CN113430216B - 一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用 - Google Patents

一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种苯丙酮单加氧酶，其氨基酸序列由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列通过突变获得，并公开基于该苯丙酮单加氧酶的不对称生物催化合成亚砜类药物的技术方法。本发明通过基因挖掘筛选获得来源于Limnobacter sp.的苯丙酮单加氧酶基因，采用基因工程技术构建重组大肠杆菌表达菌株，通过分子改造技术实现酶活力和立体选择性的提高。同时构建了单加氧酶突变体与不同脱氢酶的共表达菌株。以奥美拉唑硫醚为原料，采用全细胞或酶蛋白催化的方法，不对称催化合成光学纯埃索美拉唑。本发明可以在温和的条件下通过一步反应获得目标产物，没有副产物奥美拉唑砜，同时环境友好，是一种绿色生物催化合成途径。

Description

一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用。
背景技术
埃索美拉唑，又称艾司奥美拉唑或(S)-奥美拉唑，化学名为5-甲氧基-2-((S)-((4-甲氧基-3, 5-二甲基-2-吡啶基)甲基)亚硫酰基)-1H-苯并咪唑，化学结构如下所示。埃索美拉唑是奥美拉唑的(S)-单一构型异构体，主要用于治疗十二指肠溃疡、胃溃疡、胃炎以及消化道食管炎，临床上已经证明该药比外消旋体和(R)-奥美拉唑或其它拉唑类药物毒副作用更低，疗效更好。制备埃索美拉唑化学法是利用金属催化剂不对称氧化硫醚合成埃索美拉唑，但这类方法存在光学纯度受限、容易过度氧化、副产物多、分离提纯工艺复杂等缺点。
埃索美拉唑结构式
目前生物催化合成光学纯埃索美拉唑的单加氧酶突变体均来自于不动杆菌Acinetobacter sp.环己酮单加氧酶（CHMO） (J Org Chem 2018, 83, 7453-7458； ACSSustain Chem Eng, 2019, 7, 7218-7226)。已公布的专利CN 111218431 A和CN102884178A主要采用随机突变和定向进化的方式改造CHMO，获得不对称氧化奥美拉唑硫醚的高活性CHMO 突变体。但是反应产物含有一定量可检测到的过氧化副产物奥美拉唑砜。目前未见对苯丙酮具有氧化活性的苯丙酮单加氧酶（PAMO）催化不对称合成光学纯埃索美拉唑或其它拉唑化合物的报道。同时上述专利均采用游离酶反应，需要额外添加甲酸脱氢酶或羰基还原酶实现辅酶NADPH再生，有专利（CN 108239618 A）报道单加氧酶与羰基还原酶（或称异丙醇脱氢酶）共表达用于埃索美拉唑合成，但是对单加氧酶与甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶共表达未见报道，不同脱氢酶在大肠杆菌内表达水平存在差异，而且不同单加氧酶与脱氢酶共表达组合及共表达方式直接影响单加氧酶可溶性表达和辅酶再生，进而导致生物催化法合成埃索美拉唑的整体效率出现差异。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用。通过基因挖掘从一株Limnobacter sp.菌基因组中获得苯丙酮单加氧酶LnPAMO，其氨基酸序列与目前已报道的合成埃索美拉唑的CHMO单加氧酶序列同源性低（≤40%）。通过对该酶氨基酸序列的定点突变及基因工程改造，含苯丙酮单加氧酶LnPAMO的菌体实现了全细胞催化不对称合成光学纯埃索美拉唑埃索美拉唑。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种苯丙酮单加氧酶基因，所述苯丙酮单加氧酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
一种苯丙酮单加氧酶，所述苯丙酮单加氧酶包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的突变体，所述突变体的突变方式包括指定位置的氨基酸残基突变，所述指定位置选自如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的第59位，第112位，第121位，第152位，第246位，第251位，第252位，第279位，第284位，第328位，第329位，第436位，第438位，第488位及第495位氨基酸。
进一步的，上述指定位置的氨基酸残基突变包括以下任意一种或几种突变方式：突变体格式XnY/Z，表示第n位氨基酸残基X替换为氨基酸残基Y或者氨基酸残基Z；具体包括：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I， F488L及Y495I。
所述突变体指定位置的氨基酸残基突变包括所述指定一个或多个位置氨基酸残基替换，表示为MUx，其中x表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种替换方式：
更进一步的，上述突变体指定位置的氨基酸残基突变包括所述指定一个或多个位置的氨基酸残基替换，表示为MUx，其中x表示共有几个突变位点，具体包括以下任意一种突变方式：
单点突变体MU1；Y495I；
两点突变体MU2：K329L，Y495I；
三点突变体MU3：I246H，K329L，Y495I；
四点突变体MU4：I246H，T252E，K329L，Y495I；
五点突变体MU5：I59L，I246H，T252E，K329L，Y495I；
六点突变体MU6：I59L，I246H，T252E，I279L，K329L，Y495I；
七点突变体MU7：I59L，I246H，T252E，I279L，A328L，K329L，Y495I；
八点突变体MU8：I59L，246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，Y495I；
九点突变体MU9：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，F488L，Y495I；
十点突变体MU10：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；
十一点突变体MU11：I59L，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；
十二点突变体MU12：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；
十三点突变体MU13：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；
十四点突变体MU14：I59L，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；
十五点突变体MU15：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I。
一种重组表达质粒，所述重组表达质粒能表达上述苯丙酮单加氧酶。
进一步的，将苯丙酮单加氧酶突变体基因，或者脱氢酶基因和苯丙酮单加氧酶突变体基因，连接至质粒pET28a上构建重组表达质粒；所述脱氢酶包括甲酸脱氢酶基因、葡萄糖脱氢酶、羰基还原酶中的一种；构建的重组表达质粒包括pET28a-PAMO-MUx或pET28a-PAMO-MUx-FDH或pET28a-PAMO-MUx-GDH或pET28a-PAMO-MUx-KRED。更进一步的，将甲酸脱氢酶基因和苯丙酮单加氧酶十五点突变体基因连接至质粒pET28a上，构建重组质粒pET28a-PAMO-MU15-FDH；苯丙酮单加氧酶十五点突变体基因序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含上述重组表达载体。进一步的，将pET28a-PAMO-MUx、pET28a-PAMO-MUx-FDH、pET28a-PAMO-MUx-GDH、pET28a-PAMO-MUx-KRED任意一种重组表达质粒转化进大肠杆菌BL21感受态细胞，构建苯丙酮单加氧酶表达菌体以及各脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO的共表达菌体。
上述苯丙酮单加氧酶及其与脱氢酶共表达菌株在拉唑类药物制备中的应用。
上述一种重组表达转化体在拉唑类药物制备中的应用。
催化奥美拉唑硫醚氧化，不对称合成埃索美拉唑的应用。
进一步的，苯丙酮单加氧酶在催化以氧化奥美拉唑硫醚为底物不对称合成埃索美拉唑中的应用，包括以下步骤：将苯丙酮单加氧酶与脱氢酶在大肠杆菌中共表达，在100mL，100 mM, pH9.0 的Tris缓冲液中加入5g共表达大肠杆菌菌体，加入10 mL甲醇溶解的浓度为160 g/L的奥美拉唑硫醚，添加辅底物，添加NADP+ 0.2 mM（或者不添加），在25℃下，180 rpm震荡反应1~5h；反应完成后，添加两倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁粉末除去有机相中的水，旋转蒸发除去乙酸乙酯，水相重结晶，干燥，获得埃索美拉唑粉末。所述辅底物为：终浓度为100 mM的甲酸钠，或终浓度为100 mM的葡萄糖，或终浓度为2vol%的异丙醇。
进一步的，苯丙酮单加氧酶在合成光学纯(S)-泮托拉唑中的应用，包括以下步骤：在90 mL 100 mM，pH 9.0的Tris缓冲液中加入pET28a-PAMO-MU15-FDH共表达的湿菌体20 g，加入10 mL甲醇溶解的15 g/L的泮托拉唑硫醚，1.5倍摩尔当量的甲酸钠，NADP+ 0.2 mM，在25℃，180 rpm震荡反应5~12h，反应完成后，添加七倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁干燥，挥发除去溶剂，获得光学纯(S)-泮托拉唑。
采用上述改造策略和定点突变方式在本发明所述的PAMO或与其氨基酸序列同源性高于80%的多肽蛋白实施的分子改造应属于本专利涵盖范围。
本发明有益效果：
（1）本发明在温和条件下通过一步反应获得光学纯埃索美拉唑，而且相比已报道酶法合成方法，没有检测到副产物奥美拉唑砜。
（2）本发明采用理性设计，通过分子对接构建LnPAMO-辅酶-底物复合物结构模型，分别考察FAD和NADP配体结合区域5埃范围内的氨基酸残基，分析各个相互作用力，通过定点突变，在靶向位置突变氨基酸残基，增强PAMO对辅酶FAD和NADP的结合作用。另外，在底物通道区域，分析识别及结合底物奥美拉唑硫醚的关键氨基酸残基，通过定点突变，在关键位置突变氨基酸残基，促进底物通道有效识别奥美拉唑硫醚，提高底物结合效率，提升LnPAMO不对称合成埃索美拉唑的活力。获得的苯丙酮单加氧酶催化合成埃索美拉唑的活力高，相比单纯使用酶蛋白催化反应，辅酶添加量小（可以不加或最高仅需0.2 mM，低于已有报道的单加氧酶所需的NADP+浓度，CN 102884178 B）。
（3）将苯丙酮单加氧酶和脱氢酶在同一菌体细胞内共表达，不用额外添加脱氢酶组分，减少工程耗费，显著提高了苯丙酮单加氧酶催化生成埃索美拉唑的活力，为埃索美拉唑的工业合成提供了新的生物催化剂资源。
与现有不对称氧化的其他方法相比，使用本发明的苯丙酮单加氧酶及其全细胞催化剂制备手性纯埃索美拉唑具有成本低、反应条件温和、环境友好、产品光学纯度高，特别是无过氧化产物砜等优势，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1 酶蛋白的表达及纯化结果。泳道1为大肠杆菌胞内表达破碎后上清，泳道2为镍柱纯化后的蛋白。
图2 LnPAMO分子内FAD和NADP结合域图示。
图3 LnPAMO合成埃索美拉唑反应进程时间曲线。
图4 反应产物AD-H手性柱HPLC检测图。检测波长254 nm，底物出峰时间8.4 min，R构型产物出峰时间10.2 min，埃索美拉唑出峰时间11.9 min。
图5 埃索美拉唑反应产物的质谱检测。
图6 泮托拉唑反应产物液相检测。
具体实施方式
以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到，本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。
实施例1 苯丙酮单加氧酶的重组表达
通过基因挖掘筛选到一种来源于Limnobacter sp.的新型苯丙酮单加氧酶(LnPAMO)基因（GenBank No. KYP10950.1），氨基酸序列和已报道的用于合成拉唑类化合物的环己酮苯丙酮单加氧酶(AcCHMO和CHMO-NCIMB9871)氨基酸序列相似性低，为40%。根据苯丙酮单加氧酶LnPAMO氨基酸序列（SEQ ID NO：2）进行密码子优化，获得LnPAMO基因碱基优化序列如SEQ ID NO：1所示。
人工合成密码子优化的LnPAMO基因片段，并通过BamHI和XhoI限制性内切酶酶切后，连接到质粒pET28a上构建重组质粒pET28a-LnPAMO，并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。
异源表达：在平板上挑取重组质粒的单克隆接种到25 mL LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37℃，200 rpm过夜培养，获得种子液。移取5 mL种子液转接到500 mL LB液体培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37℃，200 rpm条件下培养。当重组大肠杆菌培养液的OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度为0.2 mM IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside），在25℃条件下诱导表达16 h。4℃、6000 rpm离心5 min，收获菌体，用适量Tris缓冲液（200mM，pH9.0）进行重悬，即得苯丙酮单加氧酶的全细胞反应液。通过SDS-PAGE检测苯丙酮单加氧酶在大肠杆菌中蛋白表达情况，结果如附图1所示，目的蛋白LnPAMO大部分在上清中，且通过镍柱纯化的蛋白复合预期分子量大小（约63kDa），表明该酶在大肠杆菌中具有良好可溶性表达，保证了后续的蛋白分离纯化具有较高的回收效率。
实施例2 苯丙酮单加氧酶LnPAMO全细胞催化的底物谱测定
取实施例1中诱导表达后的收获的菌体10 mg，用390μL 100 mM pH 9.0的Tris缓冲液重悬，加入50μL 100 mM 底物溶液(苯丙酮、苯乙酮、环己酮、苯甲硫醚或奥美拉唑硫醚，终浓度10 mM，甲醇助溶)，10 μL 10 mM NADP+（终浓度0.2 mM），10 μL葡萄糖脱氢酶，10μL 1 M葡萄糖，置于30℃，1000 rpm反应2 h。HPLC检测产物生成的量，计算转化率。硫醚底物反应的液相色谱条件为：C18反相柱，流动相为乙腈：水＝53:47，流速1 mL/min，柱温30℃，检测波长为254 nm，检测时间为13 min。气相检测条件：30 m*0.32 mm*0.5 μm C18气相柱，氢火焰离子化检测器240 ℃。环己酮转化产物检测器条件为：从60℃至100℃梯度升温分离，苯乙酮或苯丙酮气相检测器条件为100℃恒温分离。各个底物和产物出峰时间及相应转化率如下表1所示。
表1 LnPAMO对不同底物的活性检测结果
重组表达的单加氧酶LnPAMO高效催化苯丙酮或苯乙酮氧化，而对环己酮氧化为己内酯的活性很低，体现出对芳香族酮的底物偏好性，故该酶应为苯丙酮单加氧酶（PAMO）。同时该酶对模式硫醚底物苯甲硫醚具有较高活力，在所述条件下可达90%转化率，而对埃索美拉唑前体奥美拉唑硫醚未检测到催化活性。
实施例3 苯丙酮单加氧酶LnPAMO的定点突变
采用理性设计，根据氨基酸序列（SEQ ID NO:2）进行蛋白同源建模，通过分子对接构建LnPAMO-辅酶-底物复合物结构模型，分别考察苯丙酮单加氧酶LnPAMO的 FAD和NADP配体结合区域5埃范围内的氨基酸残基（图2）。分析各个次级作用力，通过定点突变，在靶向位置突变氨基酸残基，增强LnPAMO对辅酶FAD和NADP的结合作用。另外，在底物通道区域，分析识别及结合底物奥美拉唑硫醚的关键氨基酸残基，通过定点突变，在关键位置突变氨基酸残基，促进底物通道有效识别奥美拉唑硫醚，提高底物结合效率。同时，在PAMO-辅酶-底物复合物的蛋白表面搜索有益的突变位点，进一步提升LnPAMO不对称合成埃索美拉唑的活力。
上述定点突变为根据SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的一个或多个位点突变，突变位点包括：第59位，第112位，第121位，第152位，第246位，第251位，第252位，第279位，第284位，第328位，第329位，第436位，第438位，第488位及第495位氨基酸。
所述突变方式包括指定位置的氨基酸残基突变，其指定位置的氨基酸残基突变包括以下任意一种或几种突变方式，突变体格式XnY/Z，表示第n位氨基酸残基X替换为氨基酸残基Y或者氨基酸残基Z；具体包括：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I， F488L及Y495I。
上述定点突变涉及的引物如表2所示，其中加粗斜体表示氨基酸突变位点所采用的三联体密码子碱基序列：
表2. 引物序列表
经上述方式改造LnPAMO获得的苯丙酮单加氧酶，指定位置的氨基酸残基突变还包括如表3所示任意一种替换方式：
表3
本发明实施定点突变方式如下所述。此处以495位酪氨酸突变为异亮氨酸残基为例代表性陈述本发明突变方式，其它位置或同一位置突变为其它氨基酸均按本方式实现氨基酸定点突变。
以实施例1所述pET28a-LnPAMO作为模板，以Y495I-F和Y495I-R为上下游引物，用Takara公司的PrimerStar聚合酶进行质粒PCR。反应体系如下：质粒模板(50 ng/μL)，上下游引物(10 ng/μL)各0.5 μL，ddH2O 8μL，2×PrimeStar 10 μL。PCR反应程序：95℃预变性3分钟，98℃变性30秒，60℃退火15秒，72℃延伸5分钟，20个循环，最后72℃再延伸5分钟，25℃保温10分钟。添加Takara公司Dpn I 1 μL，消化模板质粒2 h后，取消化产物10μL转入E .coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的平板中，置于37℃培养箱过夜培养。挑取单克隆转化子接入3mL含卡那霉素（50 mg/L）LB培养基，待菌液OD600达到0.6后，采用0.2 mM IPTG进行蛋白诱导表达，测定菌体对化合物奥美拉唑硫醚的转化活性。将活力提升的转化子送测序公司进行核酸测序，确认所得到的单克隆突变株中苯丙酮单加氧酶LnPAMO基因核苷酸序列，表达的苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体为单点突变体MU1。其它位点突变方法与本实施案例相似。
实施例4 苯丙酮单加氧酶及其突变体与辅酶再生体系的共表达菌株的构建
已有报道的埃索美拉唑生物催化反应过程中，额外加入另外来源的脱氢酶实现辅酶NADPH再生，这需要另外花费资源制备脱氢酶。利用分子生物学方法将脱氢酶在同一细胞内同步表达，可以不用额外添加脱氢酶，避免工程耗费。
本发明人工合成三种序列优化的脱氢酶基因，分别为Bacillus toyonensis葡萄糖脱氢酶(GDH，GenBank: QHA17948.1)、Burkholderia stabilis甲酸脱氢酶(FDH，GenBank: ACF35003.1)和Lentilactobacillus kefiri羰基还原酶(KRED，GenBank:GEL27574.1)，采用如下所示引物（GDH-1: 5’-GGAATTCGAAGGAGATATACCATGGGTTACAGCGATCTGGA-3’，GDH-2: 5’-CCGCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGGA-3’；FDH-1: 5’-CCGGAATTCGAAGGAGATATACCATGGCAACCGTGCTGTGT-3’，FDH-2: 5’-CCGCTCGAGTTAGGTCAGGCGATAAGACTG-3’；KRED-1: 5’-GGAATTCGAAGGAGATATACCATGACCGATCGTCTGAAAG-3’，KRED-2: 5’-CCGCTCGAGTTACTGTGCGGTATAGCCA-3’），通过基因工程方式，分别将三个脱氢酶基因片段连接到携带苯丙酮单加氧酶突变体基因的pET28a-LnPAMO质粒，所述三种脱氢酶基因连接在苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体基因的下游，构建获得质粒pET28a-PAMO-MUX-GDH，pET28a-PAMO-MUx-FDH和pET28a-PAMO-MUx-KRED (MUx代表突变体名称，x表示共有几个突变位点），分别转化进大肠杆菌BL21感受态，构建脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO的共表达菌体。
上述共表达菌株进行诱导表达（方法同实施例1单点突变体MU1蛋白诱导表达）后，采用超声破碎，离心取上清测定各脱氢酶活力。甲酸脱氢酶活力的测定方法参考文献Appl.Biochem. Biotechnol., 192:530–543 (2020)。葡萄糖脱氢酶活力的测定方法参考文献Appl. Environment. Microbiol, 3285–3293(2005)。羰基还原酶活力的测定参考文献Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (51), E7065-E7072 (2015)。
甲酸脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO共表达的菌体的构建：将甲酸脱氢酶连接至含苯丙酮单加氧酶十五点突变体（MU15）基因（其基因序列如SEQ ID NO:3所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示）的pET28a-LnPAMO质粒上构建重组质粒pET28a-PAMO-MU15-FDH，重组质粒转化进大肠杆菌BL21感受态，构建甲酸脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO的共表达菌体。
实施例5 LnPAMO突变体合成埃索美拉唑活性测定
pET28a-PAMO-MUx-FDH共表达菌体湿菌体制备方法：将上述构建质粒转化入大肠杆菌BL21细胞，获得表达苯丙酮单加氧酶LnPAMO和甲酸脱氢酶共表达的菌株。采用常规大肠杆菌蛋白表达方法，经诱导表达后，获得含有脱氢酶和苯丙酮单加氧酶的大肠杆菌细胞。离心，收集菌体细胞，即为甲酸脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO共表达菌的湿菌体。
苯丙酮单加氧酶LnPAMO可以是上述实施例3中的任一突变后苯丙酮单加氧酶LnPAMO基因表达，所述脱氢酶可以是实施例4中的任一脱氢酶基因表达。
甲酸脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO共表达菌体全细胞合成埃索美拉唑活性分析：
甲酸脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO（pET28a-PAMO-MUx-FDH）共表达菌体对奥美拉唑硫醚的氧化活力，方法如下：500 μL反应体系中加入390 μL 50 mM、pH 9.0的Tris缓冲液，50μL 20 mM奥美拉唑硫醚溶液(甲醇溶解)，10 μL 10 mM NADP+(终浓度0.2 mM)，甲酸钠100 mM，甲酸脱氢酶和苯丙酮单加氧酶LnPAMO共表达菌体湿菌体含量50g/L，置于30℃，1000 rpm反应10 min。HPLC检测产物(埃索美拉唑) 的生成量，计算全细胞催化奥美拉唑硫醚亚砜化的活性。液相色谱条件为：C18反相柱，流动相为乙腈：水＝53:47，流速0.8 mL/min，柱温30℃，检测波长为254 nm。底物奥美拉唑硫醚及其亚砜化产物的出峰时间分别是2.8 min 和4.5 min。
各突变体活力如下表3所示。
表3
注：“+”代表1倍酶活力。砜的检测方式包括C18柱液相检测和TOF/MS正离子质谱分析(J. Org. Chem. 2018, 83, 14, 7453–7458)。
通过上述突变方式，结合脱氢酶共表达技术，实现一菌双酶法合成光学纯埃索美拉唑，能提高催化活力及辅酶再生速率，同时提高酶反应产物的纯度。
实施例6 利用LnPAMO突变体与FDH共表达菌体制备光学纯埃索美拉唑
本发明测定LnPAMO突变体活性并选取高效突变体用于埃索美拉唑的制备，技术方法如下所述，本专利范围内的其它LnPAMO突变体及同源性高于80%的单加氧酶也可采用所述方式用于制备埃索美拉唑。
（1）苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体全细胞合成埃索美拉唑
在100 mL Tris缓冲液(100 mM, pH9.0)中加入苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体与甲酸脱氢酶共表达的湿菌体5g，加入10 mL甲醇溶解的奥美拉唑硫醚（10 g/L），添加甲酸钠至终浓度10 mM。在25℃下，180 rpm摇床反应4 h。取样后加入0.6 mL乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁粉末除去有机相中的水，取0.1 mL样品通风除去乙酸乙酯，然后加入0.2 mL异丙醇溶解，分析测定底物转化率、产物ee值及奥美拉唑砜含量。16 h时转化率大于99％，产物埃索美拉唑的ee值大于99％，未检测到副产物砜。
（2）苯丙酮单加氧酶LnPAMO十五点突变体（pET28a-PAMO-MU15-FDH）全细胞合成埃索美拉唑及产物提取制备
将苯丙酮单加氧酶与脱氢酶在大肠杆菌中共表达，在100 mL，100 mM，pH 9.0 的Tris缓冲液中加入5g共表达大肠杆菌菌体，加入10 mL甲醇溶解的浓度为160 g/L的奥美拉唑硫醚，所用全细胞催化剂为苯丙酮单加氧酶LnPAMO十五点突变体与甲酸脱氢酶（pET28a-PAMO-MU15-FDH）共表达细胞，甲酸钠添加量100 mM，NADP+添加量0.2 mM，其余反应条件与（1）相同。反应时间曲线如图3所示，产物构型如图4所示。反应结束后，调节反应体系pH为11.0，然后分别用100 mL乙酸乙酯萃取反应液2次，合并有机相，无水硫酸镁除去水分，37℃下旋转真空干燥，获得黄色粘稠状液体，加1 mL丙酮重新溶解，滴加入5℃预冷的20:1（v：v）水-丙酮中，缓慢搅拌30 min，析出固体，过滤，用冷水冲洗沉淀，洗去丙酮，30 ℃下真空干燥粉末，即获得埃索美拉唑粉末，HPLC分析纯度为99.5%，对映异构体过量值>99.9%，未检测到过氧化产物砜（图5）。
实施例7 利用LnPAMO-MU15与GDH共表达菌体制备光学纯埃索美拉唑
在100 mL Tris缓冲液(100 mM, pH9.0)中加入苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体与葡萄糖脱氢酶共表达（pET28a-PAMO-MU15-GDH）的湿菌体5g，加入10 mL甲醇溶解的奥美拉唑硫醚（10 g/L），添加葡萄糖至终浓度10 mM。在25℃下，180 rpm摇床反应，不同时间取样检测转化率。吸取样品0.1 mL后加入0.6 mL乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁粉末除去有机相中的水，通风除去乙酸乙酯，然后加入0.2 mL异丙醇溶解，分析测定底物转化率、产物ee值及奥美拉唑砜含量。不同反应时间转化率如下表4所示。
表4
实施例8 利用LnPAMO-MU15与KRED共表达菌体制备光学纯埃索美拉唑
在100 mL Tris缓冲液(100 mM, pH9.0)中加入苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体与羰基还原酶共表达（pET28a-PAMO-MU15-KRED）的湿菌体5g，加入10 mL甲醇溶解的奥美拉唑硫醚（10 g/L），添加异丙醇至终浓度2%。在25℃下，180 rpm摇床反应，不同时间取样检测转化率。吸取样品0.1 mL后加入0.6 mL乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁粉末除去有机相中的水，通风除去乙酸乙酯，然后加入0.2 mL异丙醇溶解，分析测定底物转化率、产物ee值及奥美拉唑砜含量。不同反应时间转化率如下表5所示。
表5
实施例9
利用苯丙酮单加氧酶LnPAMO突变体转化生成光学纯(S)-泮托拉唑
在90 mL Tris缓冲液(100 mM, pH 9.0)中加入突变体MU12与甲酸脱氢酶（pET28a-PAMO-MU12-FDH）共表达的湿菌体20 g，加入10 mL甲醇溶解的泮托拉唑硫醚（15 g/L），1.5倍摩尔当量的甲酸钠，NADP+ 0.2 mM。在25℃，180 rpm搅拌反应，间歇取样100 μL，取样后加入0.7 mL乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁干燥，挥发除去溶剂，然后加入0.5 mL异丙醇溶解，分析测定底物转化率和产物ee值，12h时转化率达99％，反应产物ee值大于99％，构型为S型，未检测到副产物砜（图6）。
上述实施例仅是代表性示范采用本专利PAMO制备光学纯埃索美拉唑的方式，所用苯丙酮单加氧酶突变体也可以是本专利范围内其他LnPAMO的突变体，所述全细胞催化剂也可以是LnPAMO突变体纯酶溶液，或酶粉形式加入反应体系。所述甲酸脱氢酶也可以是葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶（或羰基还原酶）以及其它实现辅酶NADPH再生的脱氢酶。
本发明的苯丙酮单加氧酶催化活力高，反应作为催化剂加入量小，无副产物奥美拉唑砜，节省下游分离除杂成本，反应规模达到产业化要求，为光学纯埃索美拉唑的工业合成提供了新的生物催化剂资源。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种苯丙酮单加氧酶及在拉唑类药物制备中的应用
<130> 40
<160> 40
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> SEQ ID NO：1
<400> 1
atgaatgcaa gcagcaaaag caaagttgat gttgttgtgg ttggtgcagg ttttgcaggt 60
ctgtatgccc tgcataccct gcgtaataaa ggttatagcg ttcaggttta tgaagccggt 120
gcaggtattg gtggcacctg gtattggaat cgttatccgg gtgcacgttg tgatattgaa 180
agcatcgaat atagctacag ctttagcgaa gaactgcagc aagaatggaa ttggagcgca 240
cgttatgcaa cccagccgga aattctggca tatatgaatc atgttgccga tcgttttgat 300
ctgcgcaaaa acattcagct ggaaacccgt gttgttagcg caaaatttga tgatagcacc 360
agccgttggg atattaccac aaataccggt gataaagtga actgccagtt tgttattatg 420
gcaaccggta gcctgagcac cccgaaaaaa ctggatattg aaggtatcga caacttcaaa 480
ggtgatcagc tgcataccgc atattggcct gaaaaaggtt atgattttgc cggtaaacgc 540
gttggtatta ttggtacagg tagcagcgca attcaggcaa ttccgattat tgcaaaacag 600
gcaaaacatc tgaccgtttt tcagcgtacc ccgaatttta gcattccggc atggaattat 660
gaactgagtg atgaagaacg tcagcagctg aaagaaaact ataaacagct gcgtcagaac 720
gaatggaaaa gccagattgg tattgttcgt ctgacaccgc gtaccgaaag cgcactggaa 780
gtgagcgaag aagaacgcct gaaagaattt gaagcacgtt ggaattttgg tggcatcagc 840
ttttatagca gctttccgga tctgctgatt aacgaagaaa gcaataaact ggttgccgat 900
tttgtccgta acaaaattcg ccagaaaatc aacgatccga aagttgcaga aatgctgatt 960
ccgaaaggtt atccgtttgg tgcaaaacgt ctgtgtgcag ataccaacta ttatgaaacc 1020
tataatctgc cgcatgtgaa actggtggat gttaaagcaa ccccgtttgt gaaatttaca 1080
ccgctgggcc tgcagaccac cgatggtttt catgaactgg atgttctgat taccgcaacc 1140
ggttttgatg cactgaccgg tacactgaat aacattgaaa ttaccggtcg ttatggcgag 1200
gtgctgaaag ataaatggaa agatggtccg cgtacctatc tgggtattat gattgccggt 1260
tttccgaaca tgtttatgac caccggtccg ggtagcccga gcgttctgtt taatatggtt 1320
ctgggtaatg agtatcatgt gaattggatt agccgtgcca ttgatgatgt tcgtagcaaa 1380
ggtgcacaga ccattgaagc aaaaattgaa agcgaagatg aatggtcaac ccatgttacc 1440
gaagttggca atcagaccct gtttccgaaa gcaaatagct ggtatgttgg tgccaatgtt 1500
ccgggtaaac cgcgtgttat tctgctgtat ttaggtggtt ttcagggtta tagccagcgt 1560
tgtgaacaag aagttaaaaa cggttatacc ggttgtgtga tcgcctaa 1608
<210> 2
<211> 535
<212> PRT
<213> SEQ ID NO: 2
<400> 2
Met Asn Ala Ser Ser Lys Ser Lys Val Asp Val Val Val Val Gly Ala
1 5 10 15
Gly Phe Ala Gly Leu Tyr Ala Leu His Thr Leu Arg Asn Lys Gly Tyr
20 25 30
Ser Val Gln Val Tyr Glu Ala Gly Ala Gly Ile Gly Gly Thr Trp Tyr
35 40 45
Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Glu Ser Ile Glu Tyr
50 55 60
Ser Tyr Ser Phe Ser Glu Glu Leu Gln Gln Glu Trp Asn Trp Ser Ala
65 70 75 80
Arg Tyr Ala Thr Gln Pro Glu Ile Leu Ala Tyr Met Asn His Val Ala
85 90 95
Asp Arg Phe Asp Leu Arg Lys Asn Ile Gln Leu Glu Thr Arg Val Val
100 105 110
Ser Ala Lys Phe Asp Asp Ser Thr Ser Arg Trp Asp Ile Thr Thr Asn
115 120 125
Thr Gly Asp Lys Val Asn Cys Gln Phe Val Ile Met Ala Thr Gly Ser
130 135 140
Leu Ser Thr Pro Lys Lys Leu Asp Ile Glu Gly Ile Asp Asn Phe Lys
145 150 155 160
Gly Asp Gln Leu His Thr Ala Tyr Trp Pro Glu Lys Gly Tyr Asp Phe
165 170 175
Ala Gly Lys Arg Val Gly Ile Ile Gly Thr Gly Ser Ser Ala Ile Gln
180 185 190
Ala Ile Pro Ile Ile Ala Lys Gln Ala Lys His Leu Thr Val Phe Gln
195 200 205
Arg Thr Pro Asn Phe Ser Ile Pro Ala Trp Asn Tyr Glu Leu Ser Asp
210 215 220
Glu Glu Arg Gln Gln Leu Lys Glu Asn Tyr Lys Gln Leu Arg Gln Asn
225 230 235 240
Glu Trp Lys Ser Gln Ile Gly Ile Val Arg Leu Thr Pro Arg Thr Glu
245 250 255
Ser Ala Leu Glu Val Ser Glu Glu Glu Arg Leu Lys Glu Phe Glu Ala
260 265 270
Arg Trp Asn Phe Gly Gly Ile Ser Phe Tyr Ser Ser Phe Pro Asp Leu
275 280 285
Leu Ile Asn Glu Glu Ser Asn Lys Leu Val Ala Asp Phe Val Arg Asn
290 295 300
Lys Ile Arg Gln Lys Ile Asn Asp Pro Lys Val Ala Glu Met Leu Ile
305 310 315 320
Pro Lys Gly Tyr Pro Phe Gly Ala Lys Arg Leu Cys Ala Asp Thr Asn
325 330 335
Tyr Tyr Glu Thr Tyr Asn Leu Pro His Val Lys Leu Val Asp Val Lys
340 345 350
Ala Thr Pro Phe Val Lys Phe Thr Pro Leu Gly Leu Gln Thr Thr Asp
355 360 365
Gly Phe His Glu Leu Asp Val Leu Ile Thr Ala Thr Gly Phe Asp Ala
370 375 380
Leu Thr Gly Thr Leu Asn Asn Ile Glu Ile Thr Gly Arg Tyr Gly Glu
385 390 395 400
Val Leu Lys Asp Lys Trp Lys Asp Gly Pro Arg Thr Tyr Leu Gly Ile
405 410 415
Met Ile Ala Gly Phe Pro Asn Met Phe Met Thr Thr Gly Pro Gly Ser
420 425 430
Pro Ser Val Leu Phe Asn Met Val Leu Gly Asn Glu Tyr His Val Asn
435 440 445
Trp Ile Ser Arg Ala Ile Asp Asp Val Arg Ser Lys Gly Ala Gln Thr
450 455 460
Ile Glu Ala Lys Ile Glu Ser Glu Asp Glu Trp Ser Thr His Val Thr
465 470 475 480
Glu Val Gly Asn Gln Thr Leu Phe Pro Lys Ala Asn Ser Trp Tyr Val
485 490 495
Gly Ala Asn Val Pro Gly Lys Pro Arg Val Ile Leu Leu Tyr Leu Gly
500 505 510
Gly Phe Gln Gly Tyr Ser Gln Arg Cys Glu Gln Glu Val Lys Asn Gly
515 520 525
Tyr Thr Gly Cys Val Ile Ala
530 535
<210> 3
<211> 1608
<212> DNA
<213> SEQ ID NO: 3
<400> 3
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<213> K329L-R
<400> 8
cagacgcagt gcaccaaacg gata 24
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> I246H-F
<400> 9
aagccagcat ggtattgttc gtctg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> I246H-R
<400> 10
caataccatg ctggcttttc cattc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> T252E-F
<400> 11
cgtctggaac cgcgtaccga aagcg 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> T252E-R
<400> 12
acgcggttcc agacgaacaa tacc 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> I59L-F
<400> 13
tgtgatctgg aaagcatcga atata 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> I59L-R
<400> 14
gctttccaga tcacaacgtg cac 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> I279L-F
<400> 15
ggtggcctga gcttttatag cagc 24
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> I279L-R
<400> 16
aaagctcagg ccaccaaaat tcc 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> A328L-F
<400> 17
tttggtctgc tgcgtctgtg tgca 24
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> A328L-R
<400> 18
acgcagcaga ccaaacggat aa 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> S284A-R
<400> 19
cggaaaagcg ctataaaagc tcag 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> S284A-F
<400> 20
tatagcgctt ttccggatct gct 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> F488L-F
<400> 21
accctgctgc cgaaagcaaa tagc 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> F488L-R
<400> 22
ttcggcagca gggtctgatt gcc 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> N438I-F
<400> 23
tgtttattat ggttctgggt aat 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> N438I-R
<400> 24
accataataa acagaacgct cgg 23
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> L251K-F
<400> 25
gttcgtaagg aaccgcgtac cgaa 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> L251K-R
<400> 26
cggttcctta cgaacaatac catg 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> L436I-F
<400> 27
agcgttattt ttattatggt tctg 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> L436I-R
<400> 28
ataaaaataa cgctcgggct acc 23
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> S121G-F
<400> 29
tagcaccggt cgttgggata ttac 24
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> S121G-R
<400> 30
ccaacgaccg gtgctatcat caaa 24
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> D152K-F
<400> 31
aaactgaaaa ttgaaggtat cgac 24
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> D152K-R
<400> 32
ttcaattttc agttttttcg gggtg 25
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> V112T-F
<400> 33
cgtgttacca gcgcaaaatt tgat 24
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> V112T-R
<400> 34
tgcgctggta acacgggttt ccag 24
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> GDH-1
<400> 35
ggaattcgaa ggagatatac catgggttac agcgatctgg a 41
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> GDH-2
<400> 36
ccgctcgagt taaccacgac cggcctgga 29
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> FDH-1
<400> 37
ccggaattcg aaggagatat accatggcaa ccgtgctgtg t 41
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> FDH-2
<400> 38
ccgctcgagt taggtcaggc gataagactg 30
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> KRED-1
<400> 39
ggaattcgaa ggagatatac catgaccgat cgtctgaaag 40
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> KRED-2
<400> 40
ccgctcgagt tactgtgcgg tatagcca 28

Claims (8)

1.一种苯丙酮单加氧酶突变体，其特征在于：所述突变体是仅将氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示的苯丙酮单加氧酶的指定位置的一个或多个氨基酸残基进行替换，表示为MUx，其中x表示共有几个突变位点，具体为以下任意一种：
单点突变体MU1；Y495I；
两点突变体MU2：K329L，Y495I；
三点突变体MU3：I246H，K329L，Y495I；
四点突变体MU4：I246H，T252E，K329L，Y495I；
五点突变体MU5：I59L，I246H，T252E，K329L，Y495I；
六点突变体MU6：I59L，I246H，T252E，I279L，K329L，Y495I；
七点突变体MU7：I59L，I246H，T252E，I279L，A328L，K329L，Y495I；
八点突变体MU8：I59L，246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，Y495I；
九点突变体MU9：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，F488L，Y495I；
十点突变体MU10：I59L，I246H，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；
十一点突变体MU11：I59L，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；
十二点突变体MU12：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，N438I，F488L，Y495I；
十三点突变体MU13：I59L，S121G，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；
十四点突变体MU14：I59L，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A， A328L，K329L，L436I，N438I，F488L，Y495I；
十五点突变体MU15：I59L，V112T，S121G，D152K，I246H，L251K，T252E，I279L，S284A，A328L，K329L，L436I，N438I， F488L，Y495I。
2.一种重组表达质粒，其特征在于：所述重组表达质粒能表达权利要求1所述的苯丙酮单加氧酶突变体。
3.根据权利要求2所述的一种重组表达质粒，其特征在于：将苯丙酮单加氧酶突变体基因和脱氢酶基因，连接至质粒pET28a上构建重组表达质粒；所述脱氢酶为：甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、羰基还原酶中的一种。
4.一种重组表达转化体，其特征在于：所述重组表达转化体包含权利要求2所述的重组表达质粒。
5.根据权利要求4所述的一种重组表达转化体，其特征在于：将权利要求2所述重组表达质粒转化进大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，构建苯丙酮单加氧酶突变体表达菌体。
6.如权利要求1所述苯丙酮单加氧酶突变体在拉唑类药物制备中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：苯丙酮单加氧酶突变体在催化不对称氧化奥美拉唑硫醚合成埃索美拉唑中的应用，包括以下步骤：将苯丙酮单加氧酶突变体与脱氢酶在大肠杆菌中共表达，在100 mL，100 mM，pH9.0的Tris缓冲液中加入5g共表达菌体，添加NADP+ 0.2 mM，加入10 mL甲醇溶解的浓度为160g/L的奥美拉唑硫醚，添加辅底物，在25℃下，180 rpm反应1~5 h；反应完成后，添加两倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁粉末除去有机相中的水，旋转蒸发除去乙酸乙酯，水相重结晶，干燥，获得埃索美拉唑粉末；所述辅底物为：终浓度为100 mM的甲酸钠，或终浓度为10 mM的葡萄糖，或终浓度为2vol%的异丙醇；所述脱氢酶为：甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、羰基还原酶中的一种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：苯丙酮单加氧酶突变体在合成光学纯(S)-泮托拉唑中的应用，包括以下步骤：在90 mL，100 mM，pH9.0的Tris缓冲液中加入苯丙酮单加氧酶突变体与甲酸脱氢酶共表达的菌体20 g，加入10 mL甲醇溶解的15 g/L的泮托拉唑硫醚，1.5倍摩尔当量的甲酸钠，NADP+ 0.2 mM，在25℃，180 rpm搅拌反应5~12h，反应完成后，添加七倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取液加入无水硫酸镁干燥，挥发除去溶剂，获得获得光学纯(S)-泮托拉唑。
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