CN110257348A - 一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本分案申请涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用，所述单加氧酶突变体具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1‑34个氨基酸；其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。本发明中通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低单加氧酶的使用量。

Description

一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用
本申请为申请号为201810123656.0、申请日为2018-02-07、发明名称为“一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术
手性亚砜广泛存在于自然界中，是很多重要生物活性分子的结构单元，是合成天然产物和手性药物的重要中间体。许多手性亚砜都含有一个或多个手性中心，不同手性药物的药理活性、代谢过程、代谢速率以及毒性有显著差异，通常一种对映体是有效的，而另一种对映体则是低效或无效的，甚至是有毒的。因此，如何高效立体选择性地构建含手性中心的化合物在医药研发中有着重要意义。
Baeyer Villiger单加氧酶(BVMOs)属于黄素类单加氧酶，通常用来立体选择性氧化链状和环状的酮，生成相应的酯或内酯，也能催化硫、氮和磷的亲电氧化反应，同时BVMOs还能催化酮和硼的亲核氧化反应。环己酮单加氧酶(CHMOs)是第一个被发现的BVMO家族成员。CN105695425A公开了CHMOs在手性药物的合成方面具有很大的应用，可以催化含硫手性前体的氧化，被用于手性药物莫达非尼和奥美拉唑的合成中，但现有的CHMOs酶活性低，稳定性差，可溶表达不好，选择性不高，酶添加量大，后处理困难。
来源于单胞菌Brachymonas petroleovorans的单加氧酶CHMO可以较高选择性的催化硫醚类化合物的转化，但是其活性较低，稳定性较差，在大肠杆菌中可溶表达不好，反应时添加的酶量较多。
CN 107384880 A公开了一种黄素单加氧酶突变体及其制备方法，该方法使用易错PCR技术，对野生型黄素单加氧酶进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体，比酶活较野生型黄素单加氧酶的比酶活提高了35％。但其仅仅是提高了比酶活，对单加氧酶的稳定性、可溶性表达、选择性和酶的使用量并没有起到作用。
尽管有几种CHMOs得到了商业化应用，但CHMOs普遍存在着可溶性表达不好，酶活性低，酶稳定性低，选择性不高等问题。一般而言，可以通过定向进化的手段对野生酶进行改造，提高酶的各种性质，从而可以应用在生产中。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用，所述单加氧酶突变体，提高了其转化效率，稳定性，有利于其在制药领域中的应用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种单加氧酶突变体，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列中任意一个：
(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；
(II)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为取代1-34个氨基酸；
其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。
本发明中，发明人通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，从而对单加氧酶的性质进行考察，发现这些位点的突变会提高单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低酶的使用量。
本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
MSSSPSSAIHFDAIVVGAGFGGMYMLHKLRDQLGLKVKVFDTAGGIGGTWYWNRYPGALSDTHSHVYQYSFDEAMLQEWTWKNKYLTQPEILAYLEYVADRLDLRPDIQLNTTVTSMHFNEVHNIWEVRTDRGGYYTARFIVTALGLLSAINWPNIPGRESFQGEMYHTAAWPKDVELRGKRVGVIGTGSTGVQLITAIAPEVKHLTVFQRTPQYSVPTGNRPVSAQEIAEVKRNFSKVWQQVRESAVAFGFEESTVPAMSVSEAERQRVFQEAWNQGNGFYYMFGTFCDIATDPQANEAAATFIRNKIAEIVKDPETARKLTPTDVYARRPLCDSGYYRTYNRSNVSLVDVKATPISAMTPRGIRTADGVEHELDMLILATGYDAVDGNYRRIDLRGRGGQTINEHWNDTPTSYVGVSTANFPNMFMILGPNGPFTNLPPSIEAQVEWITDLVAHMRQHGLATAEPTRDAEDAWGRTCAEIAEQTLFGQVESWIFGANSPGKKHTLMFYLAGLGNYRKQLADVANAQYQGFAFQPL.
在本发明的另一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。
在本发明的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少85％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。
在本发明的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少90％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。
在本发明的一些实施例中，单加氧酶突变体的氨基酸序列与单加氧酶的氨基酸序列具有至少95％同一性的序列，且具有单加氧酶的活性。
本发明中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化中的任意一种或至少两种的组合。
所述取代例如可以是取代1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个或34个。
本发明中，所述单加氧酶突变体能够催化硫醚类化合物进行转化，所述硫醚类化合物为其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C5～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，所述硫醚类类化合物如式I所示；
具体反应式如下：
根据本发明，所述取代为第23位、第25位、第47位、第75位、第93位、第106位、第110位、第117位、第137位、第153位、第159位、第166位、第260位、第265位、第284位、第289位、第334位、第359位、第360位、第377位、第380位、第426位、第428位、第435位、第436位、第437位、第439位、第457位、第474位、第479位、第490位、第495位、第500位或第508位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M23L、M25A、A74D、M75L、A93E、P106R、L110F、M117A、T137R、W153F、R159L、M166L、M260L、A265E、M284I、C289S、C334L、A359E、M360I、M377V、L380F、M426L、M428F、P435L、P435A、F436L、F436Y、F436A、T437S、T437A、T437Y、L439G、L439A、L439S、M457L、A474E、C479V、Q490K、I495F、I495V、I495A、S500I或M508L中的任意一个或至少两个的组合。
本发明中，通过进一步实验验证，发明人发现这43个位点的突变，能够进一步提高单加氧酶的性质，其中，第25位、第106位、第159位、第265位、第289位、第377位、第380位、第435位、第436位、第437位、第439位、第474位、第479位、第490位、第495位或第500位的突变会明显提高单加氧酶的催化活性、转化率和对异丙醇的耐受性，其他位点的突变，能够明显提高单加氧酶的可溶性表达和选择性。
根据本发明，所述取代为第25位、第106位、第159位、第265位、第289位、第377位、第380位、第435位、第436位、第437位、第439位、第474位、第479位、第490位、第495位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、R159L、A265E、C289S、M377V、L380F、P435L、F436Y、T437A、L439S、A474E、C479V、Q490K、I495A或S500I中的任意一个或至少两个的组合。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、R159L、A265E、C289S、M377V、L380F、P435L、F436Y、T437A、L439S、A474E、C479V、Q490K、I495A或S500I中的任意一个或至少两个的组合时，所述突变体单加氧酶转化率为40％以上。
根据本发明，所述取代为第25位、第106位、第265位、第474位、第490位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、A265E、A474E、Q490K或S500I中的任意一个或至少两个的组合。
根据本发明，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、A265E、A474E、Q490K或S500I中的任意一个或至少两个的组合时，所述突变体单加氧酶转化率为48％以上。
本发明中，发明人通过进一步的考察，发现，S500I-A265E-M25A、S500I-A265E-M25A-Q490K、S500I-A265E-M25A-A474E-P106R、S500I-A265E-M25A-Q490K-P106R和S500I-A265E-M25A-A474E-Q490K这五个突变体的收率最高，能达到86％以上，酶在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，转化率能达到90％以上。
第二方面，本发明提供编码如第一方面所述的单加氧酶突变体的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的突变体的方法，包括：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据第一方面所述突变体的核酸序列；
(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。
第六方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的突变体的多肽。
根据本发明，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的突变体在制备手性药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中通过设计23至508位氨基酸的多个不同位点的突变，发现这些突变体提高了单加氧酶的活性、稳定性、可溶性表达、选择性、还可以降低单加氧酶的使用量；
(2)本发明通过验证发现在原单加氧酶的基础上通过这12个位点的单独突变，即M25A、P106R、R159L、A265E、C289S、M377V、L380F、A474E、C479V、Q490K、I495A和S500I，能够提高单加氧酶的活性，通过将这12个位点的突变进行组合，得到的突变体S500I-A265E-M25A突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K突变体、S500I-A265E-M25A-A474E-P106R突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K-P106R突变体和S500I-A265E-M25A-A474E-Q490K突变体这五个突变体的收率最高，能达到86％以上，酶在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，转化率能达到90％以上。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1单点突变(M25A)的单加氧酶突变体
单加氧酶突变体基因的构建：
为了提高来源于单胞菌Brachymonas petroleovorans的单加氧酶CHMO(其氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2)的活性、稳定性、可溶表达，选择性，降低酶的使用量，对M25A位点分别进行突变，具体步骤如下：
所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：
ATGAGTAGCAGCCCGAGCAGCGCCATCCACTTTGACGCCATTGTGGTGGGTGCCGGTTTTGGCGGCATGTATATGCTGCACAAGCTGCGCGACCAGCTGGGCCTGAAAGTTAAAGTGTTCGACACCGCCGGTGGTATTGGTGGTACCTGGTACTGGAACCGCTATCCGGGTGCCCTGAGCGACACCCATAGCCACGTGTACCAGTACAGCTTCGATGAGGCCATGCTGCAGGAGTGGACATGGAAAAATAAATATCTGACCCAGCCGGAAATCCTGGCATATCTGGAATACGTGGCCGATCGTCTGGATTTACGCCCTGACATTCAGCTGAACACCACCGTTACCAGCATGCATTTTAACGAGGTGCACAATATCTGGGAAGTTCGCACCGATCGTGGCGGCTACTATACAGCACGCTTCATTGTGACCGCACTGGGTCTGTTAAGTGCCATCAACTGGCCGAACATCCCGGGCCGTGAGTCTTTTCAAGGCGAAATGTATCATACCGCCGCCTGGCCGAAAGATGTTGAACTGCGCGGCAAGCGCGTGGGTGTGATCGGTACAGGTAGCACCGGTGTGCAGCTGATCACCGCCATTGCACCGGAGGTGAAGCACCTGACCGTTTTTCAGCGTACCCCGCAGTATAGCGTTCCGACAGGCAATCGCCCGGTTAGCGCCCAGGAAATCGCAGAAGTGAAACGCAACTTTAGCAAAGTGTGGCAGCAGGTGCGTGAGAGTGCCGTTGCCTTTGGCTTTGAGGAAAGCACCGTGCCGGCAATGAGCGTTAGCGAGGCAGAACGCCAGCGTGTTTTCCAGGAAGCATGGAATCAGGGCAACGGCTTTTACTATATGTTTGGCACCTTTTGCGATATCGCCACAGATCCGCAGGCCAACGAGGCAGCCGCCACCTTCATTCGTAATAAGATCGCCGAAATCGTTAAAGATCCGGAGACAGCCCGCAAACTGACACCGACAGACGTTTATGCCCGTCGTCCGCTGTGCGATAGCGGCTACTATCGCACCTACAATCGTAGCAACGTGAGCCTGGTGGATGTGAAGGCCACCCCGATCAGTGCAATGACCCCGCGCGGCATTCGTACCGCAGATGGCGTGGAGCATGAACTGGACATGCTGATTCTGGCAACCGGCTACGACGCCGTTGATGGCAACTATCGCCGTATTGATCTGCGTGGCCGCGGTGGCCAGACCATTAACGAACACTGGAATGACACCCCTACCAGCTATGTTGGCGTGAGCACCGCCAATTTTCCGAACATGTTCATGATTCTGGGCCCTAACGGCCCGTTCACCAATCTGCCGCCGAGTATCGAAGCCCAGGTGGAATGGATTACCGATCTGGTGGCACACATGCGTCAGCACGGTCTGGCAACCGCCGAACCTACCCGCGATGCCGAAGATGCCTGGGGTCGTACCTGTGCAGAGATTGCCGAGCAGACCCTGTTCGGCCAGGTGGAAAGCTGGATCTTTGGCGCAAACAGCCCGGGTAAGAAGCATACCCTGATGTTTTATCTGGCCGGCCTGGGCAATTACCGCAAACAGCTGGCCGATGTGGCAAATGCCCAGTATCAGGGCTTTGCCTTCCAGCCTCTGTAA；
(1)引入突变：根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸设计引物，设计包含有M25A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.3)：gccggttttggcggcatgtatgcgctgcacaagc；
下游引物(SEQ ID NO.4)：gcttgtgcagcgcatacatgccgccaaaaccggc；
将引物和模板质粒混合后，加入高保真Taq聚合酶KOD-Plus，进行全质粒PCR扩增，PCR结束后电泳检测PCR产物，所述PCR扩增体系如下：
体系 加入量(μL) 终浓度
KOD-Plus酶(1.0U/μL) 1 1.0U/50μL
10×PCR缓冲液 5 1×
2mM dNTP 5 0.2mM
25mM MgSO<sub>4</sub> 2 1.0mM
上、下游引物(10pmol/μL) 3 0.3μM
DNA模板 1 0.3μM
ddH<sub>2</sub>O 加至50μL
；
所述PCR反应的扩增条件如下：
(2)转化：加入Dpn I酶，消化模板，转入大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，37℃过夜培养，挑取单克隆到试管；
(3)诱导表达：由试管接种到1.5L摇瓶，37℃培养至OD600至1时，降低培养温度至25℃，加入终浓度为0.1mM IPTG诱导表达16h；
(4)反应验证：10mL的反应瓶中加入底物(3-氯苄基)二甲基硫醚40mg，加入0.1M的Tris-HCl 9.0，20mg异丙醇，0.4mg的NADP+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶CHMO(0.1wt)，混匀，总体积为1mL，于50℃、200转摇床，反应16小时。
实施例2单点突变(P106R)的单加氧酶突变体
对P106R进行定点突变，具体步骤如下：
引入突变：设计包含有P106R位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.5)：cgtctggatttacgccgtgacattcagctgaac；
下游引物(SEQ ID NO.6)：gttcagctgaatgtcacggcgtaaatccagacg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例3单点突变(R159L)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有R159L位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.7)：cgaacatcccgggccttgagtcttttcaagg；
下游引物(SEQ ID NO.8)：ccttgaaaagactcaaggcccgggatgttcg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例4单点突变(A265E)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有A265E位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.9)：gagcgttagcgaggaagaacgccagcgtg；
下游引物(SEQ ID NO.10)：cacgctggcgttcttcctcgctaacgctc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例5单点突变(C289S)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有C289S位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.11)：tttactatatgtttggcacctttagcgatatcgccacag；
下游引物(SEQ ID NO.12)：ctgtggcgatatcgctaaaggtgccaaacatatagtaaa；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例6单点突变(M377V)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有M377V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.13)：ggagcatgaactggacgtgctgattctggcaac；
下游引物(SEQ ID NO.14)：gttgccagaatcagcacgtccagttcatgctcc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例7单点突变(L380F)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有L380F位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.15)：agcatgaactggacatgctgattttcgcaaccggctac；
下游引物(SEQ ID NO.16)：gtagccggttgcgaaaatcagcatgtccagttcatgct；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例8单点突变(P435L)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有P435L位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.17)：gggccctaacggcctgttcaccaatctgc；
下游引物(SEQ ID NO.18)：gcagattggtgaacaggccgttagggccc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例9单点突变(F436Y)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有F436Y位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.19)：gggccctaacggcccgtataccaatctgccg；
下游引物(SEQ ID NO.20)：cggcagattggtatacgggccgttagggccc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例10单点突变(T437A)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有T437A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.21)：taacggcccgttcgccaatctgccgcc；
下游引物(SEQ ID NO.22)：ggcggcagattggcgaacgggccgtta；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例11单点突变(L439S)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有L439S位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.23)：cctaacggcccgttcaccaattcgccgccgagta；
下游引物(SEQ ID NO.24)：tactcggcggcgaattggtgaacgggccgttagg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例12单点突变(A474E)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有A474E位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.25)：gcgatgccgaagatgagtggggtcgtacctg；
下游引物(SEQ ID NO.26)：caggtacgaccccactcatcttcggcatcgc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例13单点突变(C479V)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有C479V位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.27)：gcctggggtcgtaccgttgcagagattgccga；
下游引物(SEQ ID NO.28)：tcggcaatctctgcaacggtacgaccccaggc；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例14单点突变(Q490K)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有Q490K位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.29)：agaccctgttcggcaaggtggaaagctgg；
下游引物(SEQ ID NO.30)：ccagctttccaccttgccgaacagggtct；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例15单点突变(I495A)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有I495A位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.31)：ccaggtggaaagctgggcctttggcgcaaacagc；
下游引物(SEQ ID NO.32)：gctgtttgcgccaaaggcccagctttccacctgg；
其他方法和步骤同实施例1。
实施例16单点突变(S500I)的单加氧酶突变体
引入突变：设计包含有S500I位点的正、反向引物，所述正、反向引物如下：
上游引物(SEQ ID NO.33)：gctggatctttggcgcaaacatcccgggtaaga；
下游引物(SEQ ID NO.34)：tcttacccgggatgtttgcgccaaagatccagc；
其他方法和步骤同实施例1。
转化率检测
反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟，取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm，结果如表1所示。
稳定性检测
取两份单加氧酶SEQ ID NO：1质量都为4mg，其中一份加入终浓度为10％的异丙醇在30℃放置1h，另一份不加异丙醇在30℃放置1h，然后按照如下体系进行反应：
10mL的反应瓶中加入底物(3-氯苄基)二甲基硫醚40mg，加入0.1M的Tris-HCl9.0，20mg异丙醇，0.4mg的NADP+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶CHMO，混匀，总体积为1mL，于50℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟。取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm。
突变体稳定性表示为异丙醇中保温的单加氧酶转化率占不加异丙醇保温的单加氧酶转化率的百分比，结果如表1所示。
表1
突变体 突变位点 酶用量 转化率(％) 残余活力(％)
对照 N/A 0.2wt 35.1 50.3
实施例1 M25A 0.1wt 48.1 47.2
实施例2 P106R 0.1wt 55.5 51.1
实施例3 R159L 0.1wt 67.8 43.5
实施例4 A265E 0.1wt 59.7 62.7
实施例5 C289S 0.1wt 72.5 46.8
实施例6 M377V 0.1wt 53.7 57.5
实施例7 L380F 0.1wt 56.6 56.3
实施例8 P435L 0.1wt 41.2 45.7
实施例9 F436Y 0.1wt 48.5 50.6
实施例10 T437A 0.1wt 44.4 49.6
实施例11 L439S 0.1wt 40.9 47.8
实施例12 A474E 0.1wt 52.5 64.8
实施例13 C479V 0.1wt 57.5 46.6
实施例14 A490K 0.1wt 58.2 60.2
实施例15 I495A 0.1wt 62.1 42.1
实施例16 S500I 0.1wt 60.6 59.2
从表1可以看出，单点突变体的转化效果较母本有所提高，但并未达到理想的效果，单点突变体中实施例4(A265E)、实施例8(A474E)、实施例10(A490K)的在异丙醇中的残余活力提高到60％以上，一般而言，单点突变的突变体性能较母本很难有较大差异，突变点的组合可以获得更优的突变体。
实施例17单点突变的单加氧酶突变体
引入突变：设计分别包含有其他23个位点(M23L、A74D、M75L、A93E、L110F、M117A、T137R、W153F、M166L、M260L、M284I、C334L、A359E、M360I、M426L、M428F、P435A、F436L、F436A、T437S、T437Y、L439G、L439A、M457L、I495F、I495V或M508L)的正、反向引物，具体引物如下表2所示：
表2
其他方法和步骤同实施例1。
活性验证
将培养后的菌株采用超声破碎，检测上清和沉淀中蛋白的表达量，结果如表3所示：
表3
从表3可以看出，虽然这些位点并没有提高单加氧酶转化率，但是能够提高单加氧酶的可溶性表达，尤其是A74D、M153F显著提高了上清的表达量。
实施例18多点突变的单加氧酶突变体
通过DNA shuffling的方法将突变位点进行随机重组，建立突变文库，然后进行筛选，制备得到多点突变的单加氧酶突变体，具体步骤如下：
(1)PCR获得带有M25A、P106R、A265E、M377V、A474E、C479V、Q490K、I495A和S500I突变位点的同源基因，将PCR产物进行纯化后，按照等摩尔量将这些基因进行混合，然后用核酸酶I消化成随机片段，由这些随机片段组成文库，互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，发生模板互换和基因重组，所述N-PCR的反应体系如下：
体系 加入量(μL)
10×PFU缓冲液 5
dNTP 5
DNA模板(80～200bp) 6
Pfu聚合酶(2.5U) 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O 加至50μL
；
所述N-PCR反应的扩增条件如下：
(2)转化和筛选：将制备得到的产物，转入大肠杆菌中，培养；
(3)酶液制备：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μL酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素0.5mg/mL，pH＝7.0)，37℃保温破碎3h；
(4)高通量筛选：250μL测活体系：底物(3-氯苄基)二甲基硫醚终浓度2mM，NADPH终浓度0.3mM，破碎酶液加入量100μL，pH＝9.0，温度30℃，筛选得到的突变体进行摇瓶培养，再进行放大反应；
(5)诱导表达：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜；
(6)反应验证：10mL的反应瓶中加入底物40mg，加入0.1M的Tris-HCl 9.0，20mg异丙醇，0.4mg的NADP+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶CHMO(0.1wt)，混匀，总体积为1mL，于50℃、200转摇床，反应16小时。
转化率检测
反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟，取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm，结果如表2所示。
稳定性检测
取两份单加氧酶SEQ ID NO：1质量都为4mg，其中一份加入终浓度为10％的异丙醇在30℃放置1h，另一份不加异丙醇在30℃放置1h，然后按照如下体系进行反应：
10mL的反应瓶中加入底物40mg，加入0.1M的Tris-HCl 9.0，20mg异丙醇，0.4mg的NADP+，4mg醇脱氢酶，加入4mg单加氧酶CHMO，混匀，总体积为1mL，于50℃、200转摇床，反应16小时。反应样品体系加入3mL乙腈，混匀后置于5mL的EP管中，12000转离心3分钟。取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm。
突变体稳定性表示为异丙醇中保温的单加氧酶转化率占不加异丙醇保温的单加氧酶转化率的百分比，结果如表4所示。
表4
从表4可以看出，多点突变体相比于单点突变的转化效果大部分进一步的提高，有一小部分虽然转化效果没有提高，但稳定性有提高，可见多点突变会进一步提高单加氧酶的性质，其中，多点突变体中S500I-A265E-M25A突变体、S500I-A265E-M25A-A474E突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K突变体、S500I-A265E-M25A-A474E-P106R突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K-P106R突变体和S500I-A265E-M25A-A474E-Q490K突变体的转化率能达到90％以上，在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，进一步验证这6个突变体的放大反应效果。。
实施例19多点突变体的放大反应的验证
进一步验证制备得到的S500I-A265E-M25A突变体、S500I-A265E-M25A-A474E突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K突变体、S500I-A265E-M25A-A474E-P106R突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K-P106R突变体和S500I-A265E-M25A-A474E-Q490K突变体的收率，具体步骤如下：
(1)250mL的反应瓶中加入底物(3-氯苄基)二甲基硫醚1g，加入0.1M的Tris-HCl9.0，500mg异丙醇，10mg的NADP+，100mg醇脱氢酶，加入100mg单加氧酶CHMO，混匀，总体积为25mL，于50℃、200转摇床，反应16小时；
(2)从反应样品体系中取样1mL加入3ml乙腈，混匀后置于5ml的EP管中，12000转离心3分钟。取100μL上清于送样瓶中，加入90％乙腈900μL，HPLC检测，检测波长210nm；
(3)反应结束后，加入50mL的乙酸乙酯进行萃取3次，合并萃取有机相后加入硫酸镁进行干燥，旋转蒸发至干，称量，结果如表5所示：
表5
突变位点 收率(％) e.e.(％)
S500I-A265E-M25A 86.5 99
S500I-A265E-M25A-A474E 89.5 99
S500I-A265E-M25A-Q490K 90.2 99
S500I-A265E-M25A-A474E-P106R 88.9 99
S500I-A265E-M25A-Q490K-P106R 90.8 99
S500I-A265E-M25A-A474E-Q490K 89.3 99
从表5可以看出，这6个突变体的收率都可达86％以上，e.e.值都在99％，特别是SEQ ID NO.5(S500I-A265E-M25A-Q490K)突变体的收率可达90.2％，e.e.值99％，可见多位点突变取得了很好的效果。
综上所述，本发明通过验证发现在原单加氧酶的基础上通过这12个位点的单独突变，即M25A、P106R、R159L、A265E、C289S、M377V、L380F、A474E、C479V、Q490K、I495A和S500I，能够提高单加氧酶的活性，通过将这12个位点的突变进行组合，得到的突变体S500I-A265E-M25A突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K突变体、S500I-A265E-M25A-A474E-P106R突变体、S500I-A265E-M25A-Q490K-P106R突变体和S500I-A265E-M25A-A474E-Q490K突变体这五个突变体的收率最高，能达到86％以上，酶在异丙醇中的残余活力能达到60％以上，转化率能达到90％以上。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120> 一种单加氧酶突变体及其制备方法和应用
<130> 2017
<160> 88
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
Met Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ala Ile His Phe Asp Ala Ile Val Val
1 5 10 15
Gly Ala Gly Phe Gly Gly Met Tyr Met Leu His Lys Leu Arg Asp Gln
20 25 30
Leu Gly Leu Lys Val Lys Val Phe Asp Thr Ala Gly Gly Ile Gly Gly
35 40 45
Thr Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr His Ser
50 55 60
His Val Tyr Gln Tyr Ser Phe Asp Glu Ala Met Leu Gln Glu Trp Thr
65 70 75 80
Trp Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Gln Pro Glu Ile Leu Ala Tyr Leu Glu
85 90 95
Tyr Val Ala Asp Arg Leu Asp Leu Arg Pro Asp Ile Gln Leu Asn Thr
100 105 110
Thr Val Thr Ser Met His Phe Asn Glu Val His Asn Ile Trp Glu Val
115 120 125
Arg Thr Asp Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Ala Arg Phe Ile Val Thr Ala
130 135 140
Leu Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Trp Pro Asn Ile Pro Gly Arg Glu
145 150 155 160
Ser Phe Gln Gly Glu Met Tyr His Thr Ala Ala Trp Pro Lys Asp Val
165 170 175
Glu Leu Arg Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly
180 185 190
Val Gln Leu Ile Thr Ala Ile Ala Pro Glu Val Lys His Leu Thr Val
195 200 205
Phe Gln Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Thr Gly Asn Arg Pro Val
210 215 220
Ser Ala Gln Glu Ile Ala Glu Val Lys Arg Asn Phe Ser Lys Val Trp
225 230 235 240
Gln Gln Val Arg Glu Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr
245 250 255
Val Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Gln Arg Val Phe Gln
260 265 270
Glu Ala Trp Asn Gln Gly Asn Gly Phe Tyr Tyr Met Phe Gly Thr Phe
275 280 285
Cys Asp Ile Ala Thr Asp Pro Gln Ala Asn Glu Ala Ala Ala Thr Phe
290 295 300
Ile Arg Asn Lys Ile Ala Glu Ile Val Lys Asp Pro Glu Thr Ala Arg
305 310 315 320
Lys Leu Thr Pro Thr Asp Val Tyr Ala Arg Arg Pro Leu Cys Asp Ser
325 330 335
Gly Tyr Tyr Arg Thr Tyr Asn Arg Ser Asn Val Ser Leu Val Asp Val
340 345 350
Lys Ala Thr Pro Ile Ser Ala Met Thr Pro Arg Gly Ile Arg Thr Ala
355 360 365
Asp Gly Val Glu His Glu Leu Asp Met Leu Ile Leu Ala Thr Gly Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Asp Leu Arg Gly Arg Gly
385 390 395 400
Gly Gln Thr Ile Asn Glu His Trp Asn Asp Thr Pro Thr Ser Tyr Val
405 410 415
Gly Val Ser Thr Ala Asn Phe Pro Asn Met Phe Met Ile Leu Gly Pro
420 425 430
Asn Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Ala Gln Val Glu
435 440 445
Trp Ile Thr Asp Leu Val Ala His Met Arg Gln His Gly Leu Ala Thr
450 455 460
Ala Glu Pro Thr Arg Asp Ala Glu Asp Ala Trp Gly Arg Thr Cys Ala
465 470 475 480
Glu Ile Ala Glu Gln Thr Leu Phe Gly Gln Val Glu Ser Trp Ile Phe
485 490 495
Gly Ala Asn Ser Pro Gly Lys Lys His Thr Leu Met Phe Tyr Leu Ala
500 505 510
Gly Leu Gly Asn Tyr Arg Lys Gln Leu Ala Asp Val Ala Asn Ala Gln
515 520 525
Tyr Gln Gly Phe Ala Phe Gln Pro Leu
530 535
<210> 2
<211> 1614
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
atgagtagca gcccgagcag cgccatccac tttgacgcca ttgtggtggg tgccggtttt 60
ggcggcatgt atatgctgca caagctgcgc gaccagctgg gcctgaaagt taaagtgttc 120
gacaccgccg gtggtattgg tggtacctgg tactggaacc gctatccggg tgccctgagc 180
gacacccata gccacgtgta ccagtacagc ttcgatgagg ccatgctgca ggagtggaca 240
tggaaaaata aatatctgac ccagccggaa atcctggcat atctggaata cgtggccgat 300
cgtctggatt tacgccctga cattcagctg aacaccaccg ttaccagcat gcattttaac 360
gaggtgcaca atatctggga agttcgcacc gatcgtggcg gctactatac agcacgcttc 420
attgtgaccg cactgggtct gttaagtgcc atcaactggc cgaacatccc gggccgtgag 480
tcttttcaag gcgaaatgta tcataccgcc gcctggccga aagatgttga actgcgcggc 540
aagcgcgtgg gtgtgatcgg tacaggtagc accggtgtgc agctgatcac cgccattgca 600
ccggaggtga agcacctgac cgtttttcag cgtaccccgc agtatagcgt tccgacaggc 660
aatcgcccgg ttagcgccca ggaaatcgca gaagtgaaac gcaactttag caaagtgtgg 720
cagcaggtgc gtgagagtgc cgttgccttt ggctttgagg aaagcaccgt gccggcaatg 780
agcgttagcg aggcagaacg ccagcgtgtt ttccaggaag catggaatca gggcaacggc 840
ttttactata tgtttggcac cttttgcgat atcgccacag atccgcaggc caacgaggca 900
gccgccacct tcattcgtaa taagatcgcc gaaatcgtta aagatccgga gacagcccgc 960
aaactgacac cgacagacgt ttatgcccgt cgtccgctgt gcgatagcgg ctactatcgc 1020
acctacaatc gtagcaacgt gagcctggtg gatgtgaagg ccaccccgat cagtgcaatg 1080
accccgcgcg gcattcgtac cgcagatggc gtggagcatg aactggacat gctgattctg 1140
gcaaccggct acgacgccgt tgatggcaac tatcgccgta ttgatctgcg tggccgcggt 1200
ggccagacca ttaacgaaca ctggaatgac acccctacca gctatgttgg cgtgagcacc 1260
gccaattttc cgaacatgtt catgattctg ggccctaacg gcccgttcac caatctgccg 1320
ccgagtatcg aagcccaggt ggaatggatt accgatctgg tggcacacat gcgtcagcac 1380
ggtctggcaa ccgccgaacc tacccgcgat gccgaagatg cctggggtcg tacctgtgca 1440
gagattgccg agcagaccct gttcggccag gtggaaagct ggatctttgg cgcaaacagc 1500
ccgggtaaga agcataccct gatgttttat ctggccggcc tgggcaatta ccgcaaacag 1560
ctggccgatg tggcaaatgc ccagtatcag ggctttgcct tccagcctct gtaa 1614
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
gccggttttg gcggcatgta tgcgctgcac aagc 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
gcttgtgcag cgcatacatg ccgccaaaac cggc 34
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
cgtctggatt tacgccgtga cattcagctg aac 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
gttcagctga atgtcacggc gtaaatccag acg 33
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
cgaacatccc gggccttgag tcttttcaag g 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
ccttgaaaag actcaaggcc cgggatgttc g 31
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 9
gagcgttagc gaggaagaac gccagcgtg 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 10
cacgctggcg ttcttcctcg ctaacgctc 29
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 11
tttactatat gtttggcacc tttagcgata tcgccacag 39
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 12
ctgtggcgat atcgctaaag gtgccaaaca tatagtaaa 39
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 13
ggagcatgaa ctggacgtgc tgattctggc aac 33
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 14
gttgccagaa tcagcacgtc cagttcatgc tcc 33
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 15
agcatgaact ggacatgctg attttcgcaa ccggctac 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 16
gtagccggtt gcgaaaatca gcatgtccag ttcatgct 38
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 17
gggccctaac ggcctgttca ccaatctgc 29
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 18
gcagattggt gaacaggccg ttagggccc 29
<210> 19
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 19
gggccctaac ggcccgtata ccaatctgcc g 31
<210> 20
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 20
cggcagattg gtatacgggc cgttagggcc c 31
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 21
taacggcccg ttcgccaatc tgccgcc 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 22
ggcggcagat tggcgaacgg gccgtta 27
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 23
cctaacggcc cgttcaccaa ttcgccgccg agta 34
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 24
tactcggcgg cgaattggtg aacgggccgt tagg 34
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 25
gcgatgccga agatgagtgg ggtcgtacct g 31
<210> 26
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 26
caggtacgac cccactcatc ttcggcatcg c 31
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 27
gcctggggtc gtaccgttgc agagattgcc ga 32
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 28
tcggcaatct ctgcaacggt acgaccccag gc 32
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 29
agaccctgtt cggcaaggtg gaaagctgg 29
<210> 30
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 30
ccagctttcc accttgccga acagggtct 29
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 31
ccaggtggaa agctgggcct ttggcgcaaa cagc 34
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 32
gctgtttgcg ccaaaggccc agctttccac ctgg 34
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 33
gctggatctt tggcgcaaac atcccgggta aga 33
<210> 34
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 34
tcttacccgg gatgtttgcg ccaaagatcc agc 33
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 35
gccggttttg gcggcttgta tatgctgcac a 31
<210> 36
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 36
tgtgcagcat atacaagccg ccaaaaccgg c 31
<210> 37
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 37
acagcttcga tgaggacatg ctgcaggagt g 31
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 38
cactcctgca gcatgtcctc atcgaagctg t 31
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 39
gcttcgatga ggccttgctg caggagtgg 29
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 40
ccactcctgc agcaaggcct catcgaagc 29
<210> 41
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 41
ccagccggaa atcctggaat atctggaata cgtgg 35
<210> 42
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 42
ccacgtattc cagatattcc aggatttccg gctgg 35
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 43
tacgccctga cattcagttc aacaccaccg ttaccag 37
<210> 44
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 44
ctggtaacgg tggtgttgaa ctgaatgtca gggcgta 37
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 45
gaacaccacc gttaccagcg cgcattttaa cgaggtgcac 40
<210> 46
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 46
gtgcacctcg ttaaaatgcg cgctggtaac ggtggtgttc 40
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 47
gatcgtggcg gctactatag agcacgcttc a 31
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 48
tgaagcgtgc tctatagtag ccgccacgat c 31
<210> 49
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 49
cgggatgttc gggaagttga tggcacttaa cagaccc 37
<210> 50
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 50
gggtctgtta agtgccatca acttcccgaa catcccg 37
<210> 51
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 51
tgagtctttt caaggcgaat tgtatcatac cgccg 35
<210> 52
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 52
cggcggtatg atacaattcg ccttgaaaag actca 35
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 53
gcaccgtgcc ggcattgagc gttagcg 27
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 54
cgctaacgct caatgccggc acggtgc 27
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 55
atcagggcaa cggcttttac tatatatttg gcaccttttg 40
<210> 56
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 56
caaaaggtgc caaatatata gtaaaagccg ttgccctgat 40
<210> 57
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 57
gcccgtcgtc cgctgttaga tagcggctac tatc 34
<210> 58
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 58
gatagtagcc gctatctaac agcggacgac gggc 34
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 59
accccgatca gtgaaatgac cccgcgc 27
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 60
gcgcggggtc atttcactga tcggggt 27
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 61
accccgatca gtgcaataac cccgcgc 27
<210> 62
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 62
gcgcggggtt attgcactga tcggggt 27
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 63
ccgccaattt tccgaacttg ttcatgattc tgggc 35
<210> 64
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 64
gcccagaatc atgaacaagt tcggaaaatt ggcgg 35
<210> 65
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 65
caattttccg aacatgttct tcattctggg ccctaacggc c 41
<210> 66
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 66
ggccgttagg gcccagaatg aagaacatgt tcggaaaatt g 41
<210> 67
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 67
gggccctaac ggcgcgttca ccaatct 27
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 68
agattggtga acgcgccgtt agggccc 27
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 69
gccctaacgg cccgttaacc aatctgcc 28
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 70
ggcagattgg ttaacgggcc gttagggc 28
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 71
gccctaacgg cccggccacc aatctgccgc 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 72
gcggcagatt ggtggccggg ccgttagggc 30
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 73
acggcccgtt cagcaatctg ccgcc 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 74
ggcggcagat tgctgaacgg gccgt 25
<210> 75
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 75
gccctaacgg cccgttctat aatctgccgc cgagtat 37
<210> 76
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 76
atactcggcg gcagattata gaacgggccg ttagggc 37
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 77
acggcccgtt caccaatggg ccgccgag 28
<210> 78
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 78
ctcggcggcc cattggtgaa cgggccgt 28
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 79
acggcccgtt caccaatgcg ccgccgag 28
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 80
ctcggcggcg cattggtgaa cgggccgt 28
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 81
tctggtggca cacttgcgtc agcacgg 27
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 82
ccgtgctgac gcaagtgtgc caccaga 27
<210> 83
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 83
ccaggtggaa agctggttct ttggcgcaaa cag 33
<210> 84
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 84
ctgtttgcgc caaagaacca gctttccacc tgg 33
<210> 85
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 85
ccaggtggaa agctgggtct ttggcgcaaa cag 33
<210> 86
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 86
ctgtttgcgc caaagaccca gctttccacc tgg 33
<210> 87
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 87
gtaagaagca taccctgttg ttttatctgg ccggc 35
<210> 88
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 88
gccggccaga taaaacaaca gggtatgctt cttac 35

Claims (10)

1.一种单加氧酶突变体，其特征在于，其具有与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的23至508位氨基酸经取代一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；
所述取代为第23位、第25位、第47位、第75位、第93位、第106位、第110位、第117位、第137位、第153位、第159位、第166位、第260位、第265位、第284位、第289位、第334位、第359位、第360位、第377位、第380位、第426位、第428位、第435位、第436位、第437位、第439位、第457位、第474位、第479位、第490位、第495位、第500位或第508位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；
其中，所述突变体具有单加氧酶的活性。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的突变位点为M23L、M25A、A74D、M75L、A93E、P106R、L110F、M117A、T137R、W153F、R159L、M166L、M260L、A265E、M284I、C289S、C334L、A359E、M360I、M377V、L380F、M426L、M428F、P435L、P435A、F436L、F436Y、F436A、T437S、T437A、T437Y、L439G、L439A、L439S、M457L、A474E、C479V、Q490K、I495F、I495V、I495A、S500I或M508L中的任意一个或至少两个的组合。
3.根据权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述取代为第25位、第106位、第159位、第265位、第289位、第377位、第380位、第435位、第436位、第437位、第439位、第474位、第479位、第490位、第495位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；
优选地，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、R159L、A265E、C289S、M377V、L380F、P435L、F436Y、T437A、L439S、A474E、C479V、Q490K、I495A或S500I中的任意一个或至少两个的组合；
优选地，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、R159L、A265E、C289S、M377V、L380F、P435L、F436Y、T437A、L439S、A474E、C479V、Q490K、I495A或S500I中的任意一个或至少两个的组合时，所述突变体单加氧酶转化率为40％以上。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的突变体，其特征在于，所述取代为第25位、第106位、第265位、第474位、第490位或第500位中的任意一个或至少两个的氨基酸被取代；
优选地，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、A265E、A474E、Q490K或S500I中的任意一个或至少两个的组合；
优选地，所述突变体的突变位点为M25A、P106R、A265E、A474E、Q490K或S500I中的任意一个或至少两个的组合时，所述突变体单加氧酶转化率为48％以上。
5.编码如权利要求1-4中任一项所述的单加氧酶突变体的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求5所述的核苷酸序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体。
8.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的突变体的方法，其特征在于，包括：
(1)制备重组宿主细胞，其中所述细胞包含DNA分子，所述DNA分子包含编码根据权利要求1-4中任一项所述突变体的核酸序列；
(2)在适合表达所述突变体的培养基中孵育所述宿主细胞；
(3)从所述培养基中回收步骤(2)中由所述宿主细胞表达的所述突变体的多肽。
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-4中任一项所述的突变体的多肽；
优选地，所述组合物为干粉、片剂或液体中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求1-4中任一项所述的突变体在制备手性药物中的应用。
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