DE102006039189B4

DE102006039189B4 - Enantioselektive Darstellung von aliphatischen azyklischen Estern und Ketonen

Info

Publication number: DE102006039189B4
Application number: DE200610039189
Authority: DE
Inventors: Uwe T. Prof. Dr. Bornscheuer; Anett Dipl.-Biochem. Kirschner
Original assignee: Ernst Moritz Arndt Universitaet Greifswald
Current assignee: Universitaet Greifswald
Priority date: 2006-08-21
Filing date: 2006-08-21
Publication date: 2010-07-29
Anticipated expiration: 2026-08-22
Also published as: WO2008022627A2; EP2054510A2; WO2008022627A3; DE102006039189A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger-Oxidation enantioselektiv ist und man zur Oxidation Baeyer-Villiger Monooxygenasen verwendet, wobei eine Enantioselektivität E von mindestens 10 erreicht wird, wobei die Ketone eine Formel

aufweisen, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein substituierter oder unsubstituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, ein Hydroxyalkylrest, Carboxylrest, Alkoxycarboxyrest, Aminorest, Aminoalkylrest, Aminocarbonylrest, Hydroxylrest oder ein Halogenrest ist,
wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein können,
mit der Maßgabe, dass R2, R3 und R4 sich unterscheiden, wobei R3 oder R4 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 1–4 C-Atomen und R3 oder R4 Wasserstoff ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enantioselektiven (stereoselektiven) Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation. Ferner ist Gegenstand der Erfindung die kinetische enzymatische Racematspaltung von racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen.
1899 berichteten Baeyer und Villiger von einer Reaktion zyklischer Ketone mit Peroxymonoschwefelsäure, bei der Laktone dargestellt wurden (Baeyer und Villiger 1899). Die Baeyer-Villiger-Reaktion wurde seitdem bei organischen Synthesen verwendet. Die chemische Baeyer-Villiger-Oxidation wird normalerweise durch Persäuren katalysiert und findet in einem zweischrittigen Verfahren statt, das durch Criegee beschrieben wurde (Criegee 1948).
Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs, E.C. 1.14.13.x) sind Enzyme, die zu der Klasse der Oxidoreduktasen gehören und aliphatische und zyklische Ketone unter Verwendung von Sauerstoff in Ester und Laktone umwandeln können (Mihovilovic et al., 2002).
BVMOs sind Flavin-abhängig (im allgemeinen FAD) und benötigen NAD(P)H, um die Oxidationsreaktion zu katalysieren. BVMOs können von einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen gebildet werden. Die am besten untersuchte BVMO ist bisher ein Enzym aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871, welches auch als Cyclohexanon Monooxygenase (CHMO) bezeichnet wird. Dieses Enzym konvertiert eine Vielzahl von mono- und bizyklischen Ketonen (Donoghue et al. 1976, Stewart 1998). Neben Monooxygenasen, die Cycloketone umwandeln, welche auch in Comamonas (Griffin und Trudgill 1976), Nocardia (Donoghue et al. 1976), Rhodococcus (Brzostowicz et al. 2003, Kostichka et al. 2001, WO 03/020890 ), Brevibacterium (Brzostowicz et al. 2002, WO 03/020890 ), Arthrobacter (Brzostowicz et al. 2003, Kyte et al. 2004, WO 03/020890 ) und Xanthobacter sp. (van Beilen et al. 2003) gefunden wurden, wurde auch von anderen BVMOs berichtet, die aromatische Ketone, zum Beispiel die 4-Hydroxyacetophenon Monooxygenase (Kamerbeek et al. 2001) und die Phenylaceton Monooxygenase (Fraaije et al. 2005) oder aliphatische offenkettige Ketone (Britton und Markovetz 1977, Fraaije et al. 2004) umwandeln können.
WO 2004/007750 offenbart die Identifizierung neuer BVMO und deren Modifizierung mit Hilfe der Homologie zu offenbarten Sequenzen von BMVO aus S. diversa und die Verwendung dieser Enzyme. Fraaije et al. (2005) Appl. Biotechnol. Vol. 66, Seiten 393–400 und Torres Pazmino et al. (2005) J. Biotechnol. Vol. 118, Suppl. 1, S. 129 beschreiben eine neue BVMO aus T. fusca und ihr Substratspektrum.
Da es auch in industriellen Verfahren immer mehr von Interesse ist, Baeyer-Villiger-Oxidationen enantioselektiv durchzuführen (Mihovilovic et al. 2004), stellen BVMOs neben Metall- basierten chiralen Katalysatoren (Strukul 1998) eine Möglichkeit dar, um enantioselektiv Ester und Laktone darzustellen.
Bisher wurde beschrieben, dass Substrate für Baeyer-Villiger Monooxygenasen (racemische oder prochirale) mono- und bizyklische Ketone (Alphand und Furstoss 1992, Carnell et al. 1991, Mihovilovic et al. 2005, Taschner und Black 1988, Taschner et al. 1993, Taschner und Peddada 1992) und racemische aromatische Ketone (Kamerbeek et al. 2003, Fraaije et al. 2005, Gonzalo et al. 2005) sein können, so dass hier eine enantioselektive Baeyer-Villiger-Oxidationen möglich ist.
Eine enzymatische Konversion racemischer aliphatischer azyklischer Ketone wurde demgegenüber bisher nicht beschrieben.
Eine chemische Baeyer-Villiger-Oxidation von aliphatischen azyklischen Ketonen ist bekannt. Park und Kozikowski (1988) berichteten von einer chemischen Baeyer-Villiger-Oxidation von β-Hydroxyketonen unter Verwendung von Persäuren, bei der acylierte Diole entstanden. Die Reaktionen wurden jedoch nicht enantioselektiv durchgeführt.
Demgegenüber stellt sich dem Fachmann die Aufgabe, ein Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern bereitzustellen. Weiterhin besteht ein Bedarf, aliphatische azyklische Ketone enantioselektiv bereitstellen zu können.
Die vorliegende Erfindung löst diese Aufgaben durch den Gegenstand der Anspüche, in allgemeiner Weise durch den von Anspruch 1. Sie stellt ein Verfahren zur Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation zur Verfügung, bei dem die Baeyer-Villiger-Oxidation enantioselektiv verläuft und man zur Oxidation Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMO) verwendet.
Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass optisch aktive aliphatische azyklische Ketone überhaupt Substrate von Baeyer-Villiger Monooxygenasen sein können, und dass diese mit hoher Enantioselektivität umgesetzt werden können.
Damit kann bei aliphatischen azyklischen Ketonen nun erstmals eine enantioselektive Baeyer-Villiger-Oxidation durchgeführt werden.
Diese wird als enantioselektiv bzw. als stereoselektiv bezeichnet, wenn eine Enantioselektivität E von mehr als 1, bevorzugt mehr als 2 erreicht wird, also ein Enantiomer gegenüber dem anderen im Überschuß vorliegt. Eine industrielle Anwendung ist vor allem lohnend, wenn eine hohe Enantioselektivität E von mindestens 10, bevorzugt von mindestens 40 erreicht wird. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass bei der enzymatischen Umsetzung aliphatischer azyklischer Ketone mittels BVMO eine derartige Enantioselektivität erreicht wird.
Enantiomerenüberschuß und Enantioselektivität werden nach geeigneter, z. B. gaschromatographischer Analyse der Produkte der Reaktion nach folgender Formel berechnet (Chen 1982): Enantiomerenüberschuss:
mit AR – Peakfläche des (R)-Enantiomers und
As – Peakfläche des (S)-Enantiomers Umsatz:
mit ee_S – Enantiomerenüberschuss des Substrates
ee_P – Enantiomerenüberschuss des Produktes Enantioselektivität:
Bevorzugt ist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Baeyer-Villiger Monooxygenase spezifisch für aliphatische azyklische Ketone. Dabei weist die Bezeichnung aliphatische azyklische Ketone darauf hin, dass die Ketogruppe weder direkt mit einer aromatischen oder zyklischen Gruppe verbunden ist noch das Molekül aromatische oder zyklische Substituenten enthält.
Die Ketone weisen eine Formel
auf, bei der R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein substituierter oder unsubstituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, ein Hydroxyalkylrest, Carboxylrest, Alkoxycarboxylrest, Aminorest, Aminoalkylrest, Aminocarbonylrest, Hydroxylrest oder ein Halogenrest ist,
wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein können,
mit der Maßgabe, dass R2, R3 und R4 sich unterscheiden.
Bevorzugt ist R1 ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1–6 C-Atomen, insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, n-Butyl, oder Isobutyl.
R2 ist bevorzugt ein Hydroxylrest, Aminorest oder ein Halogenrest, also z. B. Chlor, Brom oder Iod. Besonders bevorzugt ist es für das erfindungsgemäße Verfahren, wenn R2 ein Hydroxylrest ist, das Keton also ein β-Hydroxyketon ist.
Das mit R2 verbundene C-Atom ist chiral, R2, R3 und R4 unterscheiden sich also. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als Edukte racemische Mischungen eingesetzt.
R3 oder R4 ist ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 1–4 C-Atomen, insbesondere 2, 3 oder 4 C-Atomen, und R3 oder R4 – also der jeweils andere Substituent – Wasserstoff. Bevorzugt ist der Alkylrest linear und unsubstituiert. Als kurzkettige Alkyreste werden in der Folge Alkylreste mit einer Kettenlänge von 1–10 C-Atomen, als mittelkettige Alkylreste solche mit einer Kettenlänge von 11–14 C-Atomen bezeichnet.
Bevorzugt ist n = 1, n kann jedoch z. B. auch 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das β-Hydroxyketon folgende Formel auf:
wobei R3 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 2–20 C-Atomen ist, insbesondere mit einer Kettenlänge von 2–10 C-Atomen. Ferner kann das β-Hydroxyketon am α-C-Atom anstelle der Methylgruppe einen Rest R1 entsprechend der obigen Definition tragen.
Unter 'linearer oder verzweigter Alkylrest' wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Kohlenwasserstoffrest der allgemeinen Formel C_nH_2n+1 verstanden. Explizit eingeschlossen sind die Reste Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sek. Butyl, tert. Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Decyl, Dodecyl.
Nicht einschränkende Beispiele für ein erfindungsgemäßes lineares oder verzweigtes Alkenyl, d. h. für einen Kohlenwasserstoffrest, der eine oder mehrere C-C-Doppelbindungen enthält, sind Propenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 3-Pentenyl, 1,3-Hexadienyl u. a..
'Alkinyl' steht für z. B. Propinyl, 2-Butinyl, 3-Butinyl, 4-Hexinyl, 1-Decinyl u. a., d. h. für einen Kohlenwasserstoffrest, der eine oder mehrere C-C-Dreifachbindungen enthält.
Es versteht sich, dass auch Kohlenwasserstoffreste eingeschlossen sind, die sowohl Doppel- als auch Dreifachbindungen enthalten.
Alle genannten Kohlenwasserstoffreste können gegebenenfalls ein- oder mehrfach substituiert sein, z. B. durch Alkyl-, Halogen-, Hydroxy- und/oder Amino-Gruppen.
Hydroxyalkyl- steht für einen vorstehend genannten Alkylrest, der hydroxyliert ist. Beispielsweise sei hier Hydroxyethyl genannt.
Aminoalkyl-, Alkylaminoalkyl- stehen jeweils für einen vorstehend genannten Alkylrest der eine Aminogruppe trägt, die mono- aber auch dialkyliert sein kann. Beispiele sind der Aminoethyl- und der Dimethylaminoethylrest.
Alkoxyalkyl steht für einen vorstehend genannten Alkylrest, an den eine Alkoxygruppe gebunden ist. Beispiele hierfür sind der Ethoxyethyl- und der Ethoxypropylrest.
Alkoxycarbonyl steht für einen Carbonylrest, an den eine Alkoxygruppe gebunden ist. Beispiele sind der Methoxycarbonyl- und der Ethoxycarbonylrest.
Alkoxycarbonylalkyl steht für einen vorstehend genannten Alkylrest an den eine Alkoxycarbonylgruppe gebunden ist. Beispiele hierfür sind der Ethoxycarbonylmethyl- und der Methoxycarbonylmethylrest.
Bevorzugt wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO) verwendet, die aus Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) oder Pseudomonas putida (P. putida) stammt oder ein funktionelles Derivat davon ist. Diese weisen eine besonders hohe Spezifität für aliphatische azyklische Ketone auf und können diese mit hoher Enantioselektivität zu Estern umsetzen.
Dabei weist die BVMO aus P. fluorescens eine besonders hohe Spezifität für Ketone auf, bei denen R3 ein kurzkettiger Alkylrest ist, z. B. mit 4, 6, oder 8 C-Atomen, so dass dieses Enzym bevorzugt zur Umsetzung dieser Ketone verwendet wird. Die BVMO aus P. putida weist eine gleichartige Spezifität auf. Bei beiden Enzymen sind β-Hydroxyketone bevorzugte Substrate.
Bevorzugt umfasst die Baeyer-Villiger Monooxygenase eine Sequenz, die eine Homologie von mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90% oder mindestens 95% zu SEQ ID NO: 1 (BVMO aus P. fluorescens) oder SEQ ID NO: 3 (BVMO aus P. putida) aufweist.
Bevorzugt weist die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Baeyer-Villiger Monooxygenase die Sequenz nach SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 auf. Die Sequenz der BVMO aus P. fluorescens ist unter der GenBank Zugangsnummer AAC36351 (Protein) bzw. AF090329 (Genom) und die Sequenz der BVMO aus P. putida unter AAN68413 (Protein) bzw. AE015451 (Genom) veröffentlicht.
Als funktionelles Derivat ist die BVMO in der Lage, aliphatische azyklische Ketone in einer Baeyer-Villiger-Oxidation zu Estern umzusetzen. Die Effektivität der Umsetzung liegt bevorzugt mindestens bei C = 10% oder 30%, mehr bevorzugt bei mindestens C = 50% der Umsetzung durch das natürlich vorkommende Enzym.
Das Baeyer-Villiger Monooxygenase-Sequenzmotiv, das von Fraaije et al. (2002, siehe auch WO 03/020890 ) gefunden wurde, liegt auch in der Proteinsequenz der in dem erfindungsgemäßen Verahren bevorzugt verwendeten Enzyms vor.
Es war jedoch überraschend, dass die BVMO aus P. fluorescens, keine zyklischen Baeyer-Villiger Substrate wie Cycloketone oder aromatische Ketone umwandelt, da das Enzym, wenn man es mit charakterisierten BVMOs mit einem bekannten Substratspektrum vergleicht, die höchste Sequenzähnlichkeit zu 4-Hydroxyacetophenon Monooxygenase (HAPMO, 37% Aminosäureidentität) aufweist. Eine phylogenetische Analyse zeigte die gleiche enge Verwandtschaft zwischen HAPMO und der BVMO von P. fluorescens DSM50106.
Eine ähnliche Substratspezifität wie bei dem Enzym aus P. fluorescens wurde auch für eine Baeyer-Villiger Monooxygenase aus Pseudomonas cepacia (Tridecanon Monooxygenase) gefunden. Im Gegensatz zu der BVMO aus P. fluorescens DSM50106 bevorzugt diese Tridecanon Monooxygenase jedoch mittelkettige Ketone mit C₁₂ bis C₁₄ und wandelt auch Cyclopentanon mit einer hohen spezifischen Aktivität um. Dieses Enzym ist aus Britton und Markovetz (1977) bekannt.
Es können in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere BVMOs verwendet werden, so etwa die Tridecanon Monooxygenase aus P. cepacia (Britton und Markovetz 1977), die Cyclohexanon Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al. 1976) oder die Cyclopentanon Monooxygenase (CPMO) aus Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin und Trudgill 1976). Die Aktivität der CHMO und der CPMO gegenüber den β-Hydroxyketonen nimmt jedoch bei steigender Kettenlänge der Substituenten deutlich ab. CHMO kann industriell lohnend etwa für die Umsetzung eines β-Hydroxyketons mit einem Rest R3 mit 1, 2, 3 oder 4 C-Atomen eingesetzt werden.
Die Eignung einer BVMO für die Umsetzung eines bestimmten Substrates bzw. Herstellung eines bestimmten Esters für einen spezifischen, z. B. industriellen Zweck kann getestet werden, indem die BVMO, wie in den Beispielen beschrieben, mit dem Substrat inkubiert und die Produkte der Reaktion analysiert werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Ketone bevorzugt oxidiert, indem sie mit wachsenden oder ruhenden Zellen inkubiert werden, welche die Baeyer-Villiger Monooxygenasen enthalten. Dadurch ist es nicht notwendig, das Enzym vor der Reaktion aufzureinigen und gemeinsam mit Cofaktoren wie NADPH isoliert in der Reaktion einzusetzen. Auch dies ist jedoch grundsätzlich möglich, wie z. B. in Britton und Markovetz, 1977, gezeigt. Bevorzugt werden ruhende Zellen eingesetzt. Um die Bildung von Einschlußkörpern zu verringern, ist es bevorzugt, dass die Zellen ferner Chaperone überexprimieren, beispielsweise durch Expression von GroES/GroEL aus Plasmidvektoren (Ikura et al. 2002, Lee et al. 2004, Nishihara et al. 1998, Nishihara et al. 2000).
Die Zellen können eukaryotische Zellen, etwa Hefen, sein, sind jedoch bevorzugt bakterielle Zellen, wie Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Aspergillus sp. Am meisten bevorzugt ist die Expression in E. coli, z. B. in E. coli DH5α, E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3) oder E. coli Origami^TM (DE3). Bevorzugt ist die Expression des Enzyms induzierbar. Bevorzugte Expressionsvektoren basieren auf pJOE- oder pET-Vektoren und sind in den Beispielen im Detail beschrieben, wie z. B. der Expressionsvektor pJOE4072.6 oder pET22BVMO.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt bei ca. 20 bis 37°C durchgeführt. Besonders bevorzugt ist eine Inkubationstemperatur von ca. 25 bis 30°C, insbesondere ca. 30°C, da leicht flüchtige Ketone und Ester hier nur zu einem geringen Ausmaß verdampfen. Wie in den Beispielen beschrieben, kann die Temperatur auch für verschiedene Schritte variiert werden.
Zur Herstellung der Ester mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können die durch die Baeyer-Villiger-Oxidation erzeugten Ester isoliert und aufreinigt werden. Es ist alternativ auch möglich, gegebenenfalls nach Abtrennung der Zellen z. B. durch Oxidation oder ohne Aufreinigung eine direkte Umsetzung der Ester in dem Reaktionsgemisch durchzuführen. Diese weitere Umsetzung kann chemisch oder enzymatisch sein.
Die Aufreinigung der Ester kann durch Extraktion mit geeigneten Lösungsmittlen, z. B. Dichlormethan erfolgen. Es wurde jedoch festgestellt, dass bei einer Extraktion mit Ethylacetat eine bessere Ausbeute erhalten wird. Anschließend kann der Ester von gleichzeitig extrahiertem nicht umgesetzten Keton getrennt werden, z. B. durch Säulenchromatographie an Kieselgel, insbesondere unter Verwendung einer geeigneten Lösungsmittelmischung, beispielweise von Hexan:Ethylacetat 5:1.
Die vorliegende Erfindung stellt neben dem Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern gleichzeitig ein Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Ketonen zur Verfügung. Insbesondere wird das von dem jeweiligen Enzym nicht umgesetzte Enantiomer erhalten. Bei der beschriebenen Baeyer-Villiger-Oxidation der Ketone wird als Ausgangsstoff eine racemische Mischung von Ketonen eingesetzt, von dem durch das Enyzm enantioselektiv ein Enantiomer in den Ester umgesetzt wird. Wenn man die nicht umgesetzten Ketone isoliert und aufreinigt, z. B. durch Extraktion und anschließende säulenchromatographische Trennung, erhält man damit das andere Enantiomer des Ketons.
Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren auch ein neues Verfahren zur Racematspaltung von aliphatischen azyklischen Ketonen, also zur Trennung von Racematen in die Enantiomere. Das Verfahren wird als katalytische kinetische Racematspaltung bezeichnet, da durch das Enzym ein Enantiomer des Edukts schneller als das spiegelbildliche Enantiomer des Ketons umgesetzt wird.
Um eine möglichst vollständige Umsetzung und damit Abtrennung des einen Enantiomers zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, den entstehenden Ester abzutrennen oder in einer anderen Reaktion weiter umzuwandeln, z. B. eine Hydrolyse des Esters durchzuführen.
Bevorzugt haben die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Ester und/oder Ketone eine Reinheit der Enantiomere von mindestens 70%, bevorzugt mindestens 80%, 90% oder 95% oder 99%.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit auch deshalb besonders vorteilhaft, da mit nur einem Reaktionsschritt sowohl eine enantioselektive Herstellung von aliphatischen azyklischen Ketonen als auch aliphatischen azyklischen Estern möglich wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin auch die Verwendung von Baeyer-Villiger Monooxygenasen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Besonders bevorzugt ist auch hier die Verwendung der oben beschriebenen Baeyer-Villiger Monooxygenasen, insbesondere der BVMOs, die aus Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) oder P. putida stammen oder funktionelle Derivate davon sind.
Die Erfindung betrifft damit auch die Verwendung von Baeyer-Villiger Monooxygenasen zur steroeselektiven Baeyer-Villiger Oxidation von racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen, wie in Anspruch 16 beschrieben.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung anhand der Baeyer-Villiger Oxidation spezifischer β-Hydroxyketone unter Verwendung spezifischer BVMOs beispielhaft illustriert. Es ist dem Fachmann jedoch eine Vielzahl von Modifikationen möglich, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen.
BEISPIELE
Baeyer-Villiger-Monooxygenase-katalysierte kinetische Spaltung racemischer aliphatischer azyklischer Ketone und enantioselektive Herstellung aliphatischer azyklischer Ester
Material und Methoden
Chemikalien
Alle Chemikalien wurden, wenn nicht anderweitig angegeben, von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland), Fisher Scientific (Schwerte, Deutschland), VWR (Darmstadt, Deutschland), ABCR (Karlsruhe, Deutschland) und Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland) erworben.
Bakterienstämme und Plasmide
E. coli JM109 wurde von New England Biolabs (Beverly, MA, USA) erhalten. E. coli BL21 (DE3), Origami^TM (DE3) und pET22b(+) wurden von Novagen erworben (Darmstadt, Deutschland). P. fluorescens DSM 50106 ist allgemein erhältlich (zum Beispiel Khalameyzer et al., 1999) und kann beispielsweise von der DSMZ (Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Das Chaperon-Plasmid-Set, welches die Plasmide pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 und pTf16 enthält, wurde vom TaKaRa Bio Inc. (Otsu, Japan) erworben.
Herstellung der Expressionsvektoren
Das BVMO-Gen wurde ohne Stopcodon mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der Oligonukleotide s3089 (5'-AAA ACA TAT GAA TGC CCA CAG TGA TT-3' (SEQ ID NO: 4) und s3090 (5'-AAA AGG ATC CTG AGA GGC TGC CTT CTG CC-3' (SEQ ID NO: 5)) und TaqI DNA Polymerase (Biozym Diagnostik GmbH, Oldendorf, Deutschland) aus P. fluorescens DNA amplifiziert. Die Sequenz des Enzyms ist unter der Zugangsnummer AF090329 bei der GenBank-Datenbank hinterlegt (siehe auch SEQ ID NO:1). Die Restriktionsstellen für NdeI und BamHI in den Primer-Sequenzen (unterstrichen) wurden verwendet, um das amplifizierte Fragment zwischen die NdeI/BamHI Stellen des L-Rhamnose-induzierbaren Expressionsvektors pJOE3075 (Stumpp et al. 2000) zu klonieren. Dadurch wurde das BVMO Gen am C-terminalen Ende im Leseraster mit sechs Histidin Codons verbunden (His-Tag), die in dem Vektor auf die BamHI Restriktionsstelle folgen. Dieses Plasmid wurde als pJOE4072.6 bezeichnet.
Zur Subklonierung des BVMO Gens in pET22b(+) wurde pJOE4072.6 mit NdeI und HindIII verdaut und das erhaltene kleine Fragment (circa 1,6 kb), welches das Gen und den His-Tag trug, wurde mit pET22b(+) ligiert, welches mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut wurde (pET22BVMO). Konstrukte ohne C-terminalen His-Tag wurden hergestellt, indem das Codon GGA aus der BamHI Stelle, die zwischen Gen und His-Tag eingefügt war, in das Stopcodon TGA umgewandelt wurde, wobei Quik Change^TM Site Directed Mutagenesis (Stratagene, La Jolla, USA) verwendet wurde.
Genexpression
Durch L-Rhamnose induzierbare Genexpression:
E. coli JM109 wurde mit pJOE-Konstrukten transformiert. Die Expression wurde in 30 ml LB Medium (10 g Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt/L), welches 100 μg pro ml Ampicillin enthielt (LB_amp) bei 37, 30 und 25°C durchgeführt. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bis 0,7 bei 600 nm kultiviert, zu diesem Zeitpunkt wurde BVMO-Expression durch Zugabe von L-Rhamnose induziert (0,2% (w/v) Endkonzentration). Nach weiterer Kultivierung bis zu 20 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschall (60 Sekunden, 50% Intensität) in Natriumphosphat-Puffer (50 mM, pH 7,5) aufgeschlossen. Einschlusskörper wurden von dem Zell-Lysat durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 800 g getrennt, mit 0,1% (v/v) Triton X-100 behandelt (37°C, 10 Minuten) und zweimal mit Natriumphosphat-Puffer gewaschen. Zelltrümmer wurden aus dem Zell-Lysat durch zusätzliche Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit entfernt (10 Minuten, 16000 g). Überstände und Fraktionen mit Einschlusskörpern wurden mit SDS-PAGE und Western Blot analysiert.
Durch IPTG induzierte Genexpression:
E. coli BL21 (DE3) und Origami^TM (DE3) wurden mit pET22b(+)-Konstrukten transformiert. Die Zellen wurden in 30 ml LB_amp bei 37, 30, 25 und 20°C bis zu einer optischen Dichte von 0,7 bis 0,8 bei 600 nm kultiviert. Danach wurde BVMO-Expression durch Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 mM induziert. Nach weiterer Expression für 20 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und wie bereits beschrieben aufgearbeitet.
Co-Expression des BVMO-Gens mit für Chaperone kodierenden Plasmiden:
E. coli JM109 und BL21 (DE3) Zellen wurden mit für Chaperone kodierenden Plasmiden transformiert. Die Zellen wurden in 20 ml LB, welches 34 μg/ml Chloramphenicol enthielt (LB_cm) bei 37°C kultiviert und kompetente Zellen wurden hergestellt. Diese wurden mit pJOE-Konstrukten (für JM109) oder pET22b(+)-Konstrukten (für BL21 (DE3)) transformiert und auf LB_cm+amp selektiert. Expression wurde, wie bereits beschrieben, unter Verwendung von LB_cm+amp, welches 0,5 μg/ml L-Arabinose (bei pGro7, pKJE7 und pTf16), 5 ng/ml Tetracyklin (bei pG-Tf2) oder L-Arabinose und Tetracyklin (bei pG-KJE8) in den oben angegebenen Konzentrationen enthielt, bei 30°C durchgeführt.
Chemische Synthese
Racemische β-Hydroxyketone wurden über Aldolkondensation nach dem von Smith und Levenberg (1981) beschriebenen Verfahren synthetisiert.
Hydroxyalkylacetate wurden enzymatisch unter Verwendung von Candida antarctica Lipase B synthetisiert. 5 mg immobilisiertes Enzym (Chirazyme L-2, C-2, Roche, Penzberg, Deutschland) wurden mit 300 μl Isooctan und 300 μl Vinylacetat in einem 2 ml Glasgefäß gemischt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 10 µl 1,2-Diol gestartet und bei 25°C in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) für etwa zwei Stunden inkubiert, bis die Konversion vollständig war. Die Proben wurden direkt für die GC-Analyse verwendet.
Hydroxysäuremethylester wurden aus den entsprechenden β-Ketosäuremethylestern über ADH-katalysierte Reduktion synthetisiert, wobei eine Alkoholdehydrogenase aus P. fluorescens DSM50106 verwendet wurde (Hildebrand et al 2002). 5 mg Enzym-Lyophilisat (rekombinant hergestellt) wurden mit 800 µl Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5), 200 µl Isopropanol und 2 µl β-Ketosäuremethylester gemischt. Die Reaktionen wurden bei 20°C 24 Stunden in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann zweimal mit 500 µl Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Verwendung von Stickstoff konzentriert. Die erhaltenen Produkte wurden über Gaschromatographie analysiert.
β-Ketosäuremethylester, die nicht kommerziell erhältlich waren, wurden nach dem von Oikawa et al. (1978) beschriebenen Verfahren synthetisiert.
Biokatalyse unter Verwendung wachsender Zellen
E. coli JM109 pJOE4072.6 Zellen wurden in 30 ml LB_amp bei 30°C bis zu einer optischen Dichte von 0,6 bis 0,7 bei 600 nm kultiviert. Danach wurde die BVMO-Expression durch Zugabe von L-Rhamnose in einer Endkonzentration von 0,2% (w/v) induziert. Zum gleichen Zeitpunkt wurden 0,1 mmol β-Hydroxyketon hinzugefügt und die Kultur weiter bei 30°C und 220 rpm inkubiert. Nach bestimmten Zeiträumen wurden 500 µl-Proben genommen, zweimal mit Dichlormethan extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Überschüssiges Lösungsmittel wurde im Stickstoffstrom entfernt und die Proben mittels Gaschromatographie analysiert.
Biokatalyse unter Verwendung ruhender Zellen
Die Expression von BVMO in E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 wurde in 200 ml LB_cm+amp, welches 0,5 mg pro ml L-Arabinose enthielt, bei 30°C durchgeführt. Die Zellen wurden bis zu einer optischen Dichte von 0,5 bis 0,6 bei 600 nm kultiviert, zu diesem Zeitpunkt wurde die BVMO-Expression durch Zugabe von von L-Rhamnose in einer Endkonzentration von 0,2% (w/v) induziert. Nach weiterem Wachstum für vier Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und einmal mit sterilem Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) gewaschen.
Für Biokatalyse-Reaktionen im analytischen Maßstab wurden die Zellen in dem gleichen Puffer bis zu einer optischen Dichte von etwa 40 resuspendiert und 1 ml Aliquots dieser Zellsuspension wurden in 2 ml Gefäßen mit 5 µmol β-Hydroxyketon und 10 µl einer sterilen 1 M Glukoselösung gemischt. Die Röhrchen wurden mit luftdurchlässigen Deckeln verschlossen (Lid_Bac, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) und bei 30°C in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden 300 µl-Proben entnommen, zweimal mit Ethylacetat extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Überschüssiges Lösungsmittel wurde im Stickstoffstrom entfernt und die Proben gaschromatographisch analysiert.
Für Biokatalyse-Reaktionen in Schüttelkolben wurde das Zellpellet in 60 ml Phosphatpuffer (OD von etwa 10) resuspendiert, auf dreimal 20 ml aufgeteilt und in 250 ml Schüttelkolben überführt. Dann wurden jeweils 0,1 mmol Substrat und 200 µl sterile 1 M Glukoselösung hinzugefügt und bei 30°C und 200 rpm auf einem Orbital-Schüttler 15 bis 16 Stunden inkubiert. Jede Reaktion wurde einmal mit 10 ml Ethylacetat extrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und überschüssiges Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Die Proben wurden gaschromatographisch analysiert.
Reaktionsschema 1
Reaktionsschema zur Konversion aliphatischer Ketone 1a–c zu den entsprechenden Estern 2a–c durch BVMO.
Chirale gaschromatographische Analyse

Chirale GC-Analysen (Tabelle 1) wurden auf einem Shimadzu GC-14A Gaschromatographen mit einer chiralen β-Cyclodextrin Säule (Hydrodez^®-β-3P, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) durchgeführt. Injektions- und Detektionstemperatur wurden auf 220°C eingestellt. Tabelle 1 Chirale GC-Analyse von β-Hydroxyketonen 1a–c und Hydroxyalkylacetaten 2a–c (Reaktionsschema 1).

Verbindung	Temperatur-Programm	Retentionszeit [min]
β-Hydroxyoctanon	20 min, 90°C/ /20°C/min//110°C, 15 min	17.8/18.6
β-Hydroxydecanon	15 min, 120°C/ /200C/min//130°C, 15 min	12.7/13.3
β-Hydroxydodecanon	20 min, 135°C/ /20°C/min//145°C, 15 min	18.3/19.1
Hydroxyhexylacetat	20 min, 90°C/ /20°C/min//110°C, 15 min	23.3/24.1
Hydroxyoctylacetat	15 min, 120°C/ /20°C/min//130°C, 15 min	23.3/24.1
Hydroxydecylacetat	20 min, 135°C/ /20°C/min//145°C, 15 min	22.4/23.2

Ergebnisse und Diskussion
Klonierung des BVMO-Gens aus P. fluorescens DSM50106 und Genexpression in E. coli
Das BVMO-Gen von P. fluorescens DSM50106 wurde mit PCR amplifiziert und in den mit L-Rhamnose induzierbaren Expressionsvektor pJOE3075 eingefügt. Dadurch wurde das Gen ohne sein Stopcodon im Leseraster mit sechs Histidin-Codons und einem bereits im Vektor (His-Tag) vorliegenden Stopcodon verbunden, um Plasmid pJOE4072.6 zu ergeben.
Die Expression von rekombinanter BVMO wurde zunächst in E. coli JM109 mit pJOE4072.6 durchgeführt. Unterschiedliche Temperaturen wurden erprobt und die Menge von BVMO in der löslichen Fraktion und in Einschlusskörpern wurde mit SDS-PAGE und Western Blot untersucht. Western Blot-Analyse wurde verwendet, um die korrekte Proteinbande von ungefähr 56 kDa, die der BVMO entsprach, zu identifizieren. Die besten Ergebnisse wurden bei 30°C erhalten, da hier im Vergleich zu 37°C weniger Enzym in Einschlusskörpern gefunden wurde, und das gesamte Expressionsniveau höher als bei 25°C war. Dennoch war die Menge an löslicher BVMO relativ gering. Daher wurde das BVMO Gen in den Viel-Kopien-Vektor pET22b(+) subkloniert und in BL21 (DE3) exprimiert. Bei der Expression in BL21 (DE3) bei 30°C war das Expressionsniveau im Vergleich zu JM109 pJOE4072.6 etwa fünffach höher, aber der Großteil des Enzyms wurde in Einschlusskörpern abgelagert. Eine Verringerung der Expressionstemperatur auf 20°C erhöhte die Ausbeute an BVMO in der löslichen Fraktion nur geringfügig. Origami^TM (DE3) als Wirt für die Expression führte zu den gleichen Ergebnissen. Weiterhin wurden keine Unterschiede in der Expression von BVMO mit und ohne His-Tag nachgewiesen.
Es wurde berichtet, dass Co-Expressionen von molekularen Chaperonen im Cytoplasma von E. coli die Ausbeute löslichen Proteins deutlich verstärken kann (Ikura et al. 2002, Lee et al. 2004, Nishihara et al. 1998, Nishihara et al. 2000). Daher wurden pJOE und pET22b(+)-Konstrukte mit unterschiedlichen Kombinationen von Chaperonen co-exprimiert, die durch das TaKaRa Chaperon-Plasmid-Set zur Verfügung gestellt wurden. Im Falle von JM109 pJOE4072.6 führte sowohl GroES/GroEL als auch GroES/GroEL zusammen mit DnaK/DnaJ/GrpE oder dem Trigger Faktor zu deutlich höheren Mengen an löslicher BVMO, wobei für DnaK/DnaJ/GrpE allein ein Einfluss auf die Expression nicht festgestellt werden konnte, da die Zellen nach Induktion der BVMO-Expression nicht weiter wuchsen und kaum Enzym herge stellt wurde. Der Trigger Faktor allein zeigte nur einen geringen positiven Effekt auf die BVMO-Expression.
Bei BL21 (DE3) steigerte die Co-Expression von DnaK/DnaJ/GrpE die Menge von BVMO in der löslichen Fraktion mindestens zehnfach (nach sechs Stunden Expression), mit etwa gleichen Mengen rekombinanten Enzyms in der löslichen Fraktion und in Einschlusskörpern. Die Kultur wuchs jedoch nicht viel über eine optische Dichte von 1. Wie bereits für JM109 erwähnt, führten GroES/GroEL genau wie GroES/GroEL zusammen mit DnaK/DnaJ/GrpE auch zu gesteigerten Mengen löslichen Enzyms, jedoch in einem geringeren Ausmaß.
Interessanterweise führte die Anwendung der gleichen Chaperone bei E. coli JM109 und BL21 (DE3) zu unterschiedlichen Ergebnissen. Während Co-Expression von DnaK/DnaJ/GrpE in BL21 (DE3) die Menge an löslicher BVMO etwa zehnfach erhöhte, kombiniert mit dramatisch reduziertem Zellwachstum, konnte in E. coli JM109, das die gleiche Inhibition des Zellwachstum zeigte, das Enzym nicht in großen Mengen nachgewiesen werden. Das kann an einem toxischen Effekt von großen Mengen aktiver BVMO für die Zellen liegen. Diese Annahme wurde weiter durch den Nachweis unterstützt, dass die lösliche Fraktion von E. coli BL21 (DE3) pET22BVMO pKJE7 (Co-Expression von Dnak/DnaJ/GrpE) kaum Baeyer-Villiger Monooxygenase-Aktivität zeigte, obwohl eine große Menge von BVMO-Enzym vorlag. Bei anderen BVMOs wurde bisher kein toxischer Effekt auf eine Expression in E. coli berichtet. Da das Enzym aliphatische offenkettige Ketone mit hoher Spezifität umwandelt, kann der toxische Effekt möglicherweise auf der Umwandlung von Zwischenprodukten der Fettsäure-Synthese oder von Lipidmembranbestandteilen beruhen.
Substratspezifität und Enantioselektivität
Racemische β-Hydroxyketone 1a–c (Reaktionsschema 1), die nach dem von Smith und Levenberg (1981) beschriebenen Verfahren synthetisiert wurden, wurden einer kinetischen Racematspaltung durch enzymatische Baeyer-Villiger-Oxidation unterworfen und ergaben Hydroxyalkylacetate 2a–c (Reaktionsschema 1). Geringe Mengen der anderen möglichen Produkte, der Hydroxysäuremethylester 3a–c, wurden ebenfalls gebildet (Reaktionsschema 1).
Unter Verwendung der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106 wurden verschiedene Biokatalyse-Strategien entweder mit wachsenden oder ruhenden Zellen getestet (Tabellen 2–4). Während die Ergebnisse aus den Reaktionen mit wachsenden Zellen von JM109 pJOE4072.6 für 1a und 1c (siehe Reaktionsschema 1) nicht auswertbar sind (Tabelle 2), da hier die Umsetzung anscheinend relativ gering ist und die produzierten Ester offensichtlich sehr schlecht durch Dichlormethan extrahiert wurden, erreichte die Konversion von 1b (siehe Reaktionsschema 1) bereits mehr als 50%. Um das Extraktionsproblem zu überwinden, wurde in weiteren Experimenten anstelle von Dichlormethan Ethylacetat zur Extraktion verwendet. Daher konnte deutlich mehr Produkt nachgewiesen werden.
Möglicherweise wird das Wachstum von Zellen durch β-Hydroxyketone inhibiert, wie aus den geringen Umsätzen von 1a und 1c geschlossen werden kann. Dies würde jedoch nicht erklären, warum 1b eine Ausnahme sein sollte. Tabelle 2: Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone 1a–c (siehe Reaktionsschema 1) unter Verwendung von wachsenden Zellen von E. coli JM109 pJOE4072.6 bei 30°C (n. b. – nicht bestimmbar).

Substrat Zeit [h] C [%] %ee_S %ee_P E

1a 1b 1c 20 20 20 n. b. 54 n. b. 30 93 21 n. b. 80 n. b. n. b. 29 n. b.
Die Werte für C (Umsatz, conversion), %ee_S, %ee_P (Enantiomerenüberschuß, enantiomeric excess) und E (Enantioselektivität, enantiomeric ratio) können nach dem von Chen et al. (1982) beschriebenen Verfahren berechnet werden.
Um höhere Umsatzraten auch für die Substrate 1a und 1c (siehe Reaktionsschema 1) zu erhalten, wurde eine kinetische Racematspaltung mit ruhenden Zellen von JM109 pGro7 pJOE4072.6 in Schüttelkolben durchgeführt (Tabelle 3). Dieser rekombinante Stamm co-exprimiert die Chaperone GroES/GroEL, um eine bessere Faltung der BVMO zu ermöglichen. Tabelle 3: Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone 1a–c (siehe Reaktionsschema 1) unter Verwendung ruhender Zellen von E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 bei 30°C in Schüttelkolben.

Substrat Zeit [h] C [%] %ee_S %ee_P E

1a 1b 1c 16 16 15 24 52 42 31 92 65 96 84 90 73 38 37
Außer bei 1a (siehe Reaktionsschema 1) waren die Umsätze besser oder mindestens so gut wie mit wachsenden Zellen. Zusätzlich konnten die produzierten Ester viel besser mit Ethylacetat extrahiert werden. Daher war die GC-Analyse leichter und die Berechnung exakter C- und E-Werte möglich.
In Bezug auf die Enantioselektivität der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106 gegenüber β-Hydroxyketonen waren die E-Werte für alle drei getesteten Substrate moderat bis gut. Die BVMO aus P. fluorescens setzt bevorzugt die (S)-β-Hydroxyketone in die entsprechenden (S)-Hydroxyalkylacetate um.
Die Reaktionszeiten konnten deutlich verkürzt werden, indem kinetische Racematspaltungen mit einem höheren Verhältnis von Enzym zu Substrat durchgeführt wurden. Reaktionen wurden mit ruhenden Zellen in kleinen Volumina von 1 ml konzentrierter Zellsuspension in 2 ml Röhrchen mit luftdurchlässigen Deckeln durchgeführt. Wenn die gleichen Substratkonzentrationen wie in Schüttelkolben verwendet wurden, konnten bereits nach kürzeren Reaktionszeiten hohe Umsätze erreicht werden (Tabelle 4). Zusätzlich waren die erhaltenen E-Werte deutlich höher. Tabelle 4: Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone 1a–c (siehe Reaktionsschema 1) mit ruhenden Zellen von E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 bei 30°C in 2 ml Röhrchen mit luftdurchlässigen Deckeln.

Substrat Zeit [h] C [%] %ee_S %ee_P E

1a 1b 1c 8 4 2 40 48 45 61 84 74 93 91 90 54 55 41
Andere rekombinant erhältliche BVMOs, die Cyclohexanon Monooxygenase (CHMO) aus Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871 (Donoghue et al. 1976) und die Cyclopentanon Monooxygenase (CPMO) aus Comamonas sp. NCIMB 9872 (Griffin und Trudgill 1976), wurden ebenfalls auf ihre Enantioselektivität gegenüber β-Hydroxyketonen 1a–c (siehe Reaktionsschema 1) getestet. Es wurden ruhende Zellen von E. coli BL21 (DE3) pKJE7 (kodierend für die Chaperone DnaK/DnaJ/GrpE) pMM4 (Lee et al. 2004), welche das CHMO Gen beherbergen und E. coli DH5α pCMO206, welche das CPMO Gen beherbergen, für die kinetische Racematspaltung im analytischen Maßstab in 2 ml Röhrchen verwendet. Biokatalyse-Reaktionen wurden auf die gleiche Art wie für E. coli JM109 pGro7 pJOE4072.6 durchgeführt. Im Gegensatz zu der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106 zeigten beide Enzyme deutlich höhere Aktivität gegenüber 1a (siehe Reaktionsschema 1), während die Umsatzrate mit zunehmender Kettenlänge abnahm (Tabellen 5 und 6). Tabelle 5 Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone 1a–c (siehe Reaktionsschema 1) unter Verwendung ruhender Zellen von E. coli BL21 (DE3) pKJE7 pMM4 bei 30°C (15 µmol Substrat) (n. b. – nicht bestimmbar).

Substrat Zeit [h] C [%] %ee_S %ee_P E

1a 1b 1c 1 1 1 46 31 3 81 40 3 94 90 n. b. 72 28 n. b.
Zusätzlich zeigt die CHMO eine höhere Enantioselektivität bei der Oxidation von 1a (Reaktionsschema 1) verglichen zu der BVMO aus P. fluorescens DSM 50106, während bei der Umwandlung von 1b (Reaktionsschema 1) der E-Wert geringer ist (Tabelle 5). Bei diesem Enzym wird wahrscheinlich eine Substrat inhibition bei β-Hydroxyketon 1c (Reaktionsschema 1) beobachtet, aber die Enantioselektivität der kinetischen Racematspaltung dieser Verbindung wird als verhältnismäßig gering eingeschätzt. Die CPMO zeigt bei der Baeyer-Villiger-Oxidation von β-Hydroxyketonen keine wirtschaftlich annehmbaren E-Werte (Tabelle 6). Tabelle 6 Ergebnisse der kinetischen Racematspaltung der Hydroxyketone 1a–c (Reaktionsschema 1) mit ruhenden Zellen von E. coli DH5α pCMO206 bei 30°C (15 µmol Substrat).

Substrat Zeit [h] C [%] %ee_S %ee_P E

1a 1b 1c 0.25 2 8 50 31 42 58 26 10 57 57 14 6 5 1.4
Referenzen

Alphand V, Furstoss R (1992) Microbiological transformations. 22. Microbiologically mediated Baeyer-Villiger reactions: a unique route to several bicyclic γ-lactones in high enantiomeric purity. J Org Chem 57: 1306–1309
Baeyer, Villiger (1899) Einwirkung des Caro'schen Reagens auf Ketone. Chem Ber 32: 3625–3633
Britton LN, Markovetz AJ (1977) A novel ketone monooxygenase from Pseudomonas cepacia. J Biol Chem 252: 8561–8566
Brzostowicz PC, Blasko MS, Rouviere PE (2002) Identification of two gene clusters involved in cyclohexanone oxidation in Brevibacterium epidermidis strain HCU. Appl Microbiol Biotechnol 58: 781–789
Brzostowicz PC, Walters DM, Thomas SM, Nagarajan V, Rouviere PE (2003) mRNA differential display in a microbial enrichment culture: simultanous identification of three cyclohexanone monooxygenases from three species. Appl Environ Microbiol 69: 334–342
Carnell AJ, Roberts SM, Sik V, Willetts AJ (1991) Microbial oxidation of 7-endo-methylbicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one, 7,7-dimethylbicyclo[3.2.0]hept-2-en-6-one and 2-exo-bromo-3-endohydroxy-7,7-dimethylbicyclo[3.2.0]heptan-6-one using Acinetobacter NCIMB 9871. J Chem Soc, Perkin Trans 1 2385–2389
Chen, Fujimoto, Girdaukas, Sih (1982) Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers J. Am. Chem. Soc. 104: 7294–7299
Criegee R (1948) Die Umlagerung der Dekalin-peroxydester als Folge von kationischem Sauerstoff. Justus Liebigs Ann Chem 560: 127–141
Donoghue NA, Norris DB, Trudgill PW (1976) The purification and properties of cyclohexanone oxygenase from Nocardia globerula CL1 and Acinetobacter NCIB 9871. Eur J Biochem 63: 175–192
Fraaije MW, Kamerbeek NM, Heidekamp AJ, Fortin R, Janssen DB (2004) The prodrug activator EtaA from Mycobacterium tuberculosis is a Baeyer-Villiger monooxygenase. J Biol Chem 279: 3354–3360
Fraaije MW, Wu J, Heuts DPHM, van Hellemond EW, Spelberg JHL, Janssen DB (2005) Discovery of a thermostable Baeyer-Villiger monooxygenase by genome mining. Appl Microbiol Biotechnol 66: 393–400
Gonzalo Gd, Pazmino, DET, Ottolina G, Fraaije MW and Carrea G (2005) Oxidations catalyzed by phenylacetone monooxygenase from Thermobi.da fusca Tetrahedron: Asymmetry 16: 3077–3083
Griffin M, Trudgill PW (1976) Purification and properties of cyclopentanone oxygenase of Pseudomonas NCIB 9872. Eur J Biochem 63: 199–209
Hildebrandt P, Musidlowska A, Bornscheuer UT (2002) Cloning, functional expression and biochemical characterization of a stereoselctive alcohol dehydrogeenase from Pseudomonas fluorescens DSM50106. Appl Microbiol Biotechnol 59: 483–487
Kamerbeek NM, Mooen MJH, van der Ven JGM, van Berkel WJH, Fraaije MW, Janssen DB (2001) 4-Hydroxyacetophenone monooxygenase from Pseudomonas fluorescens ACB. Eur J Biochem 268: 2547–2557
Kamerbeek NM, Olsthoorn AJJ, Fraaije MW, Janssen DB (2003) Substrate specificity and enantioselectivity of 4-hydroxyacetophenone monooxygenase. Appl Environ Microbiol 69: 419–426
Khalameyzer V, Fischer I, Bornscheuer UT, Altenbuchner J (1999) Screening, nucleotide sequence, and Biochemical Characterization of an Esterase from Pseudomonas fluorescens with high activity towards Lactones. Appl Environ Microbiol 65: 477–482
Kostichka K, Thomas SM, Gibson KJ, Nagarajan V, Cheng Q (2001) Cloning and characterization of a gene cluster for cyclododecanone oxidation in Rhodococcus ruber SC1. J Bacteriol 183: 6478–6486
Kyte BG, Rouviere PE, Cheng Q, Stewart JD (2004) Assessing the substrate selectivities and enantioselectivities of eight novel Baeyer-Villiger monooxygenases toward alkyl-substituted cyclohexanones. J Org Chem 69: 12–17
Lee DH, Kim MD, Lee WH, Kweon DH, Seo JH (2004) Consortium of fold-catalyzing proteins increases soluble expression of cyclohexanone monooxygenase in recombinant Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 63: 549–552
Mihovilovic MD, Müller B, Stanetty P (2002) Monooxygenase-mediated Baeyer-Villiger Oxidations. Eur J Org Chem 3711–3730
Mihovilovic MD, Rudroff F, Grötzl B (2004) Enantioselective Baeyer-Villiger oxidations. Curr Org Chem 8: 1057–1069
Mihovilovic MD, Rudroff F, Grötzl B, Kapitan P, Snajdrova R, Rydz J, Mach R (2005) Family clustering of Baeyer-Villiger monooxygenases based on protein sequence and stereopreference. Angew Chem Int Ed 44: 3609–3613
Oikawa Y, Sugano K, Yonemitsu O (1978) Meldrum's acid in organic synthesis. 2. A general and versatile synthesis of β-keto esters. J Org Chem 43: 2087–2088
Park P, Kozikowski AP (1988) Oxidation of isoxazolines by peracids – a useful route to β-hydroxyketones and acylated diols. Tetrahedron Lett 29: 6703–6706
Smith AB, Levenberg PA (1981) Oxidation of β-hydroxyketones and esters: a convenient synthesis of 1,3-diketones and β-ketoesters. Synthesis 567–570
Stewart JD (1998) Cyclohexanone monooxygenase: a useful reagent for asymmetric Baeyer-Villiger reactions. Curr Org Chem 2: 211–232
Strukul G (1998) Transition metal catalysis in the Baeyer-Villiger oxidation of ketones. Angew Chem, Int Ed 37: 1199–1209
Taschner MJ, Black DJ (1988) The enzymatic Baeyer-Villiger Oxidation: Enantioselective synthesis of lactones from mesomeric cyclohexanones. J Am Chem Soc 110: 6892–6893
Taschner MJ, Black DJ, Chen QZ (1993) The enzymatic Baeyer-Villiger oxidation: A study of 4-substituted cyclohexanones. Tetrahedron: Asymmetry 4: 1387–1390
Taschner MJ, Peddada L (1992) The enzymic Baeyer-Villiger oxidation of a series of bicyclo[2.2.1]hept-2-en-7-ones. J Chem SoC, Chem Commun 1384–1385
van Beilen JB, Mourlane, Seeger MA, Kovac J, Li Z, Smits THM, Fritsche U, Witholt B (2003) Cloning of Baeyer-Villiger monooxygenases from Comamonas, Xanthobacter and Rhodococcus using polymerase chain reaction with highly degenerate primers. Environ Microbiol 5: 174–182
Walsh CT, Chen YCJ (1988) Enzymatische Baeyer-Villiger-Oxidation durch flavinabhängige Monooxygenasen. Angew Chem Int Ed Engl 27: 333–343

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern aus racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen durch Baeyer-Villiger-Oxidation, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger-Oxidation enantioselektiv ist und man zur Oxidation Baeyer-Villiger Monooxygenasen verwendet, wobei eine Enantioselektivität E von mindestens 10 erreicht wird, wobei die Ketone eine Formel
aufweisen, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein substituierter oder unsubstituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, ein Hydroxyalkylrest, Carboxylrest, Alkoxycarboxyrest, Aminorest, Aminoalkylrest, Aminocarbonylrest, Hydroxylrest oder ein Halogenrest ist, wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein können, mit der Maßgabe, dass R2, R3 und R4 sich unterscheiden, wobei R3 oder R4 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 1–4 C-Atomen und R3 oder R4 Wasserstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Enantioselektivität E von mindestens 40 erreicht wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase für aliphatische azyklische Ketone spezifisch ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R1 Methyl ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass R2 ein Hydroxylrest, Aminorest oder ein Halogenrest ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Keton ein β-Hydroxyketon ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das β-Hydroxyketon folgende Formel aufweist
und R3 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 2–4 C-Atomen ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase aus P. fluorescens oder P. putida stammt oder ein funktionelles Derivat davon ist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase eine Sequenz umfasst, die eine Homologie von mindestens 70% zu SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Baeyer-Villiger Monooxygenase die Sequenz nach SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 aufweist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Ketone mit wachsenden oder ruhenden E. coli inkubiert, welche die Baeyer-Villiger Monooxygenase exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die E. coli ferner Chaperone überexprimieren.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–12, dadurch gekennzeichnet, dass man die erzeugten Ester isoliert und aufreinigt.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufreinigung der Ester eine Extraktion mit Dichlormethan oder Ethylacetat umfasst.
Verfahren zur enantioselektiven Herstellung von aliphatischen azyklischen Ketonen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Verfahren nach den Ansprüchen 1–12 durchführt und man die nicht umgesetzten Ketone isoliert und aufreinigt.
Verwendung von Baeyer-Villiger Monooxygenasen zur enantioselektiven Baeyer-Villiger Oxidation von racemischen aliphatischen azyklischen Ketonen zur Herstellung von aliphatischen azyklischen Estern, wobei eine Enantioselektivität E von mindestens 10 erreicht wird, wobei die Ketone eine Formel
aufweisen, wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander ein substituierter oder unsubstituierter, linearer oder verzweigter Alkylrest, Alkenylrest, Alkinylrest, ein Hydroxyalkylrest, Carboxylrest, Alkoxycarboxyrest, Aminorest, Aminoalkylrest, Aminocarbonylrest, Hydroxylrest oder ein Halogenrest ist, wobei R3 oder R4 auch Wasserstoff sein können, mit der Maßgabe, dass R2, R3 und R4 sich unterscheiden, wobei R3 oder R4 ein Alkylrest mit einer Kettenlänge von 1–4 C-Atomen und R3 oder R4 Wasserstoff ist.