该法产率低，步骤繁琐，不适于工业化应用。
现有技术中，制备光学纯(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的方法有化学手性合成和生物催化手性拆分二种。
Figure BDA0001528794250000011
等采用Petasis反应和Pomeranz–Fritsch–Bobbitt反应非对映体选择性全合成(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸，ee值为90％(Synthesis of(+)-6,7-Dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic Acid,a Diastereoselective Approach[J].European Journal ofOrganic Chemistry,2015,2015(2):383-8.)。Paál等利用枯草杆菌蛋白酶动态动力学拆分6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸乙酯制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸，53.46g/L底物，加酶量为80g/L固定化酶，3℃，pH8.5条件下，反应3天，转化率达99％，产物ee值为93％(Directed(R)-or(S)-Selective Dynamic Kinetic EnzymaticHydrolysis of 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline-1-carboxylic Esters[J].EuropeanJournal of Organic Chemistry,2008,2008(31):5269-76)。该法反应条件温和，立体选择性强，工艺相对简单，但所得产物的光学纯度还有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法。该方法反应条件温和、立体选择性强、反应效率高、工艺相对简单等特点，具有工业化应用前景。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种酶法拆分制备如式(I)所示的化合物的方法，
Figure BDA0001528794250000021
式(I)中，R1，R2独立地选自氢、C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，所述方法包括：
(1)以所述式(I)化合物的外消旋体或式(I)化合物的盐的外消旋体为底物，利用离体的D-氨基酸氧化酶或胞内表达D-氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，选择性催化式(I)化合物的R型异构体进行氧化脱氢反应，而式(I)化合物未被催化，保留在反应体系中；
(2)将所述式(I)化合物与反应体系分离，即得。
进一步地，式(I)中，R1，R2独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、甲氧基或乙氧基。
优选地，所述的盐为一价盐，具体优选碱金属盐或铵盐，其中碱金属盐可以为例如锂盐、钠盐、钾盐。
根据本发明的优选方面，式(I)所述的化合物为(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
根据本发明，所述D-氨基酸氧化酶优选为选自如下D-氨基酸氧化酶中的一种或多种的组合：来源于三角酵母(Trigonopsis variabilis)CBS 4095的D-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它D-氨基酸氧化酶、来自禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)CS3005的D-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它D-氨基酸氧化酶、来自梨孢镰刀菌(Fusarium poae)2516的D-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它D-氨基酸氧化酶，来自茄病镰刀菌(Fusarium solani)M-0718的D-氨基酸氧化酶或其突变体或与其氨基酸序列同源性大于80％的其它D-氨基酸氧化酶。
进一步优选地，所述D-氨基酸氧化酶具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
作为本发明的一种优选实施方案：所述细胞为表达D-氨基酸氧化酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
具体地，所述工程菌含有表达载体pET-28a(+)，所述D-氨基酸氧化酶基因连接在表达载体pET-28a(+)上。
进一步地，步骤(1)中，首先构建反应体系，然后控制反应体系处于设定温度和有氧环境中进行所述氧化脱氢反应，其中所述反应体系包含所述底物、pH缓冲溶液和/或pH调节剂以及所述催化剂。
优选地，步骤(1)中，所述反应体系中，起始底物的浓度为1～20g/L，反应体系的pH为6～9；所述的催化剂为含有所述离体的D-氨基酸氧化酶的粗酶液或胞内表达D-氨基酸氧化酶的细胞或者纯酶或者固定化酶；所述设定温度为20～70℃。
进一步地，所述催化剂的添加量以8000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量一般为反应体系重量的1～5％。
优选地，步骤(1)中，所述设定温度为30～50℃，所述反应体系的pH值为7～8。
优选地，步骤(1)中，所述反应体系中含有辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。使反应在FAD存在下进行，有助于进一步提高转化率。进一步地，FAD与所述的底物等当量或者是过量的。一般情况下，所制备的D-氨基酸氧化酶的粗酶液中已经含有足够量的FAD，在直接采用粗酶液的情况下，无需再另外添加FAD。在使用D-氨基酸氧化酶纯酶的情况下，可以根据需要再外加适量的FAD。
根据本发明的一个具体且优选方面，所述pH缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
根据本发明，所述的pH调节剂优选为氨水、碱金属氢氧化物或其水溶液。
根据本发明的一个具体且优选方面，所述的pH调节剂为20wt％～35wt％氨水。
根据本发明的再一具体方面，所述的pH调节剂为氢氧化钠或氢氧化钾的水溶液。
进一步地，步骤(2)中，将反应体系的pH值调至5.0-6.0，加热使蛋白变性析出，抽滤，滤液浓缩后，冷却析晶，干燥，即得所述式(I)所示的化合物。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明意外发现D-氨基酸氧化酶可高效选择性催化(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(R)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸等进行氧化脱氢反应，而对于(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸基本无催化作用。采用本发明方法来制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸，反应效率高(5g/L的底物，2g/L干细胞或相对应的粗酶液，反应30～48小时，转化率>49％)，反应条件温和，立体选择性强(ee值>99％)，工艺简单。
附图说明
图1为底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的两个光学异构体高效液相检测图谱(1g/L)；
其中，保留时间8.810min为(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；保留时间12.685min为(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸；
图2为实施例3中反应体系中0小时取样的高效液相检测图谱；
图3为实施例3中反应体系中反应30小时取样的高效液相检测图谱。
具体实施方式
本发明提供一种制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的新方法，以外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸为底物(或氨盐)为底物，利用离体的D-氨基酸氧化酶或胞内表达D-氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，进行氧化脱氢反应，获得(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
具体原理为：以外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸(1)或外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸(2)为底物，利用D-氨基酸氧化酶立体选择性催化(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(R)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的氧化脱氢生成相应的亚胺酸，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸未被催化保留在反应体系中。反应过程示意如下：
Figure BDA0001528794250000041
进一步地，优选使反应在辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)存在下进行，在催化过程中，辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)被还原为FADH2，随后，一分子氧被还原为过氧化氢(H2O2)，而FADH2则被氧化为FAD，反应过程示意如下：
Figure BDA0001528794250000042
作为优选，所述D-氨基酸氧化酶来源于三角酵母、禾谷镰刀菌、梨孢镰刀菌、茄病镰刀菌。具体的，所述D-氨基酸氧化酶来源于三角酵母(Trigonopsis variabilis)CBS4095、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)CS3005、梨孢镰刀菌(Fusarium poae)2516或茄病镰刀菌(Fusarium solani)M-0718。作为优选，所述细胞为表达D-氨基酸氧化酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。具体地，所述工程菌含有表达载体pET-28a(+)，所述D-氨基酸氧化酶基因连接在表达载体pET-28a(+)上。
反应体系中，催化剂的使用形式为粗酶液，或者表达重组酶的工程菌静息细胞，或者是纯酶，或者固定化酶。
作为优选，催化体系中底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的浓度为1～20g/L。
作为优选，催化体系中，催化剂的添加量以8000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应液重量的1～5％。
作为优选，催化体系中，反应的温度为20～70℃，时间为6～72小时，反应液的pH值为6～9；更优选，温度为30～50℃，时间为12～48小时。磷酸缓冲溶液控制反应的pH值为7～8。
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
本发明实施例中所用基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。E.coliBL21(DE3)菌种购自Novagen公司；DNA marker、PrimeStar DNA聚合酶、低分子量标准蛋白等分子生物学实验试剂购自TaKaRa。基因克隆及表达具体操作可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析催化反应的各个产物和底物。外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的HPLC分析方法为：色谱柱/
Figure BDA0001528794250000052
ZWIX(-)；柱温/25℃；流速/0.4mL/min；检测波长/UV220nm；流动相：HPLC级甲醇(加入50mM甲酸和25mM二已胺)。具体各相关物质出峰情况见附图1。外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的HPLC分析方法为：色谱柱/Chirobiotic TAG；柱温/25℃；流速/0.8mL/min；检测波长/UV220nm和232nm；流动相：HPLC级甲醇/水(1:1)(Directed(R)-or(S)-Selective DynamicKinetic Enzymatic Hydrolysis of 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline-1-carboxylicEsters[J].European Journal of Organic Chemistry,2008,2008(31):5269-76)。
实施例1 基因工程菌菌种构建
1.1 D-氨基酸氧化酶的筛选及表达D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建
根据底物特异性的不同，微生物来源的D-氨基酸氧化酶可分为两大类:1)偏好侧链基团较小的氨基酸(如D-丙氨酸),如尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)来源的DAAO；2)偏好侧链基团较大的氨基酸(如D-苯丙氨酸)，如三角酵母(Trigonopsis variabilis)来源的DAAO(POLLEGIONI L,MOLLA G,SACCHI S,et al.Properties and applications ofmicrobial D-amino acid oxidases:current state and perspectives[J].ApplMicrobiol Biotechnol,2008,78(1):1-16.)。分别将这两种D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行BLASTp分析，选取序列一致性不同的4种D-氨基酸氧化酶作进一步研究(如表1所示)。
表1 四种不同来源的D-氨基酸氧化酶
Figure BDA0001528794250000051
Figure BDA0001528794250000061
将上述D-氨基酸氧化酶基因序列经密码子优化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a(+)上。重组质粒转入表达宿主E.coli BL21(DE3)中，经测序验证无误后，向所得工程菌菌液中加入终浓度为25％的甘油并置于-80℃保藏备用。
实施例2
2.1微生物的培养
液体LB培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。若为固体LB培养基，则另加15g/L琼脂。
将含有D-氨基酸氧化酶基因的工程菌接种于5mL液体LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃，200rpm振荡培养8h左右。按1％(V/V)的接种量接种于50mL液体LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中培养，OD600达到0.6-0.8后，加入诱导剂IPTG(终浓度为0.1mM)，18℃诱导15h。培养结束后，将培养液倒入100mL离心管中4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体细胞，用50mM磷酸缓冲液(pH 8.0)洗涤细胞两次，之后，放于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
2.2粗酶液的制备
将菌体重悬于50mM磷酸缓冲液(pH 8.0)中，超声破碎菌悬液，离心后得到的上清为含D-氨基酸氧化酶的粗酶液。
2.3 HPLC法检测反应体系中各对映体含量
反应体系(1ml)：10g/L E1、E2、E3或E4湿菌体(超声波破碎)，5g/L底物外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸，反应介质为pH 8.0磷酸盐缓冲液。将配好的反应体系置于30℃金属浴振荡反应器内反应10min。磷酸盐缓冲液(pH 8.0)代替粗酶液的反应体系作为对照。样品经流动相稀释10倍后用HPLC进行定性分析。
结果表明：与对照相比，E1、E2、E3以及E4能够立体选择性催化(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(R)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸反应，而(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸含量基本保持不变。
实施例3 FsDAAO(E2)制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液pH至8.0。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FsDAAO粗酶液(粗酶液中已含有足量辅酶FAD，因此，粗酶液反应体系中不需额外添加FAD)。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。
检测结果如图2和图3所示，FsDAAO表现出严格的R-构型立体选择性，转化率为49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例4 FgDAAO(E3)制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FgDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。检测结果为转化率49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例5 FpDAAO(E4)制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FpDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。检测结果为转化率49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例6 TvDAAO(E1)制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
按实施例3的方法配制底物溶液。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL TvDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0h”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应36小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。检测结果为转化率49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例7 FsDAAO(E2)制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液pH至8.0。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FsDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应40小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.8％，(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例8 FgDAAO(E3)制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
按实施例7的方法配制底物溶液。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FgDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应40小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％，(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例9 FpDAAO(E4)制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
按实施例7的方法配制底物溶液。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FpDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应40小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％，(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例10 TvDAAO(E1)制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
按实施例7的方法配制底物溶液。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL TvDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应48小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.8％，(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例11 纯酶FsDAAO(E2)制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液pH至8.0。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入FsDAAO纯酶液以及黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐，并用磷酸盐缓冲溶液(50mM,pH＝8.0)将反应总体积补到2ml，FsDAAO纯酶的终浓度为0.64mg/ml，FAD终浓度为100μM。混匀后，取出10μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应2小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例12 纯酶FsDAAO(E2)制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液pH至8.0。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入FsDAAO纯酶液以及黄素腺嘌呤二核苷酸钠盐，并用磷酸盐缓冲溶液(50mM,pH＝8.0)将反应总体积补到2ml，FsDAAO纯酶的终浓度为0.72mg/ml，FAD终浓度为100μM。混匀后，取出10μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应2小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％，(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例13 FsDAAO(E2)大反应体系制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)配置10g/L的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液pH至8.0。
向反应器中加入200mL底物溶液，200mL FsDAAO粗酶液。混匀后，置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后，将反应体系的pH值调至5.0-6.0。99℃水浴，待蛋白变性析出后，抽滤。取滤液于65℃条件下旋蒸，将反应体积浓缩5倍。置于冰上，冷却后，抽滤。将析出的白色晶体，小心刮下，置于烘箱中，烘干并称重。称取0.25g白色烘干晶体，用50mM磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)定容至50ml。高效液相色谱检测所取样品中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上，产率为85.2％。
实施例14 FsDAAO(E2)大反应体系制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用30％氨水调节溶液pH至8.0。
向反应器中加入200mL底物溶液，200mL FsDAAO粗酶液。混匀后，置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后，将反应体系的pH值调至5.0-6.0。99℃水浴，待蛋白变性析出后，抽滤。取滤液于65℃条件下旋蒸，将反应体积浓缩5倍。置于冰上，冷却后，抽滤。将析出的白色晶体，小心刮下，置于烘箱中，烘干并称重。称取0.25g白色烘干晶体，用50mM磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)定容至50ml。高效液相色谱检测所取样品中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。转化率为49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上，产率为83.2％。
实施例15 FsDAAO(E2)制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用5M氢氧化钠溶液调节底物溶液pH至8.0。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FsDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应30小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。检测结果为转化率49.9％，(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
实施例16 FgDAAO(E3)制备(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸
底物溶液的配制：用50mM的磷酸盐缓冲溶液(pH＝8.0)配置10g/L的外消旋6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸溶液并用5M氢氧化钾溶液调节底物溶液pH至8.0。
取1ml底物溶液加入到5mL反应管中，再加入1mL FgDAAO粗酶液。混匀后，取出50μL，作为“0小时”并进行HPLC分析。将反应管置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌，反应40小时。反应结束后用HPLC法检测反应体系中6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸两种构型的含量。检测结果为转化率49.8％，(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸的ee值达99％以上。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 苏州同力生物医药有限公司
<120> 一种酶法拆分制备(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸及其衍生物的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 361
<212> PRT
<213> 人(Homo)
<400> 1
Met Ser Asn Thr Ile Val Val Val Gly Ala Ile Val Ser Gly Leu Thr
1               5                   10                  15
Ser Ala Leu Leu Leu Ser Lys Asn Lys Gly Asn Lys Ile Thr Val Val
            20                  25                  30
Ala Lys His Met Pro Gly Asp Tyr Asp Val Glu Tyr Ala Ser Pro Phe
        35                  40                  45
Ala Gly Ala Asn His Ser Pro Met Ala Thr Glu Glu Ser Ser Glu Trp
    50                  55                  60
Glu Arg Arg Thr Trp Tyr Glu Phe Lys Arg Leu Val Glu Glu Val Pro
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Val His Phe Gln Lys Ser Arg Ile Gln Arg Arg Asn Val
                85                  90                  95
Asp Thr Glu Lys Ala Gln Arg Ser Gly Phe Pro Asp Ala Leu Phe Ser
            100                 105                 110
Lys Glu Pro Trp Phe Lys Asn Met Phe Glu Asp Phe Arg Glu Gln His
        115                 120                 125
Pro Ser Glu Val Ile Pro Gly Tyr Asp Ser Gly Cys Glu Phe Thr Ser
    130                 135                 140
Val Cys Ile Asn Thr Ala Ile Tyr Leu Pro Trp Leu Leu Gly Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Lys Asn Gly Val Ile Val Lys Arg Ala Ile Leu Asn Asp Ile Ser
                165                 170                 175
Glu Ala Lys Lys Leu Ser His Ala Gly Lys Thr Pro Asn Ile Ile Val
            180                 185                 190
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ser Tyr Lys Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys
        195                 200                 205
Thr Met Ala Pro Ala Arg Gly Gln Ile Val Val Val Arg Asn Glu Ser
    210                 215                 220
Ser Pro Met Leu Leu Thr Ser Gly Val Glu Asp Gly Gly Ala Asp Val
225                 230                 235                 240
Met Tyr Leu Met Gln Arg Ala Ala Gly Gly Gly Thr Ile Leu Gly Gly
                245                 250                 255
Thr Tyr Asp Val Gly Asn Trp Glu Ser Gln Pro Asp Pro Asn Ile Ala
            260                 265                 270
Asn Arg Ile Met Gln Arg Ile Val Glu Val Arg Pro Glu Ile Ala Asn
        275                 280                 285
Gly Lys Gly Val Lys Gly Leu Ser Val Ile Arg His Ala Val Gly Met
    290                 295                 300
Arg Pro Trp Arg Lys Asp Gly Leu Arg Ile Glu Glu Glu Lys Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Trp Ile Val His Asn Tyr Gly His Ser Gly Trp Gly Tyr
                325                 330                 335
Gln Gly Ser Tyr Gly Cys Ala Glu Asn Val Val Gln Leu Val Asp Lys
            340                 345                 350
Val Gly Lys Ala Ala Lys Ser Lys Leu
        355                 360
<210> 2
<211> 361
<212> PRT
<213> 人(Homo)
<400> 2
Met Ala Asn Thr Ile Ile Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Thr
1               5                   10                  15
Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Lys Gly Asn Lys Ile Thr Val Val
            20                  25                  30
Ala Lys His Met Pro Gly Asp Tyr Asp Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Phe
        35                  40                  45
Ala Gly Ala Asn Val Cys Pro Met Ala Thr Gln Glu Asn Ser Arg Trp
    50                  55                  60
Glu Arg Arg Thr Trp Val Glu Phe Lys Arg Leu Cys Glu Gln Val Pro
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Ile His Phe Gln Lys Cys His Ile Ala Arg Arg Lys Lys
                85                  90                  95
Asp Val Glu Glu Ala Lys Ser Ser Thr Phe Pro Asp Ala Leu Phe Gln
            100                 105                 110
Glu Glu Pro Trp Tyr Lys Glu Leu Phe Glu Asp Phe Arg Glu Gln Asn
        115                 120                 125
Pro Asn Glu Val Thr Arg Gly Tyr Asp Ser Gly Cys Glu Phe Thr Ser
    130                 135                 140
Val Cys Ile Asn Thr Ala Ile Tyr Leu Pro Trp Leu Ala Gly Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Lys Asn Gly Val Val Leu Lys Arg Thr Ile Leu Thr Asp Ile Ser
                165                 170                 175
Glu Ala Lys Lys Leu Ser His Thr Gly Lys Val Pro Asn Ile Ile Val
            180                 185                 190
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ser Leu Lys Leu Gly Gly Val Lys Asp Glu
        195                 200                 205
Thr Met Ala Pro Ala Arg Gly Gln Ile Val Val Val Arg Asn Glu Ser
    210                 215                 220
Thr Pro Met Leu Ile Thr Ser Gly Val Glu Asp Gly Gly Ser Asp Val
225                 230                 235                 240
Met Tyr Leu Met Gln Arg Ala Ala Gly Gly Gly Thr Ile Leu Gly Gly
                245                 250                 255
Thr Tyr Asp Val Gly Asn Trp Glu Ser Gln Pro Asp Pro Asn Ile Ala
            260                 265                 270
Gln Arg Ile Met Gln Arg Ile Val Glu Ala Arg Pro Glu Val Ala Asp
        275                 280                 285
Gly Lys Gly Val Lys Gly Leu Ser Ile Ile Arg His Ala Val Gly Leu
    290                 295                 300
Arg Pro Trp Arg Lys Gly Gly Leu Arg Leu Glu Glu Glu Lys Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Trp Ile Val His Asn Tyr Gly His Ser Gly Trp Gly Tyr
                325                 330                 335
Gln Gly Ser Tyr Gly Cys Ala Glu Gly Val Val Glu Leu Val Asp Lys
            340                 345                 350
Val Gly Lys Gly Ala Lys Ala Lys Leu
        355                 360
<210> 3
<211> 361
<212> PRT
<213> 人(Homo)
<400> 3
Met Ala Asn Thr Ile Val Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Thr
1               5                   10                  15
Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Lys Gly Asn Lys Ile Thr Val Val
            20                  25                  30
Gly Lys His Met Pro Gly Asp Tyr Asp Ile Glu Tyr Ala Ser Pro Phe
        35                  40                  45
Ala Gly Ala Asn Val Cys Pro Met Ala Thr Gln Glu Asn Ser Arg Trp
    50                  55                  60
Glu Arg Arg Thr Trp Val Glu Phe Lys Arg Leu Cys Glu Gln Val Pro
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Ile His Phe Gln Lys Cys His Ile Ala Arg Arg Lys Lys
                85                  90                  95
Asp Val Glu Glu Ala Lys Ser Asn Thr Phe Pro Asp Ala Leu Phe Gln
            100                 105                 110
Glu Glu Pro Trp Tyr Lys Glu Leu Phe Glu Asp Phe Arg Glu Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ser Glu Val Thr Arg Gly Tyr Asp Thr Gly Cys Glu Phe Thr Ser
    130                 135                 140
Val Cys Ile Asn Thr Ala Ile Tyr Leu Pro Trp Leu Ala Gly Gln Cys
145                 150                 155                 160
Leu Lys Lys Gly Val Val Ile Lys Arg Ala Ser Leu Thr Asp Ile Ser
                165                 170                 175
Glu Ala Lys Lys Leu Ser His Thr Gly Asn Val Pro Asn Ile Ile Val
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Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ser Leu Lys Leu Gly Gly Val Lys Asp Glu
        195                 200                 205
Thr Met Ala Pro Ala Arg Gly Gln Ile Val Val Val Arg Asn Glu Ser
    210                 215                 220
Thr Pro Met Leu Ile Thr Ser Gly Val Glu Asp Gly Gly Ser Asp Val
225                 230                 235                 240
Met Tyr Leu Met Gln Arg Ala Ala Gly Gly Gly Thr Ile Leu Gly Gly
                245                 250                 255
Thr Tyr Asp Ile Gly Asn Trp Glu Ser Gln Pro Asp Pro Asn Val Ala
            260                 265                 270
Gln Arg Ile Leu Gln Arg Ile Val Glu Ala Arg Pro Glu Val Ala Asp
        275                 280                 285
Gly Lys Gly Val Lys Gly Leu Ser Ile Ile Arg His Ala Val Gly Leu
    290                 295                 300
Arg Pro Trp Arg Lys Asp Gly Leu Arg Leu Glu Glu Glu Lys Leu Asp
305                 310                 315                 320
Asp Glu Thr Trp Ile Val His Asn Tyr Gly His Ser Gly Trp Gly Tyr
                325                 330                 335
Gln Gly Ser Tyr Gly Cys Ala Glu Gly Val Val Glu Leu Val Asp Lys
            340                 345                 350
Val Gly Lys Gly Ala Lys Ala Lys Leu
        355                 360
<210> 4
<211> 356
<212> PRT
<213> 人(Homo)
<400> 4
Met Ala Lys Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Val Ala Gly Leu Thr Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Gln Leu Leu Arg Lys Gly His Glu Val Thr Ile Val Ser Glu
            20                  25                  30
Phe Thr Pro Gly Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Trp Ala Gly
        35                  40                  45
Ala Asn Trp Leu Thr Phe Tyr Asp Gly Gly Lys Leu Ala Asp Tyr Asp
    50                  55                  60
Ala Val Ser Tyr Pro Ile Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ser Ser Pro Glu
65                  70                  75                  80
Ala Gly Ile Arg Leu Ile Ser Gln Arg Ser His Val Leu Lys Arg Asp
                85                  90                  95
Leu Pro Lys Leu Glu Val Ala Met Ser Ala Ile Cys Gln Arg Asn Pro
            100                 105                 110
Trp Phe Lys Asn Thr Val Asp Ser Phe Glu Ile Ile Glu Asp Arg Ser
        115                 120                 125
Arg Ile Val His Asp Asp Val Ala Tyr Leu Val Glu Phe Arg Ser Val
    130                 135                 140
Cys Ile His Thr Gly Val Tyr Leu Asn Trp Leu Met Ser Gln Cys Leu
145                 150                 155                 160
Ser Leu Gly Ala Thr Val Val Lys Arg Arg Val Asn His Ile Lys Asp
                165                 170                 175
Ala Asn Leu Leu His Ser Ser Gly Ser Arg Pro Asp Val Ile Val Asn
            180                 185                 190
Cys Ser Gly Leu Phe Ala Arg Phe Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys Lys
        195                 200                 205
Met Tyr Pro Ile Arg Gly Gln Val Val Leu Val Arg Asn Ser Leu Pro
    210                 215                 220
Phe Met Ala Ser Phe Ser Ser Thr Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asp Glu
225                 230                 235                 240
Ala Leu Tyr Ile Met Thr Arg Phe Asp Gly Thr Ser Ile Ile Gly Gly
                245                 250                 255
Cys Phe Gln Pro Asn Asn Trp Ser Ser Glu Pro Asp Pro Ser Leu Thr
            260                 265                 270
His Arg Ile Leu Ser Arg Ala Leu Asp Arg Phe Pro Glu Leu Thr Lys
        275                 280                 285
Asp Gly Pro Leu Asp Ile Val Arg Glu Cys Val Gly His Arg Pro Gly
    290                 295                 300
Arg Glu Gly Gly Pro Arg Val Glu Leu Glu Lys Ile Pro Gly Val Gly
305                 310                 315                 320
Phe Val Val His Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Tyr Gln Ser Ser
                325                 330                 335
Tyr Gly Met Ala Asp Glu Ala Val Ser Tyr Val Glu Arg Ala Leu Thr
            340                 345                 350
Arg Pro Asn Leu
        355

Claims (13)

1.一种酶法拆分制备如式(I)所示化合物的方法，
Figure FDA0003881868330000011
式(I)中，R1，R2独立地选自氢、C1-C6烷基，C1-C6烷氧基，其特征在于，所述方法包括：
(1)以所述式(I)所示化合物的外消旋体或式(I)所示化合物的盐的外消旋体为底物，利用离体的D-氨基酸氧化酶或胞内表达D-氨基酸氧化酶的细胞作为催化剂，选择性催化式(I)化合物的R型异构体进行氧化脱氢反应，而式(I)化合物未被催化，保留在反应体系中；所述D-氨基酸氧化酶具有如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(2)将所述式(I)化合物与反应体系分离，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，式(I)中，R1，R2独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、甲氧基或乙氧基，所述的盐为碱金属盐或铵盐。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的式(I)所示化合物为(S)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸或(S)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-甲酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为表达D-氨基酸氧化酶的工程菌，所述工程菌的宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述工程菌含有表达载体pET-28a(+)，所述D-氨基酸氧化酶基因连接在表达载体pET-28a(+)上。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，首先构建反应体系，然后控制反应体系处于设定温度和有氧环境中进行所述氧化脱氢反应，其中所述反应体系包含所述底物、pH缓冲溶液和/或pH调节剂以及所述催化剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应体系中，起始底物的浓度为1～20g/L，反应体系的pH为6～9；所述的催化剂为含有所述离体的D-氨基酸氧化酶的粗酶液或胞内表达D-氨基酸氧化酶的细胞或者纯酶或者固定化酶；所述设定温度为20～70℃。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述催化剂的添加量以8000rpm离心10min后的细胞湿重计，所述细胞的添加量为反应体系重量的1～5％。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述设定温度为30～50℃，所述反应体系的pH值为7～8。
10.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，使所述反应在辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸存在下进行。
11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述pH缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
12.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的pH调节剂为氨水、碱金属氢氧化物或其水溶液。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将反应体系的pH值调至5.0-6.0，加热使蛋白变性析出，抽滤，滤液浓缩后，冷却析晶，干燥，即得所述的式(I)所示化合物。
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