CN108690836B - 一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用，特别是公开了一种通过定点突变获得的环己酮单加氧酶，与SEQ ID No.1相比，其氨基酸序列在以下至少一个位点发生基因突变：第435位丝氨酸Ser突变成苏氨酸Thr。实验表明，本发明的环己酮单加氧酶能够将高浓度的奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V的环己酮单加氧酶。
Description
技术领域
本发明属酶工程技术领域，涉及一种通过基因定点突变获得的单加氧酶及其应用，特别涉及一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用。
背景技术
埃索美拉唑和奥美拉唑都是用于治疗胃溃疡的质子泵抑制剂(Proton pumpinhibitors，PPIs)，其中埃索美拉唑是S构型的奥美拉唑，其化学名称为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为119141-88-7，化学结构如下式I所示。奥美拉唑的化学名称为5-甲氧基-2-(((4-甲氧基-3,5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，CAS登录号为73590-58-6，其化学结构如下式II所示。
与奥美拉唑相比，埃索美拉唑具有肝脏首过效应低、血药浓度高、血浆半衰期长、生物利用度高、药物间相互作用小、药效强而持久等优势，尤其适合用于特殊人群，如老年人、肾功能不全和轻中度肝功能不全患者。此外，埃索美拉唑还适用于已经治愈的食管炎患者防止复发的长期维持治疗，与适当的抗菌疗法联合用药可根除幽门螺杆菌，并且能愈合与幽门螺杆菌感染相关的十二指肠溃疡，防止与幽门螺杆菌相关的消化性溃疡复发。埃索美拉唑以其卓著的品质名列2004年全球畅销药物第5位，销售额高达43亿美元。
目前，已报道的埃索美拉唑的化学合成方法主要有拆分法和氧化法。酶法生物催化近年来由于其高效、高选择性的催化性能，在不对称合成领域中得到广泛的关注，同时由于酶的高度专属性，使得酶催化使用范围并不广，不同的底物需要特殊的突变酶才能实现有效的催化效果。美国科德克希思公司在CN102884178 A公开了一种进行基因突变的，获得非天然存在的单加氧酶，NCBI登录号为578026767(本申请命名为SEQ ID NO:1)，高选择性用于催化单加氧合成拉唑类化合物，然而其一批反应可催化的底物浓度比较低(33g/L)，不利于工业化大规模应用。本申请人之前也对相关酶进行改造，提高了反应底物浓度，达到了更好的催化效果，较佳的实现工业化。然而先前报导的这些单加氧酶均只能在制备拉唑最后原料药单加氧中的使用才能获得催化效果，但是药品原料制造过程中对产后原料的高质量要求，除了对有机化学杂质高要求之外，对溶剂残留、挥发等也有高严格的要求，酶本身是一种蛋白，在用于催化反应时，自身的裂解可能导致大量的氨基酸等残留，该些杂质残留后期在原料药纯化工艺较难除去，需要多次结晶工艺或者其他纯化途径，以到达原料药的质量需求，以致酶催化反应在最后一步用于原料药制备工艺中难以被广泛的接受应用，目前最后一步工艺中采用酶法催化产物蛋白残留大于0.1％，后期需要多次重结晶纯化或者特殊过滤出来。
发明内容
为了克服现有的生物酶合成法直接应用于最后原料药中存在缺陷，本发明利用基因工程技术来对现有技术的环己酮单加氧酶进行改造和筛选，构建高酶活性的单加氧酶，从而可催化高浓度的奥美拉唑硫醚中间体底物转化为埃索美拉唑中间体，最后通过化学法生成埃索美拉唑。
本发明的第一个目的是提供一种环己酮单加氧酶，其能够将高浓度的奥美拉唑硫醚中间体底物(式IV)催化转化为埃索美拉唑中间体底物(V)。
其中，所述的环己酮单加氧酶与SEQ ID No.1相比，环己酮单加氧酶的氨基酸序列至少以下一个位点发生基因突变：第435位丝氨酸(Ser)突变成苏氨酸(Thr)获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其中SEQ ID No.1是现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶的氨基酸序列。
在一些实施方案中，环己酮单加氧酶的氨基酸序列选自SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13。对应的核苷酸序列分别为SEQ ID No.4、SEQ ID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ IDNo.14。
在本发明的一个实施方案中，对现有的NCBI登录号为578026767的环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID No.1的第435位进行突变，将丝氨酸(Ser)突变成苏氨酸(Thr)，获得氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.1的第435位进行定点突变改造：
F1：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG
R1：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC
获得本发明的环己酮单加氧酶基因，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
进一步的，对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.3的第386位进行进一步的定点突变改造，将丝氨酸(Ser)突变成天冬酰胺(Asn)，获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.3的第386位进行定点突变改造：
F2：GATGCGGGCGATGGCAACTACAAGCGCATCG
R2：CGATGCGCTTGTAGTTGCCATCGCCCGCATC
获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
再进一步的，对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.5的第244位进行定点突变改造，将亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)，获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.5的第244位进行定点突变改造：
F3：GAAAAATAGCGCCGCAGCCTATGGTGTGAATG
R3：CATTCACACCATAGGCTGCGGCGCTATTTTTC
获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
再进一步的，对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.7的第277位进行定点突变改造，将甲硫氨酸(Met)突变为缬氨酸(Val)，获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.7的第277位进行定点突变改造：
F4：GACGGGTGGCGGGGTACGCTTTATGTTTG
R4：CAAACATAAAGCGTACCCCGCCACCCGTC
获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
再进一步的，对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.9的第329位进行定点突变改造，将亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)，获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.9的第329位进行定点突变改造：
F5：GTATGCTTGTCGCCCGGCATGCGATTCAGGC
R5：GCCTGAATCGCATGCCGGGCGACAAGCATAC
获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
再进一步的，对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.11的第400位进行定点突变改造，将异亮氨酸(Ile)突变为缬氨酸(Val)，获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。在本发明的一个实施方案中，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)，对环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是，对该环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.11的第400位进行定点突变改造：
F6：GAAAAATGGCTTAGCCGTGAAAGATTATTGGAAAG
R6：CTTTCCAATAATCTTTCACGGCTAAGCCATTTTTC
获得本发明的环己酮单加氧酶基因，其氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
本发明的第二个目的是提供携带上文所述进一步突变的单加氧酶基因的表达载体和基因工程菌株，特别是携带所述环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株。
在本发明的一个实施方案中，采用以下方法构建携带所述环己酮单加氧酶的表达载体和基因工程菌株：首先以本发明的环己酮单加氧酶基因为模板，通过PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将扩增的基因插入至pET28a质粒中，连接后获得携带所述环己酮单加氧酶的表达载体，然后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，即构建获得携带所述环己酮单加氧酶的重组大肠杆菌基因工程菌株。
其中PCR扩增扩展设计的引物如下：
正向引物：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC
反向引物：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG
PCR程序如下：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；25个循环；
72℃，7min。
所述重组大肠杆菌基因工程菌株的培养可采用本领域技术人员熟知的常规方法培养，比如摇瓶培养和发酵罐培养。
所述药瓶培养主要包括如下步骤：
(1)将所述重组大肠杆菌基因工程菌株接种至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃的摇床中振荡培养，获得活化的菌体培养液；
(2)将上述获得的菌体培养液接种于含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值，以便监测菌体生长密度，当菌液OD600值为2.0～5.0时，加入诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至终浓度为0.01～1.00mmol/L，然后将该培养液置于32℃的摇床中诱导表达，获得发酵液。将发酵液离心，收集获得菌体，备用。
其中，所述LB培养基的配方是：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0。
优选将所述重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，100～500rpm的摇床中振荡培养至少20h，获得活化的菌体培养液。
更优选将所述重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中，于37℃，200～300rpm的摇床中振荡培养至少16h，获得活化的菌体培养液。
优选当菌液OD600值为2.0～4.0时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.05～0.1mmol/L，然后将该培养液置于32℃、100～500rpm的摇床诱导表达至少20h，获得发酵液。
优选当菌液OD600值为2.0～3.0时，加入诱导剂IPTG至菌体终浓度为0.05～0.06mmol/L，然后将该培养液置于32℃、200～300rpm的摇床诱导表达至少16h，获得发酵液。
所述发酵罐培养主要包括如下步骤：
在特定的发酵培养基配方条件下，控制发酵液pH＝7.0～7.2左右，搅拌，发酵过程中控制溶氧20％以上，空气流量1:1vvm(通气比)，葡萄糖残余量5％以下。接入种子液，发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH＝7.0左右，罐温35～37℃，当发酵液OD600达到20～30时加入IPTG至菌体终浓度为0.1～1.00mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达，控制发酵液pH＝7.0～7.2左右，罐温为32℃左右，此后继续发酵至少16h。发酵过程中当葡萄糖浓度低于15g/L时，通过流加葡萄糖100～500g/L溶液来维持培养物的生长。将发酵液经5000-10000rpm离心5～30min，收集获得菌体，备用。
其中所述发酵培养基配方是：酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，甘油10g/L，硫酸氯化镁0.1g/L，硫酸锰0.5g/L，pH＝7.0。
优选地，控制发酵液pH＝7.0，搅拌转速500～1000rpm，优选800～1000rpm，发酵过程中控制溶氧30％以上，空气流量1:1vvm(通气比)，葡萄糖残余量1％以下。
优选地，接入种子液的OD600＝1.0～2.0，更优选1.5～2.0，接入量为发酵液体积的1％～10％，优选5％～10％。
优选地，当发酵液OD600达到25～30时加入IPTG至菌体终浓度为0.5～1.00mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达。
优选地，当发酵液OD600达到25时加入IPTG至菌体终浓度为0.5mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达。
更优选地，发酵过程中当葡萄糖浓度低于10g/L时，通过流加葡萄糖300～500g/L溶液维持培养物的生长。将发酵液经8000～10000rpm离心10～30min，收集获得菌体。
其中HPLC检测条件是：Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH＝7.6)：乙腈(60:40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min。
蛋白质的测定方法。色谱条件：以交联葡聚糖凝胶为填充剂，大连依利特SephadexG-10(Φ10.0mm×300mm)色谱柱或性能相当；以0.1mol/L磷酸氢二钠溶液为流动相；检测波长为280nm；柱温为45℃；流速为1.5ml/min。测定法：取血清白蛋白(牛)(BCS)对照品适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml约含5μg的溶液作为对照品溶液；取供试品约100mg，置20ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；以水作为空白溶液。精密量取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液各100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积(不加校正因子)计算。
本发明的另一个目的是提供一种将奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V的方法，其包括下述步骤：向反应体系中加入所述的环己酮单加氧酶，或者携带所述的环己酮单加氧酶的基因工程菌株，然后将奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V奥美拉唑硫醚底物催化转化成埃索美拉唑；
其中，所述催化转化的方法和条件均可为本领域的常规方法和条件。本发明中，所述催化转化的条件一般为：所述反应体系的pH为6.5～8.5，所述催化转化的反应温度为10～35℃，在氧气环境下进行。较佳地，所述催化转化在磷酸盐缓冲液存在下进行；所述催化转化在有机溶剂存在下进行，所述溶剂优选为甲苯、DMSO和异丙醇中的一种或者几种。其中所述的氧气环境泛指含有氧气的条件均可，如空气中氧气、纯的氧气等。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明通过对现有的环己酮单加氧酶基因片段进行定点基因突变，获得具有特定氨基酸/核苷酸序列的环己酮单加氧酶突变体(基因)。本发明的环己酮单加氧酶突变体(基因)、携带所述环己酮单加氧酶突变体(基因)的表达载体和/或基因工程菌株均可将高浓度、高选择性的将奥美拉唑硫醚中间体底物(式IV)催化转化为埃索美拉唑中间体底物(V)，进一步的将V转化为埃索美拉唑(I)。本发明方法实现了价格低廉且收率高的生产亚砜类化合物的可能，大大降低了生产成本，具有优越的工业化应用价值。
具体实施方式
本文涉及到多种物质的添加量、含量、浓度，以及百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
在本文中，术语“环己酮单加氧酶突变体”、“突变体环己酮单加氧酶”、“突变的环己酮单加氧酶”、“环己酮单加氧酶突变体(基因)”表示相同的意义，都是指通过对现有的环己酮单加氧酶的氨基酸序列SEQ ID No.1进行定点突变获得的环己酮单加氧酶，尤其是指酶活活性增强的环己酮单加氧酶突变体。
在本发明中，有时为了描述简便，会将某种蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于某一种环己酮单加氧酶突变体，用于描述其催化底物反应时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该环己酮单加氧酶突变体的基因，以此类推。
相对于现有的环己酮单加氧酶的氨基酸序列SEQ ID No.1，本发明环己酮单加氧酶关键位点进行突变体，具有较强的催化活性，由于本发明环己酮单加氧酶仍存在其他位点。因此这些突变后的环己酮单加氧酶，在具有该突变位点同时保持了80％以上的同源性的氨基酸序列均在本发明的保护范围之内。
表达本发明的环己酮单加氧酶的微生物可以是任何转化体宿主，例如包括但不限于细菌和真菌。优选细菌，尤其是大肠杆菌。
当作为生物催化剂用于生产埃索美拉唑中间体时，本发明的环己酮单加氧酶可以是酶的形式、菌体形式或其他形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶或酶粉等；所述菌体形式包括存活菌体和/或死亡菌体。
本发明的环己酮单加氧酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。
实施例
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非限定本发明的保护范围。下述实施例中所述的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
环己酮单加氧酶的合成并构建菌株1#
通过NCBI查询环己酮单加氧酶基因(NCBI登录号为578026767)，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。然后以该基因片段为模板，通过PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株1#。
其中PCR扩增扩展设计的引物序列如下：
正向引物：GGAATTCCATATGAGTACCAAGATGGATTTTGATGC
反向引物：CGCGGATCCTTACGCATTAGCCTGCTGTTTGG
PCR扩增扩增程序如下：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min；25个循环；
72℃，7min。
实施例1：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株2#
采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述对比例1的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对该环己酮单加氧酶氨基酸序列SEQ ID No.1的第435位的丝氨酸(Ser)进行定点突变改造成苏氨酸(Thr)，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：
F1：GGTCCACTGGCCAATACTCCTCCTATCATCG
R1：CGATGATAGGAGGAGTATTGGCCAGTGGACC
PCR程序设定：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；
72℃，7min。
获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株2#。
实施例2：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株3#
采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例1的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.3的第386位进行进一步的定点突变改造，丝氨酸(Ser)突变成天冬酰胺(Asn)设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：
F2：GATGCGGGCGATGGCAACTACAAGCGCATCG
R2：CGATGCGCTTGTAGTTGCCATCGCCCGCATC。
PCR程序设定：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；
72℃，7min。
获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株3#。
实施例3：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株4#
采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例2的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.5的第244位进行定点突变改造，将亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：
F3：GAAAAATAGCGCCGCAGCCTATGGTGTGAATG
R3：CATTCACACCATAGGCTGCGGCGCTATTTTTC
PCR程序设定：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；
72℃，7min。
获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID No.7所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株4#。
实施例4：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株5#
采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例3的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.7的第277位进行定点突变改造，将甲硫氨酸(Met)突变为缬氨酸(Val)，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：
F4：GACGGGTGGCGGGGTACGCTTTATGTTTG
R4：CAAACATAAAGCGTACCCCGCCACCCGTC
PCR程序设定：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；
72℃，7min。
获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID No.9所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株5#。
实施例5：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株6#
采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例4的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.9的第329位进行定点突变改造，将亮氨酸(Leu)突变为丙氨酸(Ala)，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：
F5：GTATGCTTGTCGCCCGGCATGCGATTCAGGC
R5：GCCTGAATCGCATGCCGGGCGACAAGCATAC
PCR程序设定：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；
72℃，7min。
获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。
然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株6#。
实施例6：环己酮单加氧酶基因的定点突变并构建菌株7#
采用QuickChange Site-directed Mutagenesis(Stratagene)方法(AgilentTechnologies)，对上述实施例5的环己酮单加氧酶基因进行蛋白质工程改造，具体是对环己酮单加氧酶基因的氨基酸序列SEQ ID No.11的第400位进行定点突变改造，将异亮氨酸(Ile)突变为缬氨酸(Val)，设计如下引物(划线处对应相应的突变位点)：
F6：GAAAAATGGCTTAGCCGTGAAAGATTATTGGAAAG
R6：CTTTCCAATAATCTTTCACGGCTAAGCCATTTTTC
PCR程序设定：
95℃预变性3min；
95℃，45s；55℃，45s；72℃，2min 18个循环；
72℃，7min。
获得本发明的环己酮单加氧酶突变基因，氨基酸序列如SEQ ID No.13所示，对应的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。
然后以该基因为模板，按照实施例1的方法进行PCR扩增扩展(基因两端加Nde I和BamH I内切酶片段)，并利用Nde I和BamH I内切酶位点将该基因插入至pET28a质粒中，连接获得携带该环己酮加氧酶的表达载体，最后将该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建获得携带该环己酮单加氧酶基因的重组大肠杆菌基因工程菌株，记为菌株7#。
实施例7：重组大肠杆菌基因工程菌株的揺瓶培养
将对比例1和实施例1～6构建获得的重组大肠杆菌基因工程菌株1#至7#分别接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH＝7.0)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养至少16小时，获得活化的菌体培养液。
分别接种2ml上述获得的菌体培养液于50ml含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度，当菌液OD600值为2.0-3.0时，加入诱导剂IPTG至菌体终浓度为0.05mmol/L，将培养液置于32℃、200rpm的摇床诱导表达16h，获得发酵液，8000rpm离心10min，收集获得的菌体，备用。
实施例8：重组大肠杆菌基因工程菌株的发酵罐发酵
发酵培养基配方：酵母粉15g/L，氯化钠5g/L，硫酸铵4g/L，磷酸氢二钾4g/L，甘油10g/L，硫酸氯化镁0.1g/L，硫酸锰0.5g/L，pH＝7.0。
控制发酵液pH 7.0，搅拌转速800rpm，发酵过程中控制溶氧30％以上，空气流量1:1vvm，葡萄糖残余量1％以下。分别接种OD600＝1.5的上述实施例9获得的各工程菌株的菌体培养液，接种量为发酵液体积的5％。发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH＝7.0左右，罐温35-37℃，发酵液OD600＝25时加入诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，诱导环己酮单加氧酶的表达，控制发酵液pH＝7.0-7.2左右，罐温为32℃左右，此后继续发酵16小时。当发酵过程中葡萄糖浓度低于10g/L时，通过流加葡萄糖300g/L溶液维持培养物的生长。此后通过将发酵液8000rpm离心10min，收集获得菌体，备用。
HPLC检测条件：Shimadzu液相色谱，Phenomenex色谱柱，流动相为10mM磷酸盐(pH7.6):乙腈(60:40)，流速1mL/min，柱温35℃，紫外检测波长300nm，检测时长15min。
对比例1：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株1#的菌粉(菌体干燥物)，加入80mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)3g、异丙醇20mL、甲苯40ml,氧化性辅酶II 0.006mg，在氧气环境下保温30℃反应，反应48h，液相检测奥美拉唑硫醚含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得2.55g产物，收率85％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值86.7％。[M+H]+：346.1。
实施例9：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株2#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝8.0，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)20g、异丙醇20mL、DMSO40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温32℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得18.5g产物，收率92.5％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值92.3％。[M+H]+：346.1。
实施例10：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株3#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)20g、异丙醇20mL、甲苯40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温32℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得18.6g产物，收率93.0％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值95.7％。[M+H]+：346.1。
实施例11：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株4#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)20g、异丙醇20mL、甲苯40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温25℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得18.9g产物，收率94.5％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值98.7％。[M+H]+：346.1。
实施例12：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株5#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝6.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)20g、异丙醇20mL、甲苯40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温32℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得19g产物，收率95.0％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值99.1％。[M+H]+：346.1。
实施例13：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株6#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝7，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)20g、异丙醇20mL、甲苯40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温35℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得19g产物，收率95.0％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值99.3％。[M+H]+：346.1。
实施例14：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株7#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝8，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)20g、异丙醇20mL、甲苯40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温32℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得18.6g产物，收率93.0％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值99.3％。[M+H]+：346.1。
实施例15：催化转化奥美拉唑硫醚中间体
称取10g菌株6#的菌粉，加入100mL磷酸缓冲液(pH＝8.5，50mM)，超声破碎(冰浴，功率600w，工作5s，间歇5s，破碎时间10min，重复3次)，8000rpm离心10min，收集上清液待用。
在上述收集的上清液中，依次加入异丙醇脱氢酶1g、奥美拉唑硫醚中间体(IV)25g、异丙醇20mL、甲苯40ml、氧化性辅酶II 0.01mg，在氧气环境下保温32℃反应，反应24h，液相检测中间体(IV)含量小于1wt％后，加入200mL乙酸乙酯终止反应。静置分层，分去水层，乙酸乙酯用饱和氯化钠水溶液洗2遍，干燥后旋干，获得23.5g产物，收率94.0％。HPLC分析显示该产物为埃索美拉唑中间体V，ee值99.3％。[M+H]+：346.1。
实施例16：制备埃索美拉唑
将实施例9-15生成埃索美拉唑中间体V为起始原料进行亲核取代反应，生产埃索美拉唑。
将埃索美拉唑中间体V 36g(100mmol)投入到500ml三口瓶中，加入100ml甲醇，室温下搅拌溶解，加入8.1g甲醇钠，升温在35～45℃下反应6小时至反应结束，过滤浓缩得到埃索美拉唑钠盐34.1g。HPLC为99.1％，检测氨基酸残留<0.043％。[M+H]+：346.5。MS必要时进行游离生成游离碱。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江京新药业股份有限公司，上海京新生物医药有限公司
<120> 一种环己酮单加氧酶及其在合成拉唑中的应用
<130> 150
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Thr Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Val Lys Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp
35 40 45
Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys
50 55 60
Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Met Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu
85 90 95
Lys His Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Thr Ser
100 105 110
Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr
115 120 125
Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Asn Trp Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly
145 150 155 160
Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Ile Glu Gly
165 170 175
Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile
180 185 190
Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser
195 200 205
Pro Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Asp Pro Leu Ser Glu Glu Asp
210 215 220
Val Lys Lys Ile Lys Asp Asn Tyr Asp Lys Ile Trp Asp Gly Val Lys
225 230 235 240
Asn Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Val Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met
245 250 255
Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Lys Ala Val Phe Glu Lys Ala Trp Gln
260 265 270
Thr Gly Gly Gly Met Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ile
275 280 285
Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys
290 295 300
Ile Ala Arg Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro
305 310 315 320
Gln Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn
325 330 335
Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro
340 345 350
Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe
355 360 365
Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp
370 375 380
Gly Ser Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Ile
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu
420 425 430
Ala Asn Ser Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val
435 440 445
Phe Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Asp
450 455 460
Lys Glu Ala Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Ala Asn Ile Ala Glu
465 470 475 480
Lys Thr Leu Phe Pro Lys Ala Lys Cys Arg Ile Phe Gly Ala Asn Ile
485 490 495
Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu
500 505 510
Tyr Arg Ser Val Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Val Gly Phe
515 520 525
Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Thr Lys Gln Gln Ala Asn Ala
530 535 540
<210> 2
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgagtacca agatggattt tgatgcaatt gtgatcggtg ccggctttgg cggcctgtat 60
gccgttaaaa aactgcgcga tgaactggaa ctgaaagtta aagcctttga taaagcaacg 120
gatgtgggcg ggacctggta ttggaatcgc tatccgggcg cactgacgga tacggaaacc 180
catctgtatt gctattcttg ggataaagaa atgctacaga gtttagaaat caaaaagaaa 240
tatgtgcagg gcccagatgt tcgcaaatac ttacagcagg ttgcagaaaa acatgatctg 300
aaaaaatctt atcagtttaa taccgccgtg acgagtgctc attataacga ggcggatgcc 360
ctgtgggaag tgacaaccga atatggcgat aaatataccg cacgctttct gattaccgcc 420
gtgggtctgc tgtctgcacc taattggcct aatatcaaag gcatcaatca gtttaaaggt 480
gaactgcatc atacgtcacg ctggccggat gatgtgagca tcgaaggcaa gagagtgggt 540
gtgatcggta cgggtagtac gggcgttcag gttattacag cagttgctcc attagccaaa 600
catctgaccg tgtttcagcg tagtccacag tatagtgttc cgatcggcaa tgatccactg 660
agcgaagaag atgttaagaa gattaaagat aattatgata aaatctggga tggtgtgaaa 720
aatagcgcct tagcctatgg tgtgaatgag tctacagttc cagccatgag cgtgagtgca 780
gaagaacgta aagccgtgtt tgaaaaggca tggcagacgg gtggcgggat gcgctttatg 840
tttgaaacct ttggggacat aattaccaat atggaagcta atatcgaagc acagaatttt 900
atcaaaggca aaattgcccg catcgttaaa gatcctgcca ttgcacagaa actgatgcct 960
caggatctgt atgcttgtcg cccgctgtgc gattcaggct attataatac ctttaatcgc 1020
gaaaatgttc gtctggaaga tgttaaagct aatccgatcg tggaaatcac cgaaaatggc 1080
gttaaactgg aaaatggcga ttttgtggaa ttagatatgc tgatttgcgc gaccggcttt 1140
gatgcgggcg atggctctta caagcgcatc gacatacagg ggaaaaatgg cttagccatc 1200
aaagattatt ggaaagaagg tcctagtagc tatatgggcg ttgcggttaa caactatccg 1260
aatatgttta tggtttttgg tccgaatggt ccactggcca attctcctcc tatcatcgaa 1320
tctcaggttg agtggatttc agtgtttatc cagtataccg ttgaaaacaa tgttgaatct 1380
atcgaagccg ataaagaagc ggaagaacag tggacccaga cctgcgccaa tattgccgaa 1440
aaaaccctgt ttcctaaagc caaatgtcgc atctttggtg ccaatattcc gggcaagaaa 1500
aacacggtgt atctgtacct cggcggtctg aaagaatatc gtagcgtttt agctaattgc 1560
aaaaatcatg cgtatgtggg ctttgatatt cagttacagc gctcagatac caaacagcag 1620
gctaatgcgt aa 1632
<210> 3
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ser Thr Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Val Lys Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp
35 40 45
Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys
50 55 60
Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Met Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu
85 90 95
Lys His Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Thr Ser
100 105 110
Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr
115 120 125
Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Asn Trp Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly
145 150 155 160
Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Ile Glu Gly
165 170 175
Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile
180 185 190
Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser
195 200 205
Pro Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Asp Pro Leu Ser Glu Glu Asp
210 215 220
Val Lys Lys Ile Lys Asp Asn Tyr Asp Lys Ile Trp Asp Gly Val Lys
225 230 235 240
Asn Ser Ala Leu Ala Tyr Gly Val Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met
245 250 255
Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Lys Ala Val Phe Glu Lys Ala Trp Gln
260 265 270
Thr Gly Gly Gly Met Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ile
275 280 285
Thr Asn Met Glu Ala Asn Ile Glu Ala Gln Asn Phe Ile Lys Gly Lys
290 295 300
Ile Ala Arg Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro
305 310 315 320
Gln Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Leu Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn
325 330 335
Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro
340 345 350
Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe
355 360 365
Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp
370 375 380
Gly Ser Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Ile
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu
420 425 430
Ala Asn Thr Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val
435 440 445
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325 330 335
Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro
340 345 350
Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe
355 360 365
Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp
370 375 380
Gly Asn Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Ile
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu
420 425 430
Ala Asn Thr Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val
435 440 445
Phe Ile Gln Tyr Thr Val Glu Asn Asn Val Glu Ser Ile Glu Ala Asp
450 455 460
Lys Glu Ala Glu Glu Gln Trp Thr Gln Thr Cys Ala Asn Ile Ala Glu
465 470 475 480
Lys Thr Leu Phe Pro Lys Ala Lys Cys Arg Ile Phe Gly Ala Asn Ile
485 490 495
Pro Gly Lys Lys Asn Thr Val Tyr Leu Tyr Leu Gly Gly Leu Lys Glu
500 505 510
Tyr Arg Ser Val Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Val Gly Phe
515 520 525
Asp Ile Gln Leu Gln Arg Ser Asp Thr Lys Gln Gln Ala Asn Ala
530 535 540
<210> 12
<211> 1632
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgagtacca agatggattt tgatgcaatt gtgatcggtg ccggctttgg cggcctgtat 60
gccgttaaaa aactgcgcga tgaactggaa ctgaaagtta aagcctttga taaagcaacg 120
gatgtgggcg ggacctggta ttggaatcgc tatccgggcg cactgacgga tacggaaacc 180
catctgtatt gctattcttg ggataaagaa atgctacaga gtttagaaat caaaaagaaa 240
tatgtgcagg gcccagatgt tcgcaaatac ttacagcagg ttgcagaaaa acatgatctg 300
aaaaaatctt atcagtttaa taccgccgtg acgagtgctc attataacga ggcggatgcc 360
ctgtgggaag tgacaaccga atatggcgat aaatataccg cacgctttct gattaccgcc 420
gtgggtctgc tgtctgcacc taattggcct aatatcaaag gcatcaatca gtttaaaggt 480
gaactgcatc atacgtcacg ctggccggat gatgtgagca tcgaaggcaa gagagtgggt 540
gtgatcggta cgggtagtac gggcgttcag gttattacag cagttgctcc attagccaaa 600
catctgaccg tgtttcagcg tagtccacag tatagtgttc cgatcggcaa tgatccactg 660
agcgaagaag atgttaagaa gattaaagat aattatgata aaatctggga tggtgtgaaa 720
aatagcgccg cagcctatgg tgtgaatgag tctacagttc cagccatgag cgtgagtgca 780
gaagaacgta aagccgtgtt tgaaaaggca tggcagacgg gtggcggggt acgctttatg 840
tttgaaacct ttggggacat aattaccaat atggaagcta atatcgaagc acagaatttt 900
atcaaaggca aaattgcccg catcgttaaa gatcctgcca ttgcacagaa actgatgcct 960
caggatctgt atgcttgtcg cccggcatgc gattcaggct attataatac ctttaatcgc 1020
gaaaatgttc gtctggaaga tgttaaagct aatccgatcg tggaaatcac cgaaaatggc 1080
gttaaactgg aaaatggcga ttttgtggaa ttagatatgc tgatttgcgc gaccggcttt 1140
gatgcgggcg atggcaacta caagcgcatc gacatacagg ggaaaaatgg cttagccatc 1200
aaagattatt ggaaagaagg tcctagtagc tatatgggcg ttgcggttaa caactatccg 1260
aatatgttta tggtttttgg tccgaatggt ccactggcca atactcctcc tatcatcgaa 1320
tctcaggttg agtggatttc agtgtttatc cagtataccg ttgaaaacaa tgttgaatct 1380
atcgaagccg ataaagaagc ggaagaacag tggacccaga cctgcgccaa tattgccgaa 1440
aaaaccctgt ttcctaaagc caaatgtcgc atctttggtg ccaatattcc gggcaagaaa 1500
aacacggtgt atctgtacct cggcggtctg aaagaatatc gtagcgtttt agctaattgc 1560
aaaaatcatg cgtatgtggg ctttgatatt cagttacagc gctcagatac caaacagcag 1620
gctaatgcgt aa 1632
<210> 13
<211> 543
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Met Ser Thr Lys Met Asp Phe Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Phe
1 5 10 15
Gly Gly Leu Tyr Ala Val Lys Lys Leu Arg Asp Glu Leu Glu Leu Lys
20 25 30
Val Lys Ala Phe Asp Lys Ala Thr Asp Val Gly Gly Thr Trp Tyr Trp
35 40 45
Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Thr Asp Thr Glu Thr His Leu Tyr Cys
50 55 60
Tyr Ser Trp Asp Lys Glu Met Leu Gln Ser Leu Glu Ile Lys Lys Lys
65 70 75 80
Tyr Val Gln Gly Pro Asp Val Arg Lys Tyr Leu Gln Gln Val Ala Glu
85 90 95
Lys His Asp Leu Lys Lys Ser Tyr Gln Phe Asn Thr Ala Val Thr Ser
100 105 110
Ala His Tyr Asn Glu Ala Asp Ala Leu Trp Glu Val Thr Thr Glu Tyr
115 120 125
Gly Asp Lys Tyr Thr Ala Arg Phe Leu Ile Thr Ala Val Gly Leu Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Asn Trp Pro Asn Ile Lys Gly Ile Asn Gln Phe Lys Gly
145 150 155 160
Glu Leu His His Thr Ser Arg Trp Pro Asp Asp Val Ser Ile Glu Gly
165 170 175
Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Ile
180 185 190
Thr Ala Val Ala Pro Leu Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln Arg Ser
195 200 205
Pro Gln Tyr Ser Val Pro Ile Gly Asn Asp Pro Leu Ser Glu Glu Asp
210 215 220
Val Lys Lys Ile Lys Asp Asn Tyr Asp Lys Ile Trp Asp Gly Val Lys
225 230 235 240
Asn Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Val Asn Glu Ser Thr Val Pro Ala Met
245 250 255
Ser Val Ser Ala Glu Glu Arg Lys Ala Val Phe Glu Lys Ala Trp Gln
260 265 270
Thr Gly Gly Gly Val Arg Phe Met Phe Glu Thr Phe Gly Asp Ile Ile
275 280 285
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290 295 300
Ile Ala Arg Ile Val Lys Asp Pro Ala Ile Ala Gln Lys Leu Met Pro
305 310 315 320
Gln Asp Leu Tyr Ala Cys Arg Pro Ala Cys Asp Ser Gly Tyr Tyr Asn
325 330 335
Thr Phe Asn Arg Glu Asn Val Arg Leu Glu Asp Val Lys Ala Asn Pro
340 345 350
Ile Val Glu Ile Thr Glu Asn Gly Val Lys Leu Glu Asn Gly Asp Phe
355 360 365
Val Glu Leu Asp Met Leu Ile Cys Ala Thr Gly Phe Asp Ala Gly Asp
370 375 380
Gly Asn Tyr Lys Arg Ile Asp Ile Gln Gly Lys Asn Gly Leu Ala Val
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Trp Lys Glu Gly Pro Ser Ser Tyr Met Gly Val Ala Val
405 410 415
Asn Asn Tyr Pro Asn Met Phe Met Val Phe Gly Pro Asn Gly Pro Leu
420 425 430
Ala Asn Thr Pro Pro Ile Ile Glu Ser Gln Val Glu Trp Ile Ser Val
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Tyr Arg Ser Val Leu Ala Asn Cys Lys Asn His Ala Tyr Val Gly Phe
515 520 525
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<400> 14
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aaaaatcatg cgtatgtggg ctttgatatt cagttacagc gctcagatac caaacagcag 1620
gctaatgcgt aa 1632
Claims (9)
1.一种将奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V的环己酮单加氧酶，其特征在于，与SEQ ID No.1相比，其环己酮单加氧酶氨基酸序列选自：SEQ ID No.7、SEQID No.9、SEQ ID No.11或SEQ ID No.13
2.根据权利要求1所述的环己酮单加氧酶，其特征在于，编码所述氨基酸序列的环己酮单加氧酶基因的核苷酸序列分别相应选自：SEQ ID No.8、SEQ ID No.10、SEQ ID No.12或SEQ ID No.14。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带权利要求1～2任一项所述的环己酮单加氧酶的表达基因。
4.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株携带权利要求1～2任一项所述的环己酮单加氧酶的表达基因。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为重组大肠杆菌基因工程菌株。
6.一种将奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V方法，其特征在于，向反应体系中加入权利要求1～2任一项所述的环己酮单加氧酶，或者权利要求4或5所述的基因工程菌株，然后将奥美拉唑硫醚中间体IV催化转化成埃索美拉唑中间体V；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应体系的pH为6.5～8.5，所述催化转化的反应温度为10～35℃，在氧气环境下进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化转化在磷酸盐缓冲液存在下进行。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化转化在有机溶剂存在下进行，溶剂选为甲苯、DMSO和异丙醇一种或者几种。
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