DE69931574T2

DE69931574T2 - Stereoselektive mikrobielle Reduktion eines razemischen Tetralons

Info

Publication number: DE69931574T2
Application number: DE69931574T
Authority: DE
Inventors: Brook Knight Colchester Morse; John Wing East Lyme Wong; Susan Jane Warwick Truesdell
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-25
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2019-10-26
Also published as: JP2001054397A; YU55199A; KR100432309B1; DE69931574D1; KR20000029385A; IN191494B; ES2264244T3; ZA996786B; US6589777B1; CA2287560A1; CZ379099A3; TWI224141B; AU751282B2; JP3106135B2; KR20030071731A; RS49702B; AU5709799A; CZ293579B6; CN1252277C; JP3359905B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung des (4S)-Enantiomers von 4-(3,4-Dichlorphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-naphthalinon (hierin nachstehend auch als „chirales Tetralon" oder „(4S)-Tetralon" bezeichnet) und insbesondere betrifft sie die stereoselektive mikrobielle Reduktion von racemischem 4-(3,4-Dichlorphenyl)-3,4-dihydro-1(2H)-naphthalinon (hierin nachstehend auch als „racemisches Tetralon" bezeichnet) zu chiralem Tetralon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte chirale Tetralon kann weiter umgesetzt werden, um reines (1S)(4S)-N-Methyl-4-(3,4-dichlorphenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalinamin, üblicherweise als Sertralin bezeichnet, herzustellen. Sertralin ist bekanntlich z.B. als antidepressives und anorektisches Mittel und bei der Behandlung von Chemikalienabhängigkeiten, durch Angstzustände bedingten Störungen, vorzeitiger Ejakulation, Krebs und nach Herzinfarkt nützlich.
Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Herstellung von Sertralin bekannt, wie beispielsweise jene, die in US-Patenten-Nr. 4536518, 4777288, 4839104, 4855500, 4940731, 4962128, 5082970, 5130338, 5196607, 5248699, 5442116, 5463126, 5466880, 5597826 und 5750794 und in dem Artikel von W.M. Welch jun. et al., der in dem Journal of Medicinal Chemistry, Band 27, Nr. 11, Seite 1508 (1984) erschien, beschrieben wurden.
Einige der vorstehend erwähnten Patente betreffen die Synthese von Gemischen von cis- und trans-Isomeren von racemischem N-Methyl-4-(3,4-dichlorphenyl)-1,2,3,4-tetrahydro-1-naphthalinamin. Wie darin beschrieben, können die cis- und trans-Isomeren sowie deren (S)- und (R)-Enantiomere durch dem Fachmann bekannte Verfahren, einschließlich beispielsweise fraktionierte Kristallisation oder Chromatographie, getrennt werden.
Es ist ebenfalls bekannt, die letztendlich gewünschte Chiralität schon früh bei der Synthese von Sertralin auszuwählen. Beispielsweise offenbart das vorstehend genannte US-Patent-Nr. 5750794 ein Verfahren zur Herstellung von chiralem Tetralon durch Umsetzen von racemischem Tetralon mit einem asymmetrischen Ketonreduktionsmittel, um die entsprechenden cis- oder trans-Alkohole in Abhängigkeit von der Chiralität des angewendeten asymmetrischen Reagens zu erhalten, und dann Abtrennen der Alkohole und Oxidieren der (1S, 4S)- und/oder (1R, 4S)-Alkohole zu (4S)-Tetralon.
Es ist auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt, dass chirale Verbindungen unter Anwendung von Mikroorganismen, wie Pilze, beispielsweise Hefe, synthetisiert werden können. Zum Beispiel ist die Verwendung von Hefen zum Reduzieren von Ketonen zu chiralen Alkoholen gut bekannt. Jedoch, wie durch den Fachmann eingeschätzt, variieren die chemischen und optischen Ausbeuten, beispielsweise von bestimmten Enantiomeren und Mengen davon, von solchen mikrobiellen Reduktionen im Allgemeinen im Wesentlichen in Abhängigkeit von beispielsweise den ausgewählten besonderen Mikroorganismen sowie den Substituenten des Ausgangsmaterials.
US-Patent-Nr. 5049497 offenbart ein Verfahren zum Trennen eines racemischen Derivats von Bicyclo[4.2.0]octan durch In-Kontakt-Bringen. des Derivats mit Bäckerhefe unter Bedingungen, die ausreichend sind, um ein Gemisch von Keton und Alkohol von hoher Enantiomerenreinheit zu ergeben. Wie hierin beschrieben, wird nur ein Enantiomer des racemischen Zielketons zu einem Alkohol reduziert.
US-Patent-Nr. 5580764 offenbart ein asymmetrisches Reduktionsverfahren, das einen intakten Mikroorganismus anwendet oder eine Zubereitung aufgebrochener Zellen davon, um ein cyclisches Keton zu dem entsprechenden chiralen Alkohol umzuwandeln.
US-Patent-Nr. 5618707 offenbart ein Verfahren für die stereoselektive Reduktion von Ketonsubstraten durch Hinzufügen der Substrate zu einer Kulturbrühe von entweder Zygosaccharomyces bailii ATCC (American Type Culture Collection) Nr. 38924 oder Schizosaccharomyces octosporus ATCC Nr. 2479 unter Inkubieren des erhaltenen Gemisches und Isolieren der Hydroxyverbindung durch herkömmliche Mittel, wie beispielsweise Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Adsorption an Harze oder Chromatographie zur anschließenden Verwendung als ein Zwischenprodukt bei der Herstellung eines Serumcholesterinabsenkenden Mittels. Die hierin beschriebene isolierte Hydroxyverbindung wurde durch chirale Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), Umkehrphasen-HPLC oder beide analysiert. In Übereinstimmung mit dem, was vom Fachmann auf dem hierin beschriebenen Fachgebiet verstanden würde, konnten viele von der Vielzahl von Mikroorganismen, die auf ihre Fähigkeit, die Ketongruppe an dem ausgewählten Substrat zu reduzieren, untersucht wurden, die Ketongruppe nicht mit der gewünschten Spezifität oder Produktivität reduzieren.
Es wurde nun unerwarteterweise gefunden, dass ein Bereich von Mikroorganismen, einschließlich Pilze, beispielsweise Hefen und Actinomycetes, ein racemisches Tetralon im Wesentlichen stereoselektiv reduzieren. Insbesondere reduziert die vorliegende stereoselektive mikrobielle Reduktion selektiv das (4R)-Tetralon des racemischen Gemisches, während das (4S)-Tetralon im Wesentlichen nicht umgesetzt zurück bleibt. Darüber hinaus kann das unerwünschte (4R)-Tetralol, das durch das vorliegende Verfahren hergestellt wurde, oxidiert und dann zu racemischem Tetralon racemisiert werden und das vorliegende Verfahren wiederholt werden, um auch weiteres (4S)-Tetralon zu ergeben. Das durch das vorliegende Verfahren hergestellte (4S)-Tetralon kann in der Synthese von Sertralin verwendet werden.
Alle von den hierin zitierten Dokumenten, einschließlich der vorangehenden, sind durch Bezug hierin in ihrer Gesamtheit einbezogen.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine mikrobiologische Reduktion von Carbonylgruppen, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Ketonverbindung, dem racemischen Tetralon der Formel (I), mit einem Mikroorganismus oder einem Enzymreduktionssystem, das die vorliegende Reduktion ausführen kann, welches ein von dem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Co-Faktor für das Enzym umfasst, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter geeigneten Bedingungen, sodass eine Verbindung mit einer Hydroxygruppe, insbesondere das (4R)-Tetralol der Formel (II), in dem Medium gebildet und akkumuliert werden kann, und eine Verbindung mit der gewünschten Stereochemie, das (4S)-Tetralon der nachstehenden Formel (V), im Wesentlichen nicht umgesetzt verbleibt. Das (4S)-Tetralon der nachstehenden Formel (V), das heißt chirales Tetralon, kann dann durch jedes geeignete Verfahren, beispielsweise Chromatographie oder Kristallisation, isoliert werden. Zusätzlich kann das (4R)-Tetralol der Formel (II) von den Verbindungen der Formeln (III) bis (V) getrennt, zu racemischem Tetralon oxidiert und racemisiert werden und die vorliegende stereoselektive mikrobielle Reduktion wiederholt werden, um wiederum das gewünschte chirale Keton zu ergeben.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Ausführen der nachstehenden stereospezifischen mikrobiellen Reduktion bereit:
das umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Mikroorganismus oder einem Enzymreduktionssystem, das die Reduktion ausführen kann, umfassend ein von dem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Cofaktor für das Enzym, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um mehr von der Verbindung der Formel (II) als von der Verbindung der Formel (III) zu erhalten, wobei somit mehr von der Verbindung der Formel (V) nicht umgesetzt als der Verbindung der Formel (IV) nicht umgesetzt verbleibt.
Die betreffende stereospezifische Reduktion kann ebenfalls wiedergegeben werden durch:
die umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Mikroorganismus oder einem Enzymreduktionssystem, das die Reduktion ausführen kann, umfassend ein von dem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Cofaktor für das Enzym, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um das (4R)-Tetralol der Formel (II) zu ergeben und im Wesentlichen das (4S)-Tetralon der Formel (V) nicht umgesetzt zu hinterlassen.
Die stereoselektive Reduktion umfasst weiterhin gegebenenfalls die Trennung des (4S)-Tetralons der Formel (V) von dem (4R)-Tetralol der Formel (II). Das (4R)-Tetralol kann dann oxidiert werden, um das (4R)-Tetralon hergestellt werden, das dann beispielsweise mit einer Base umgesetzt wird, um racemisches Tetralon der Formel (I) herzustellen, und die vorliegende stereoselektive mikrobielle Reduktion kann wiederholt werden, um ebenfalls mehr von dem gewünschten (4S)-Tetralon der Formel (V) zu ergeben, d.h. das (4S)-Enantiomer des racemischen Tetralons der Formel (I).
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, die die stereoselektive mikrobielle Reduktion einer Verbindung der Formel (I) zu einer Verbindung der Formel (II) umfassen durch: In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Mikroorganismus oder einem Enzymreduktionssystem, das die vorliegende Reduktion ausführen kann, umfassend ein von dem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Co-Faktor für das Enzym, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um eine Verbindung der Formel (II) zu ergeben, wobei im Wesentlichen mehr von der Verbindung der Formel (V) nicht umgesetzt verbleibt als von der Verbindung der Formel (IV) und im Wesentlichen mehr von der Verbindung der Formel (II) hergestellt wird als von der Verbindung der Formel (III).
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das In-Kontakt-Bringen der Verbindung der Formel (I) mit einem Enzymreduktionssystem. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt das In-Kontakt-Bringen der Verbindung der Formel (I) mit einem Enzymreduktionssystem, worin das Enzym immobilisiert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das In-Kontakt-Bringen der Verbindung der Formel (I) mit einem Enzymreduktionssystem, das von Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 abgeleitet ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus eine Zubereitung von aufgebrochenen Zellen davon. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus eine enzymatische Acetonpulverzubereitung davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein intakter Mikroorganismus verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform, worin der Mikroorganismus ein intakter Mikroorganismus ist, wird die Verbindung der Formel (I) mit einem Fermentationsmedium, einer Kulturbrühe oder einem Lösungsmittel, umfassend den Mikroorganismus, in Kontakt gebracht. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, worin der Mikroorganismus ein intakter Mikroorganismus ist, wird die Verbindung der Formel (I) mit gewaschenem intakten Mikroorganismus in Kontakt gebracht. In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform, worin der Mikroorganismus intakt ist, wird die Verbindung der Formel (I) mit dem immobilisierten intakten Mikroorganismus in Kontakt gebracht.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus ein intakter Mikroorganismus, der in einem Fermentationsmedium wachsen lassen wird, und das In-Kontakt-Bringen findet durch Zusatz der Verbindung der Formel (I) dazu statt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus ein intakter Mikroorganismus, der in einem Wachstumsmedium für etwa 84 Stunden wachsen lassen wird, und das In-Kontakt-Bringen in solchem Wachstumsmedium durch Zusatz der Verbindung der Formel (I) dazu stattfindet und die Inkubation für etwa fünf Tage erfolgt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus entweder ein Pilz, beispielsweise eine Hefe, oder ein Actinomycet oder ein Mutant davon, der die stereoselektive Reduktion ausführen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus ein Pilz. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wobei der Mikroorganismus ein Pilz ist, ist der Pilz Absidia coerulea ATCC Nr. 20137.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus eine Hefe. In einer speziell bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, worin der Mikroorganismus eine Hefe ist, ist die Hefe Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, auch als ATCC Nr. 74449 hinterlegt.
Wenn Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, auch als ATCC Nr. 74449 hinterlegt, als Mikroorganismus angewendet wird, reduziert die betreffende stereoselektive mikrobielle Reduktion nennenswert nur ein Enantiomer der Verbindung der Formel (I), um den entsprechenden Alkohol, d.h. die Verbindung der Formel (II), zu ergeben, während das andere Enantiomer der Verbindung der Formel (I), d.h., die Verbindung der Formel (V) im Wesentlichen nicht umgesetzt verbleibt.
Wie früher erörtert, schließen die erfindungsgemäßen Verfahren weiterhin gegebenenfalls die Trennung, beispielsweise ausgeführt unter Anwendung von Cyclisierung oder Chromatographie der Verbindung der Formel (V), von Verbindungen der Formeln (II) bis (IV) und die Verwendung von solcher abgetrennten Verbindung der Formel (V) bei der Synthese von Sertralin unter Anwendung von beliebigen dafür bekannten Verfahren ein.
Wie ebenfalls früher erörtert, ist es bevorzugt, das isolierte (4R)-Tetralol der Formel (II) zu dem (4R)-Tetralon der Formel (IV) zu oxidieren. Es ist dann weiterhin bevorzugt, vorzugsweise durch Umsetzten des (4R)-Tetralons mit einer Base, das (4R)-Tetralon der Formel (IV) zu dem racemischen Tetralon der Formel (I) zu racemisieren. Die Oxidation und Racemisierung führt das unerwünschte (4R)-Tetralol für eine weite Runde von stereoselektiver mikrobieller Reduktion gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren zurück. Das Zurückfüh ren des unerwünschten (4R)-Tetralols erhöht die Menge des gewünschten (4S)-Tetralons und senkt die Menge an unerwünschtem verworfenem (4R)-Tetralol. Die Oxidation und die Racemisierung des oxidierten Produkts kann unter Anwendung von beliebigen geeigneten bekannten Verfahren dafür ausgeführt werden.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG IM EINZELNEN
Der Fachmann wird die Begriffe, die hierin verwendet werden, um die vorliegende Erfindung zu beschreiben, vollständig verstehen, trotzdem werden die nachstehenden hierin verwendeten Begriffe wie unmittelbar nachstehend beschrieben.
„Co-Faktor" bedeutet jeder geeignete Co-Faktor, umfassend das Enzymreduktionssystem, wie beispielsweise NADH, NADPH, FADH, FMNH, und/oder PQQ, oder beliebiger geeigneter Co-Faktor, der mit dem Enzym in dem Mikroorganismus vorkommt.
„Enzymreduktionssystem" bedeutet ein geeignetes mikrobielles Oxidoreduktaseenzym und die reduzierte Form eines Co-Faktors für das Oxidoreduktaseenzym, wobei der Co-Faktor entweder von dem ausgewählten Mikroorganismus abgeleitet sein kann oder von jeder geeigneten Quelle sein kann. Das Enzym, das das Enzymreduktionssystem umfasst, kann entweder in freier oder immobilisierter Form vorliegen, beispielsweise in einer Säule oder gebunden an eine Kugel.
„Mikrobielle Reduktion" bedeutet die stereoselektive Reduktion der vorliegenden Erfindung, wie durch das Enzymreduktionssystem ausgeführt, wobei die mikrobielle Reduktase das Enzymreduktionssystem, den intakten Mikroorganismus oder eine beliebige Zubereitung davon und dergleichen umfasst.
„Mikroorganismus" schließt jeden intakten Mikroorganismus oder die Herstellung davon ein, einschließlich beispielsweise einer aufgebrochenen Zellzubereitung des Mikroorganismus, einer entwässerten Zubereitung des Mikroorganismus, beispielsweise einer enzymatischen Acetonpulverzubereitung, Mikroorganismus, der freigewaschen ist von beispielsweise Fermentationsmedium, Kulturbrühe und dergleichen, Mikroorga nismus, immobilisiert beispielsweise in einer Säule gebunden, an Kugeln und dergleichen.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Verfahren umfassen die stereoselektive mikrobielle Reduktion einer Verbindung der Formel (I) zu einer Verbindung der Formel (II).
durch In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Mikroorganismus oder einem Enzymreduktionssystem, das die Reduktion ausführen kann, umfassend ein von dem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Cofaktor für das Enzym, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um eine Verbindung der Formel (II) zu erhalten, wodurch im Wesentlichen mehr von der Verbindung der Formel (V) nicht umgesetzt als der Verbindung der Formel (IV) nicht umgesetzt verbleibt, und im Wesentlichen mehr von der Verbindung der Formel (II) hergestellt wird als der Verbindung der Formel (III).
Wie vom Fachmann verstanden werden würde, ist die Verbindung der Formel (I), racemisches Tetralon, ein Gemisch von (4S)-Tetralon und (4R)-Tetralon, wie nachstehend gezeigt:
Die Verbindungen oder insbesondere die Tetralole der Formel (II) sind:
Die Verbindungen oder insbesondere die Tetralole der Formel (III) sind:
Die Verbindungen der Formeln (II) und (III) werden in dem vorstehend erwähnten US-Patent-Nr. 5750794 offenbart und beansprucht.
Die erwünschte Verbindung der Formel (V) kann wie nachstehend beschrieben von den unerwünschten Verbindungen der Formel (II) und beliebigen der Verbindungen der Formeln (III) oder (IV), die entweder hergestellt bzw. nicht umgesetzt verbleiben können, in Abhängigkeit von beispielsweise dem ausgewählten Mikroorganismus und den Inkubationsbedingungen, isoliert werden.
Die Verbindungen der Formel (II) können zu einer Verbindung der Formel (I), beispielsweise durch Oxidation und Racemisierung, umgewandelt werden und durchlaufen die vorliegende stereoselektive mikrobielle Reduktion, um eine weitere Menge des (4S)-Tetralons der Formel (V) zu ergeben.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird leicht ausgeführt. Somit wird der Mikroorganismus entweder fermentiert (intakter Mikroorganismus) oder inkubiert (Zubereitung aufgebrochener Zellen, entwässerte Zellzubereitung oder beliebige geeignete Herstellung des Mikroorganismus) in Gegenwart des racemischen Tetralons, das durch Formel (I) wiedergegeben wird, um racemisches Tetralon zu modifizieren oder spezieller das unerwünschte (4R)-Enantiomer des racemischen Ketons zu dem entsprechenden durch Formel (I) wiedergegebenen Alkohol zu reduzieren, wobei das gewünschte durch Formel (V) wiedergegebene (4S)-Enantiomer im Wesentlichen nicht umgesetzt verbleibt, wodurch in einem Schritt das optisch angereicherte (4S)-Enantiomer erhalten wird. Das (4S)-Enantiomer kann dann durch dem Fachmann gut bekannte Verfahren umgesetzt werden, wie jene beispielsweise in dem vorstehend erwähnten US-Patent-Nr. 4536518, 4777288, 4839104, 4855500, 4940731, 4962128, 5082970, 5130338, 5196607, 5248699, 5442116, 5463126, 5466880, 5597826 und 5750794 und in dem vorstehend erwähnten Artikel von W.M. Welch jun. et al., um letztendlich Sertralin zu ergeben.
Die Aktivität, Verfahren zum Testen von Aktivitäten, Dosierungen, Dosierungsformen, Verabreichungsverfahren und Hintergrundinformation, die Sertralin betreffen, werden beispielsweise in dem vorstehend erwähnten US-Patent-Nr. 4536518, 4777288 und 4839104 und dem vorstehend erwähnten Artikel von W.M. Welch jun. et al. angegeben.
Jeder geeignete Mikroorganismus kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Wie früher beschrieben, kann der in dem vorliegenden Verfahren verwendete Mikroorganismus intakt sein, jede geeignete Zubereitung davon, beispielsweise eine Zubereitung aufgebrochener Zellen davon, eine entwässerte Zubereitung davon, und entweder frei oder immobilisiert sein. Wenn jedoch ein nicht intakter Mikroorganismus in der vorliegenden Erfindung angewendet wird, wie beispielsweise eine gebrochene Zellzubereitung, beispielsweise Zellextrakt, enzymatische Acetonpulverzubereitung oder das daraus abgeleitete Enzym, würde der Fachmann verstehen, dass ein geeigneter Co-Faktor für das Enzym ebenfalls eingeschlossen ist.
Jener Fachmann wird aus der hierin bereitgestellten Beschreibung und dem relevanten Wissen verstehen, wie eine geeignete Zubereitung aufgebrochener Zellen, wie jene beispielsweise von R.N. Patel et al. in dem Artikel „Oxidation of Secondary Alcohols to Methyl Ketones by Yeasts", veröffentlicht in, Applied and Environmental Microbiology, 38(2): 219–223 (1979), beschrieben, herzustellen ist.
Der Fachmann wird aus der darin bereitgestellten Beschreibung und deren relevantem Wissen verstehen, wie eine geeignete enzymatische Acetonpulverzubereitung, wie jene beschrieben beispielsweise von K. Nakamura et al. in dem Artikel „Asymmetric Reduction of Ketones by the Acetone Powder of Geotrichum candidum", veröffentlicht in Tetrahedron Letters, 37(10): 1629–1632 (1996), herzustellen ist.
Zusätzlich kann ein Enzym (beispielsweise eine Oxidoreduktase) von jedem geeigneten Mikroorganismus auch in den vorliegenden Verfahren angewendet werden, und dieses Enzym kann aus dem Mikroorganismus durch jedes geeignete, dem Fachmann bekannte Verfahren isoliert und kann wie für den intakten Mikroorganismus in dem vorliegenden Verfahren in entweder freier oder immobilisierter Form verwendet werden. Der Fachmann wird aus der darin bereitgestellten Beschreibung und deren verwandtem Wissen verstehen, wie das Enzym des geeigneten Mikroorganismus, wie im Allgemeinen beispielsweise in den Artikeln beschrieben von M. Wada et al., „Purification and Characterization of NADPH-Dependent Carbonyl Reductase, Involved in Stereoselective Reduction of Ethyl 4-Chloro-3-oxo-butanoate, from Candida magnoliae", veröffentlicht in Biosci. Biotechnol. Biochem, 62(2): 280–285 (1998), P. Trost et al., „Purification and Properties of NAP(P)H:(quinone-acceptor) oxidoreductase of sugarbeet cells", veröffentlicht in Eur. J. Biochem., 234: 452–458 (1995), K. M. Madyastha und T. L. Gururaja, „Purification and Some of the Properties of a Novel Secondary Alcohol Dehydrogenase from Alcaligenes eutrophus", veröffentlicht in Biochemical and Biophysical Research Communications, 211(2): 540–546 (1995), O. Bortolini et al., „Ki netic resolution of vic-diols by Bacillus stearothermophilus diacetyl reductase", veröffentlicht in Tetrahedron: Asymmetry, 9: 647–651 (1998), R.N. Patel et al., „Stereospecific microbial reduction of 4,5-dihydro-4-(4-methoxyphenyl)-6-(triflurormethyl-1H-1)-benzazepin-2-one", veröffentlicht in Enzyme Microb. Technol., 3: 906–912 (1991), und R.N. Patel et al., „Stereoselective microbial/enzymatic oxidation of (exo, exo)-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dimethanol to the corresponding chiral lactol and lactone", veröffentlicht in Enzyme Microb. Technol., 14: 778–784 (1992); und durch US-Patent-Nr. 5523223 und das vorstehend erwähnte 5580764, zu isolieren und zu reinigen ist.
Geeignete Mikroorganismen schließen Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449, Absidia coerulea ATCC Nr. 20137, Geotrichum candidum ATCC Nr. 34614, Geotrichum candidum ATCC Nr. 62401, Mortierella isabellina ATCC Nr. 42613, Mortierella isabellina ATCC Nr. 38063, Mortierella vinacea ATCC Nr. 09515, Penicillium notatum ATCC Nr. 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC Nr. 28575, Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300, Aureobasidium pullulans ATCC Nr. 16623, Debaryomyces polymorphus ATCC Nr. 20280, Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 15248, Candida schatavii ATCC Nr. 24409, Pichia fabianii ATCC 16755 und Streptomyces rimosus ss. rimosus ATCC Nr. 10970 und Mutanten davon, die bekannt oder anderweitig durch den Fachmann erhältlich sind, und trotz solcher Mutation die stereoselektive mikrobielle Reduktion, die hierin offenbart wurde, ausführen können, ein.
Bevorzugte intakte Mikroorganismen werden jene ein, die im Wesentlichen das (4R)-Tetralon reduzieren, während sie das (4S)-Tetralon im Wesentlichen nicht umgesetzt hinterlassen, wobei umgesetzt Reduktion oder beliebige andere innewohnende Aktivität einschließt, die das gewünschte (4S)-Tetralon bei jeder Stufe des vorliegenden Verfahrens abbauen oder anderweitig negativ beeinflussen könnte. Wie durch den Fachmann aus der Offenbarung hierin eingeschätzt werden würde, kann solche unerwünschte Reaktion des (4S)-Tetralons im Wesentlichen verhindert werden, beispielsweise durch Anwendung des von dem ausgewählten Mikroorganismus abgeleiteten Enzyms gegenüber dem intakten Mikroorganismus.
Der zur Verwendung in der vorliegenden stereospezifischen mikrobiellen Reduktion geeignete Mikroorganismus kann durch jedes geeignete dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren für die Herstellung eines Mikroorganismus aus einem kommerziell bezogenen Stamm wird nachstehend bereitgestellt. Das nachstehend bereitgestellte Verfahren kann für jeden zur Verwendung in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren geeigneten Mikroorganismus angewendet werden und jener Fachmann würde aus der darin bereitgestellten Beschreibung verstehen, wie jeder Teil des Verfahrens modifiziert werden muss, beispielsweise Verfahren zur Herstellung des Mikroorganismus intakt oder Herstellung von beispielsweise aufgebrochenen Zellen oder entwässerten davon, frei oder immobilisiert, Verfahren zur Herstellung eines geeigneten von solchen Mikroorganismen abgeleiteten Enzyms, Verfahren des In-Kontakt-Bringens des racemischen Tetralons mit dem Mikroorganismus oder dem Enzym, umfassend das hiervon abgeleitete Enzymreduktionssystem, Wachstumsmediumkomponenten und Bedingungen, beispielsweise Temperatur, pH-Wert und dergleichen, oder Inkubationsbedingungen, um das gewünschte Ergebnis in jedem einzelnen Verfahren zu erreichen.
Der Fachmann wird aus der hierin bereitgestellten Beschreibung und deren verwandtem Wissen verstehen, wie geeignete immobilisierte intakte Mikroorganismen, wie hierin beschrieben, beispielsweise von A. Bauer et al. in dem Artikel „Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitrites", veröffentlicht in Biotechnology Letters, 18(3): 343–348 (März 1996), herzustellen sind.
Jedes geeignete Verfahren des In-Kontakt-Bringens der Verbindung der Formel (I) mit dem Mikroorganismus oder Enzymreduktionssystem kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Verbindung der Formel (I) kann mit dem Mikroorganismus oder dem Enzymreduktionssystem in jeder geeigneten Reihenfolge in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise kann die Verbindung der Formel (I) zu einem Medium, wie einer Kulturbrühe; die den Mikroorganismus, frei oder immobilisiert oder in einiger Kombination davon, umfasst, zugesetzt werden oder das Medium kann die Verbindung der Formel (I) umfassen, und der Mikroorganismus kann dann zu solchem Medium gegeben werden oder die Verbindung der Formel (I) und der Mikroorganismus können zusammen zu solchem Medium gegeben werden oder die Verbindung der Formel (I) kann zu einer Zubereitung aufgebrochener Zellen davon gegeben werden oder die Verbindung der Formel (I) kann zu einer entwässerten Zubereitung von dem Mikroorganismus gegeben werden oder entweder die Verbindung der Formel (I) oder der Mikroorganismus oder das Enzymreduktionssystem können zu einem geeigneten den anderen umfassenden Lösungsmittel und dergleichen gegeben werden. Der Fachmann wird aus der hierin bereitgestellten Beschreibung verstehen, wie jeder Teil des vorliegenden Verfahrens wie erwünscht zu modifizieren ist.
Es ist in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt, dass der Mikroorganismus oder das Enzymreduktionssystem von Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 abgeleitet ist. Eine lyophilisierte Probe von Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 (ursprünglich von D.W. Levine beigetragen) wurde mit dem ATCC, das sich am 10801 University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, U.S.A. befindet, unter den Maßgaben des Budapester Vertrags am 26. Juni 1998 hinterlegt. Dieser neu hinterlegten Kultur wurde die neue Hinterlegungsnummer von ATCC Nr. 74449 gegeben. Folglich ist es ebenfalls besonders in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass der Mikroorganismus Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449 ist. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der so hinterlegten Mikroorganismenkultur für die Öffentlichkeit fallen unwiderruflich mit der Veröffentlichung eines Patents aus der Beschreibung der vorliegenden Erfindung.
Kulturen von Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 können von dem ATCC erhalten werden und ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren für dessen Herstellung von einem solchen kommerziell bezogenen Stamm wird unmittelbar nachstehend bereitgestell. Eine so erhaltene Kultur wird zu einem geeigneten Wachstumsmedium gegeben und wird mit Schütteln, bis Wachstum auftritt, inkubiert, beide Schritte wie von dem Fachmann eingeschätzt. Die so hergestellte Kultur kann verwendet werden, um Schrägkulturen zu inokulieren mit Anteilen von diesen Schrägkulturen gefroren als Masterstämme. Alternativ können flüssige Stammkulturen hergestellt werden, zu denen Glycerin mit etwa 10 % bis etwa 20 % gegeben wird, welche dann bei etwa –80°C vorzugsweise in schmalen Cryoröhrchen gefroren werden.
Wie für den Fachmann verständlich, ist für jeden ausgewählten Mikroorganismus und wie speziell hierin nachstehend in den Beispielen für Absidia coerulea ATCC Nr. 20137 und den speziell bevorzugten Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 oder ATCC Nr. 74449 ein geeignetes Herstellungsverfahren der Mikroorganismus wie nachstehend: Der Mikroorganismus wird aus einer gefrorenen Stammkultur wie vorstehend beschrieben (etwa ein 17%iger Glycerinstamm) in einem Kolben oder einem Glasrohr mit einem Metallverschluss, der ein Medium enthält (enthaltend eine aliquote Menge aus einer sterilen Lösung, die Tween^® 80, Glycerin und destilliertes Wasser einschließt), dessen Zusammensetzung nachstehend genauer beschrieben wird, inokuliert. Die Fermentation wird bei Temperaturen im Bereich von etwa 22°C bis etwa 32°C und vorzugsweise bei etwa 29°C unter geeignetem Schütteln, vorzugsweise etwa 200 U/min bis etwa 220 U/min und besonders bevorzugt bei etwa 210 U/min ausgeführt. Falls erwünscht, kann der pH-Wert des Wachstumsmediums durch die Verwendung von geeigneten Puffern, die in das Fermentationsmedium und/oder periodisch eingestellt durch Zusatz von entweder einer Base oder einer Säure, falls erforderlich, eingearbeitet werden, gehalten werden.
Jede geeignete Dauer des Wachstums des Mikroorganismus unter In-Kontakt-Bringen des Mikroorganismus mit der Verbindung der Formel (I) und Inkubation der Verbindung der Formel (I) mit dem Mikroorganismus kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignetes Wachstum des Mikroorganismus kann beispielsweise innerhalb 24 Stunden erreicht werden, wobei zu der Zeit eine geeignete aliquote Menge einer Lösung von racemischem Tetralon in einem geeigneten Lösungsmittel, vorzugsweise Ethanol, zu der Kultur gegeben werden kann. Die Fermentation kann dann fortgesetzt werden, beispielsweise für etwa zwei bis etwa sechs Tage und vorzugsweise beispielsweise für etwa fünf Tage, wobei zu der Zeit die Fermentationsbrühe unter Anwendung von beliebigem geeigneten Extraktionsverfahren extrahiert werden kann, wobei ein geeignetes Lösungsmittel, wie beispielsweise Essigsäureethylester, Methylisobutylketon, Methylethylketon, Methylenchlorid und dergleichen, vorzugsweise Essigsäureethylester, die organischen Komponenten aus der Fermentationsbrühe entfernt. Nach Extraktion der Fermentationsbrühe und Abtrennung der organischen und wässrigen Phasen können die den organischen Rest umfassenden Verbindungen unter Anwendung von jedem geeigneten Verfahren, wie beispielsweise Chromatographie, vorzugsweise chirale HPLC, bestimmt werden.
Jedes geeignete Wachstumsmedium kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und das geeignete Wachstumsmedium wird eine Quelle oder Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und anorganische Salze, die wesentliche Mineralien enthalten, enthalten. Im Allgemeinen können viele Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glukose, Maltose, Mannose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Hirsegelee, Melassen, Sojabohne und dergleichen, als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff verwendet werden. Quellen für assimilierbaren Stickstoff schließen beispielsweise Materialien, wie Hefe und Caseinhydrolysate, Primärhefe, Hefeextrakte, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenfeststoff, Weizenkeim, Fleischextrakte, Pepton, Maisquellwasser und Ammoniumsalze, ein. Geeignete anorganische Salznährmedien zur Verwendung in dem Kulturmedium der vorliegenden Erfindung schließen beispielsweise die üblichen Salze, die Natrium, Eisen, Magnesium, Kalium, Kobalt, Phosphat und dergleichen enthalten, ein. Insbesondere schließen Wachstumsmedien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beispielsweise ein:

(a) Dextrose (etwa 20 Gramm (g)), Hefeextrakt (etwa 5 g), Sojamehl (etwa 5 g), NaCl (etwa 5 g), K₂HPO₄ (etwa 5 g) und destilliertes Wasser (etwa 1 Liter (l)), pH eingestellt auf etwa pH 7,0 mit H₂SO_4(aq.)
(b) Dextrin (etwa 10 g), Rindfleischextrakt (etwa 3 g), Ardamin pH (etwa 5 g), NZ-Amintyp E (etwa 5 g), MgSO₄·7H₂O (etwa 0,5 g), KH₂PO₄ (etwa 0,37 g), CaCO₃ (etwa 0,5 g) und destilliertes H₂O (etwa 1 l), pH eingestellt auf etwa 7,1 mit HCl_(aq.), gefolgt von einer zweiten Stufe von Glukose (etwa 10 g), Hy-Case SP^® (etwa 2 g), Rindfleischextrakt (etwa 1 g), Maisquellwasser (etwa 3 g) und destilliertes H₂O (etwa 1 l), pH eingestellt auf etwa pH 7,0;
(c) Glukose (etwa 10 g), Maisquellwasser (etwa 6 g), KH₂PO₄ (etwa 3 g), CaCO₃ (etwa 3,5 g), Sojabohnenöl (roh, etwa 2,2 Milliliter (ml)), Hefeextrakt (etwa 2,5 g) und destilliertes H₂O (etwa 1 l), pH eingestellt auf etwa pH 7,0 bis etwa pH 7,3 mimt HCl_(aq);
(d) Malzsirup (etwa 20 g), Sojabohnenmehl (etwa 5 g), Casein (etwa 1 g), getrocknete Hefe (etwa 1 g), NaCl (etwa 5 g) und destilliertes H₂O (etwa 1 l);
(e) Laktose (etwa 75 g), Pharmamedia^® (substituierter Hefeextrakt, etwa 40 g), CaCO₃ (etwa 10 g), Na₂SO₄ (etwa 4 g) und destilliertes H₂O (etwa 1 l);
(f) ISP Nr. 2 (siehe beispielsweise Seite 460 von dem Handbook of Microbial Media by R.M. Atlas, Hrsg. von L.C. Parks, CRC Press, Inc., 1993, („Handbuch"));
(g) ISP Nr. 3 (siehe Seite 460 des Handbuchs);
(h) ISP Nr. 4 (siehe Seite 461 des Handbuchs);
(i) ISP Nr. 5 (siehe Seiten 461–462 des Handbuchs) und dergleichen.

Ein besonders bevorzugtes Wachstumsmedium ist 2X von vorstehend bereitgestelltem (a).
Ein Bezug auf bestimmte Puffer, Medien, Reagenzien, In-Kontakt-Bringen oder Kulturbedingungen und dergleichen ist nicht als begrenzend vorgesehen, sollte jedoch so verstanden werden, dass alle solche relevanten Materialien eingeschlossen sind, die der Fachmann im besonderen Zusammenhang mit der hierin wiedergegebenen Diskussion als von Interesse oder Wert erkennen würde. Beispielsweise ist es häufig möglich, ein Puffersystem oder Kulturmedium gegen ein anderes auszutauschen, sodass ein anderer, jedoch bekannter Weg verwendet wird, um die gleichen Ziele wie jene, auf die die Anwendung des vorgeschlagenen Verfahrens, Materials oder Zusammensetzung gerichtet ist, zu erreichen. Darüber hinaus sollte es verständlich sein, dass die vorliegende Erfindung das Erhöhen des Maßstabs des vorliegenden Verfahrens für kommerzielle Zwecke einschließt.
Folglich, wie durch den Fachmann verstanden werden würde, kann Variation des Wachstumsmediums, der Fermentationsbedingungen und/oder der Menge an racemischem Tetralon verändert werden, um die Ausbeute der sich ergebenden Verbindungen und deren relative Herstellungsgeschwindigkeiten zu verändern. Im Allgemeinen werden die in der vorliegenden Erfindung angewendeten Techniken bezüglich der industriellen Wirksamkeit ausgewählt. Die hierin beschriebenen Wachstumsmedien, Fermentationsbedingungen und relativen Mengen an Mikroorganismus oder Enzymreduktionssystem und racemischem Tetralon sind für eine breite Vielzahl von Medien, Fermentationsbedingungen und Mengen an Ausgangsmaterialien, die geeigneterweise in der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, wie durch den Fachmann eingeschätzt, nur veranschaulichend und sind nicht vorgesehen, sie in irgendeiner Weise zu begrenzen.
Beliebige geeignete Verfahren zum Isolieren und/oder Puffern von beliebigen der Produkte des vorliegenden Verfahrens können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich Filtration, Extraktion, Kristallisation, Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie, präparative Niederdruckflüssigchromatographie oder HPLC oder jede geeignete Kombination von solchen Verfahren.
Weiterhin würde es der Fachmann schätzen, dass der unerwünschte entsprechende Alkohol von dem (4R)-Tetralon, die Verbindung der Formel (II), die durch die hierin offenbarten Verfahren hergestellt wurde, zurückgeführt werden kann, beispielsweise oxidiert und racemisiert, wie hierin früher offenbart, durch jedes geeignete bekannte Verfahren zu einem racemischen Tetralon der Formel (I) und die erfindungsgemäßen Verfahren wiederholt, um ein weiteres Mal das gewünschte (4S)-Tetralon der Formel (V) zu ergeben. Die Oxidation des (4R)-Tetraols zu dem (4R)-Keton kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren ausgeführt werden. Die Racemisierungsreaktion kann in jeder geeigneten Weise ausgeführt werden, wird jedoch im Allgemeinen bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 100°C, vorzugsweise etwa 25°C bis etwa 65°C, ausgeführt. Das (4R)-Tetralon wird mit einer Base bei einer Temperatur von etwa 25°C bis etwa 85°C, vorzugsweise etwa 50°C bis etwa 65°C, umgesetzt. Geeignete Basen für diese Racemisierungsreaktion schließen Kalium-t-butoxid, Natriumhydroxid, Natriummethoxid und Kaliumhydroxid ein. Eine bevorzugte Base ist Kalium-t-butoxid.
Die detaillierten nachstehend bereitgestellten Beispiele zeigen, dass ein Bereich von Mikroorganismen, einschließlich Pilze, beispielsweise Hefen und Actinomyceten, stereoselektiv racemisches Tetralon reduzieren, um das gewünschte (4S)-Tetralon der Formel (V) zu ergeben, d.h. chirales Tetralon, das dann aus den unerwünschten Verbindungen abgetrennt werden kann und gemäß auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren weiter zu Sertralin umgesetzt wird.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Die vorangehende und nachstehende Beschreibung der vorliegenden Erfindung und die verschiedenen Ausführungsformen sind nicht vorgesehen, die Erfindung zu be grenzen, sondern sind eher veranschaulichend dafür. Folglich ist es verständlich, dass die Erfindung nicht auf die besonderen Einzelheiten von diesen Beispielen beschränkt ist.
BEISPIEL I
Reduktion von einem racemischen Tetralon unter Anwendung von Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012
A. Fermentation von dem Hefe-Hansenula-polymorpha ATCC Nr. 26012
Eine „Kontroll"kultur (C1) und eine „Test"kultur (T1) wurden wie nachstehend hergestellt: etwa 2,5 ml steriles Wachstumsmedium (etwa 40 g/l Dextrose, etwa 10 g/l Nährsojamehl, etwa 10 g/l Hefeextrakt, etwa 10 g/l NaCl und etwa 10 g/l K₂HPO₄, wobei der pH-Wert mit H₂SO₄ auf etwa 7, 0 eingestellt wird) wurden zu jeweils zwei 16-x-125-mm-Glasröhrchen, jedes mit einem Metallverschluss (C1, T1), gegeben, gefolgt von der Zugabe von etwa 0,2 ml einer Lösung A (etwa 25 g Tween^® 80, etwa 100 g Glycerin und etwa 250 ml destilliertes Wasser, filtersterilisiert) zu jeder der zwei Kulturen.
Etwa 25 μl von etwa einem 17%igen gefrorenen Glycerinstamm von Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 wurden in T1 inokuliert. Die zwei Röhrchenkulturen wurden bei etwa 29°C unter Schütteln bei etwa 210 U/min inkubiert. Nach etwa 24 Stunden wurden etwa 50 μl einer Stammlösung (etwa 5 mg/ml in etwa 100 % Ethanol, Endkonzentration etwa 100 mg/ml) von einem racemischen Tetralon (Verbindung der Formel (I), umfassend die Verbindungen der Formeln (IV) und (V), bei etwa 5 mg/ml in Ethanol) zu C1 und T1 gegeben.
Nach etwa 5 Tagen wurde 1 ml NaCl (gesättigt) zu jeder der zwei Röhrchenkulturen gegeben. Die Fermentationsbrühe von jeder Röhrchenkultur (etwa 3,6 ml) wurde mit einem gleichen Volumen Essigsäureethylester (unverdünnt) extrahiert: Der Essigsäureethylester wurde zugegeben, die Röhrchenkultur wurde Vortex-behandelt und dann bei etwa 2000 U/min (IEC^®-Zentrifuge, 300 Second Avenue, Needham Heights, Mass. 02194) zentrifugiert. Die Essigsäureethylesterschicht wurde entfernt und die wässrige Schicht ein zweites Mal extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden heruntergetrocknet unter Stickstoff in einem Wasserbad bei etwa 50°C.
B. Konfiguration des zurückbleibenden Ketons: Verbindungen der Formeln (IV) und (V)
Jeder von den wie vorstehend beschrieben hergestellten Extrakten wurde in etwa 1 ml Ethanol resuspendiert und etwa 20 μl von jedem resuspendierten Extrakt wurden durch Einspritzung auf eine HPLC-Säule analysiert: Chiralcel-OK-Guard-Säule (4,6 × 50 mm, Diacel Chemical Industries, LTD., 730 Springdale Drive, P.O. Box 564, Exton, Pa. 19341), gekuppelt an eine Chiralcel-OK-Säule (4,6 × 250 mm, Daicel). Die innerhalb von jedem eingespritzten resuspendierten Extrakt enthaltenen Verbindungen wurden getrennt isokratisch bei etwa 0,8 ml/min in einer mobilen Phase (Ethanol:Essigsäureethylester, 85:15) getrennt und die die Extrakte umfassenden Verbindungen wurden unter Anwendung eines 996-PDA-Detektors (Waters^®, 34 Maple Street, Milford, Mass. 01757), eingestellt auf 254 nm, nachgewiesen.
Wie durch die Daten von C1 und T1 in nachstehender Tabelle 1 erläutert, zeigt chirale HPLC-Analyse, dass der Einschluss des Mikroorganismus, d.h. Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, ein Verhältnis von 16:1 ((4S)-Tetralon der Formel (V) nicht umgesetzt gegen (4R)-Tetralon der Formel (IV) nicht umgesetzt) ergibt, was weiterhin die Stereospezifität des vorliegenden mikrobiellen Reduktionsverfahrens erläutert. Die nachstehend berichteten Ergebnisse werden auf der bekannten Menge von jedem zugegebenen Enantiomer (etwa 50 μg/ml von jeder der Verbindungen der Formeln (IV) und (V)) basieren. Wie vorstehend erwähnt, hatte das racemische Ausgangstetralon der Formel (I) eine Konzentration von etwa 100 μg/ml.
TABELLE 1
Die Ergebnisse aus der chiralen Analyse zeigen, dass die Kultur Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 (T1) im Wesentlichen das (4R)-Tetralon reduziert, wobei das (4S)-Tetralon im Wesentlichen nicht umgesetzt verbleibt (etwa 4,7 % (4R)-Tetralon verbleibt gegenüber etwa 76 % des (4S)-Tetralons). Das (4S)-Tetralon wurde als in etwa 88 % ee („Prozentmenge an enantiomerem Überschuss") durch solche chirale HPLC vorliegend bestimmt. Wie auch durch die Daten von Tabelle 1 gezeigt, verbleibt speziell durch das Verhältnis von (4S) : (4R), d.h. 16, im Wesentlichen mehr (4S)-Tetralon nicht umgesetzt als (4R)-Tetralon.
Folglich ergab der Einschluss des intakten Mikroorganismus, d.h. Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, die stereospezifische Reduktion von wesentlich mehr des Ausgangs-(4R)-Tetralons der Formel (IV) als das Ausgangs-(4S)-Tetralon der Formel (V) ((4S):(4R)) und ergab das meiste von dem (4R)-Tetralol der Formel (II) gegenüber dem (4S)-Tetralol der Formel (III) (Daten nicht gezeigt). Die Mehrheit des gewonnenen (4R)-Tetralols war das (1S, 4R)-Tetralol und die Mehrheit von der geringen Menge an gewonnenem (4S)-Tetralol war das (1S, 4S)-Tetralol.
BEISPIEL II
Reduktion von einem racemischen Tetralon unter Anwendung von Absidia coerulea ATCC Nr. 20137
A. Fermentation von dem Pilz Absidia coerulea ATCC Nr. 20137
Eine „Kontroll"kultur (C2) und eine „Test"kultur (T2) wurden wie nachstehend hergestellt: etwa 2,5 ml steriles Wachstumsmedium (etwa 20 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Nährsojamehl, etwa 5 g/l Hefeextrakt, etwa 5 g/l NaCl und etwa 5 g/l K₂HPO₄, wobei der pH-Wert mit H₂SO₄ auf etwa 7, 0 eingestellt wurden) wurden zu jeweils zwei 16-x-125-mm-Glasröhrchen, jedes mit einem Metallverschluss (C2, T2), gegeben.
Etwa 25 μl von etwa einem 17%igen gefrorenen Glycerinstamm von Absidia coerulea ATCC Nr. 20137 wurden in T2 inokuliert. Die zwei Röhrchenkulturen wurden bei etwa 29°C unter Schütteln bei etwa 210 U/min inkubiert. Nach etwa 48 Stunden wurden etwa 50 μl (etwa 5 mg/ml in Ethanol, Endkonzentration etwa 100 mg/ml) eines racemischen Tetralons (wie in Beispiel 1 hierin beschrieben, bei etwa 5 mg/ml in etwa 100 % Ethanol) zu C2 und T2 gegeben.
Nach etwa 5 Tagen wurde 1 ml NaCl (gesättigt) zu jeder der zwei Röhrchenkulturen gegeben. Die Fermentationsbrühe von jeder Röhrchenkultur (etwa 3,6 ml) wurde mit etwa 3 ml Essigsäureethylester (unverdünnt) extrahiert: Der Essigsäureethylester wurde zugegeben, die Röhrchenkultur wurde Vortexbehandelt und dann bei etwa 2000 U/min (IEC-Zentrifuge) zentrifugiert. Die Essigsäureethylesterschicht wurde entfernt und die wässrige Schicht für eine zweite Zeit extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden heruntergetrocknet unter Stickstoff in einem Wasserbad bei etwa 50°C.
B. Konfiguration des zurückbleibenden Ketons: Verbindungen der Formeln (IV) und (V)
Jeder der wie vorstehend beschrieben hergestellten Extrakte wurde in etwa 1 ml Ethanol resuspendiert und etwa 20 μl von jedem resuspendierten Extrakt wurden durch Einspritzung in eine HPLC-Säule analysiert: Chiralcel-OK-Guard-Säule (4,6 × 50 mm), gekuppelt an eine Chiralcel-OK-Säule (4,6 × 250 mm). Die innerhalb von jedem eingespritzten resuspendierten Extrakt enthaltenen Verbindungen wurden isokratisch bei etwa 0,8 ml/min in einer mobilen Phase (Ethanol:Essigsäureethylester, 85:15) getrennt und die die Extrakte umfassenden Verbindungen wurden unter Anwendung eines 996-PDA-Detektors (Waters^®), eingestellt auf 254 nm, nachgewiesen.
Wie durch die HPLC-Daten von C2 und T2 nachstehend erläutert, ergab der Einschluss der Mikroorganismen, d.h. Absidia coerulea ATCC Nr. 20137, die stereospezifische Reduktion von mehr als dem Ausgangs-(4R)-Tetralon der Formel (V) als von dem Ausgangs-(4S)-Tetralon der Formel (V).
Insbesondere zeigen die Ergebnisse aus der chiralen Analyse, dass die Kultur Absidia coerulea ATCC Nr. 20137 das (4R)-Tetralon reduziert, wobei das (4S)-Tetralon (etwa 13,6 % (4R)-Tetralon verbleiben gegenüber etwa 40,5 % des (4S)-Tetralons) im Wesentlichen nicht umgesetzt verbleibt. Das (4S)-Tetralon wurde als in etwa 50 % ee durch solche chirale HPLC vorliegend bestimmt.
Wie durch die Daten für C2 und T2 von nachstehender Tabelle II veranschaulicht, zeigt chirale HPLC-Analyse, dass der Einschluss des Mikroorganismus, d.h. Absidia coerulea ATCC Nr. 20137 (T2) zu einem Verhältnis von mindestens zweimal so viel von dem (4S)-Tetralon, das nicht reduziert verbleibt gegenüber dem nicht reduzierten (4R)-Tetralon, was weiterhin die Stereospezifität des vorliegenden mikrobiellen Reduktionsverfahrens verdeutlicht. Die nachstehend berichteten Ergebnisse basieren auf der bekannten Menge von jedem zugegebenen Enantiomer (etwa 50 μg/ml jeweils wie in Beispiel I hierin beschrieben). Wie vorstehend erwähnt, hatte das racemische Ausgangstetralon eine Konzentration von etwa 100 μg/ml.
TABELLE II
BEISPIEL III
Reduktion von einem racemischen Tetralon unter Anwendung von Pilzen, Hefen und einem Actinomyceten
Wie dem Fachmann verständlich sein würde, wurden für die in Tabelle III angeführten Mikroorganismen, die in der vorliegenden Reduktion verwendet wurden, Geotrichum candidum ATCC Nr. 62401, Mortierella isabellina ATCC Nr. 38063, Mortierella vinacea ATCC Nr. 09515, Penicillium notatum ATCC Nr. 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC Nr. 28575, Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300, Aureobasidium pullulans ATCC Nr. 16623, Pichia fabianii ATCC Nr. 16755 und Streptomyces rimosus ss. rimosus ATCC Nr. 10970 wie in Beispiel II beschrieben hergestellt; Geotrichum candidum ATCC Nr. 34614, Mortierella isabellina ATCC Nr. 42613, Debaryomyces polymorphus ATCC Nr. 20280 und Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 15248 wurden wie in Beispiel II beschrieben hergestellt mit der Ausnahme, dass die Extraktion wiederholt wurde; und Candida schatavii ATCC Nr. 24409 wurde wie nachstehend bereitgestellt hergestellt.
Candida schatavii ATCC Nr. 24409 wurde gemäß der vorliegenden Erfindung wie nachstehend hergestellt und verwendet: Etwa 2,5 ml steriles Wachstumsmedium (etwa 20 g/l Dextrose, etwa 5 g/l Nährsojamehl, etwa 5 g/l Hefeextrakt, etwa 5 g/l NaCl und etwa 5 g/l K₂HPO₄, wobei der pH-Wert mit H₂SO₄ auf etwa 7,0 eingestellt wurde) wurden zu einem 16-x-125-mm-Glasröhrchen mit einem Metallverschluss gegeben, gefolgt von der Zugabe von etwa 0,1 ml einer filtersterilisierten Lösung von etwa 25 g Tween^® 80, etwa 100 g Glycerin und etwa 250 ml destilliertem Wasser zu der Kultur. Nun wurden etwa 25 μl von etwa 17%igem gefrorenem Glycerinstamm von Candida schatavii ATCC Nr. 24409 in der Kultur inokuliert. Die Kultur wurde unter Schütteln bei etwa 210 U/min bei etwa 29°C wachsen lassen. Nach etwa 48 Stunden wurden etwa 50 μl einer Stammlösung (etwa 5 mg/ml in etwa 100%igem Ethanol, Endkonzentration von etwa 100 μg/ml) von einem racemischen Tetralon (Verbindung der Formel (I), umfassend die Verbindungen der Formeln (IV) und (V), bei etwa 5 mg/ml in etwa 100%igem Ethanol) zu der Kultur gegeben.
Nach weiteren vier Tagen wurde die Fermentationsbrühe der Kultur (etwa 2,6 ml) mit einem gleichen Volumen Essigsäureethylester (unverdünnt) extrahiert. Die Kultur wurde Vor tex-behandelt und dann bei etwa 2000 U/min (IEC^®-Zentrifuge) zentrifugiert. Die Extraktion wurde wiederholt. Die Extrakte wurden unter Stickstoff in einem Wasserbad bei etwa 50°C heruntergetrocknet. Der Extrakt wurde dann in etwa 1 ml Ethanol resuspendiert und etwa 5 μl des resuspendierten Extrakts wurden durch Einspritzung auf eine HPLC-Säule Chiralcel-OD-Guard-Säule (4,6 × 50 mm, Diacel Chemical Industries, LTD.), gekuppelt an eine Chiralcel-OD-Säule (4,6 × 250 mm, Daicel), analysiert. Die innerhalb des eingespritzten resuspendierten Extrakts enthaltenen Verbindungen wurden isokratisch bei etwa 0,9 ml pro Minute in einer mobilen Phase (Hexan:Isopropanol, 95:5) getrennt und die den Extrakt umfassenden Verbindungen wurden unter Anwendung eines 996-PDA-Detektors (Waters^®), eingestellt auf 210 nm, nachgewiesen.
Wie durch die in Tabelle III mitgeteilten chiralen HPLC-Daten (durchgeführt wie in Beispiel I und II) gezeigt, verminderte jeder der in nachstehend in Tabelle III angeführten Mikroorganismen stereospezifisch mehr von dem (4R)-Tetralon als von dem (4S)-Tetralon und ergab im Allgemeinen ein Verhältnis von mindestens etwa dem Zweifachen so viel von dem (4S)-Tetralon, was nicht umgesetzt hinterlassen wurde, gegenüber nicht umgesetztem (4R)-Tetralon.
TABELLE III
Es sollte angemerkt werden, dass obwohl intaktes Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300, wie durch die Daten von Tabelle III erläutert, wesentlich mehr von dem (4R)-Tetralon gegenüber dem (4S)-Tetralon reduzierte und als solches ein bevorzugter Mikroorganismus zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren sein würde, wurde. trotzdem ein unerwünschter Abbau von sowohl dem (4R)-Tetralon als auch dem (4S)-Tetralon auch für diese Kultur mitgeteilt. Der unerwünschte Abbau kann aufgrund von beispielsweise den anderen Enzymen und dergleichen, die den intakten Mikroorganismus umfassen, erfolgen. Deshalb ist es, wie dem Fachmann von der hierin bereitgestellten Beschreibung verständlich werden wird, bevorzugt, das Enzym aus dem Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300 gegenüber intaktem Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300 zu isolieren.

Claims

Verfahren zur stereoselektiven mikrobiellen Reduktion einer Verbindung der Formel (I) zu Verbindungen der Formeln (II) und (III)
das umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Mikroorganismus oder einem Enzymreduktionssys tem, das die Reduktion ausführen kann, umfassend ein von dem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Cofaktor für das Enzym, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um mehr von der Verbindung der Formel (II) als von der Verbindung der Formel (III) zu erhalten, wobei somit mehr von der Verbindung der Formel (V) nicht umgesetzt als der Verbindung der Formel (IV) nicht umgesetzt verbleibt, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449, Absidia coerulea ATCC Nr. 20137, Geotrichum candidum ATCC Nr. 34614, Geotrichum candidum ATCC Nr. 62401, Mortierella isabellina ATCC Nr. 42613, Mortierella isabellina ATCC Nr. 38063, Mortierella vinacea ATCC Nr. 09515, Penicillium no tatum ATCC Nr. 36740, Blastoschizomyces capitatus ATCC Nr. 28575, Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300, Aureobasidium pullulans ATCC Nr. 16623, Debaryomyces polymorphus ATCC Nr. 20280, Saccharomyces cerevisiae ATCC Nr. 15248, Candida schatavii ATCC Nr. 24409, Pichia fabianii ATCC 16755 und Streptomyces rimosus ss. rimosus ATCC Nr. 10970; und Mutanten davon, die die Reduktion ausführen können.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (V) von den Verbindungen der Formeln (II), (III) und (IV) getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Trennung durch Chromatographie ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Trennung durch Kristallisation ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Verbindung der Formel (II) von den Verbindungen der Formeln (III) und (IV) getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die abgetrennte Verbindung der Formel (II) zu einer Verbindung der Formel (I) durch Oxidieren der abgetrennten Verbindung der Formel (II) und Racemisieren der oxidierten Verbindung zu der Verbindung der Formel (I) zurückgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Racemisierung Umsetzen der oxidierten Verbindung mit einer Base umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 6 definiert hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das In-Kontakt-Bringen mit dem Mikroorganismus erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das In-Kontakt-Bringen mit dem Enzymreduktionssystem erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus ein intakter Mikroorganismus ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus eine aufgebrochene Zellzubereitung davon ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus eine dehydratisierte Zubereitung davon ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei der intakte Mikroorganismus gewaschene Zellen des intakten Mikroorganismus umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die gewaschenen Zellen immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Enzym des Enzymreduktionssystems immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die dehydratisierte Zubereitung eine enzymatische Acetonpulverzubereitung ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus in einer Kulturbrühe ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das In-Kontakt-Bringen durch Hinzufügen der Verbindung der Formel (I) zu der Kulturbrühe erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Enzymreduktionssystem in einem Lösungsmittel vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Lösungsmittel ein deutlich organisches Lösungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das In-Kontakt-Bringen durch Hinzufügen der Verbindung der Formel (I) zu dem Lösungsmittel erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus der Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 oder der Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449 oder die Mutanten davon ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das das Enzym umfassende Enzymreduktionssystem von dem Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 oder dem Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449, oder den Mutanten davon abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Mikroorganismus der Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 oder der Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449 oder die Mutanten davon ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Mikroorganismus der Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012 oder der Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449 oder die Mutanten davon ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus der Absidia coerulea ATCC Nr. 20137 oder die Mutanten davon ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das das Enzym umfassende Enzymreduktionssystem von dem Absidia coerulea ATCC Nr. 20137 oder den Mutanten davon abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das das Enzym umfassende Enzymreduktionssystem von dem Monosporium olivaceum v. major ATCC Nr. 36300 oder den Mutanten davon abgeleitet ist.
Verfahren zur stereoselektiven mikrobiellen Reduktion einer Verbindung der Formel (I) zu Verbindungen der Formeln (II) und (III)
das umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Mikroorganismus und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um mehr von der Verbindung der Formel (II) als der Verbindung der Formel (III) zu erhalten, wobei somit mehr von der Verbindung der Formel (V) nicht umgesetzt als der Verbindung der Formel (IV) nicht umgesetzt verbleibt, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449 und Mutanten davon, die die Reduktion ausführen können.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei der Mikroorganismus in einer Kulturbrühe ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das In-Kontakt-Bringen durch Hinzufügen der Verbindung der Formel (I) zu der Kulturbrühe erfolgt.
Verfahren zur stereoselektiven mikrobiellen Reduktion einer Verbindung der Formel (I) zu Verbindungen der Formeln (II) und (III)
das umfasst: In-Kontakt-Bringen einer Verbindung der Formel (I) mit einem Enzymreduktionssystem, das die Reduktion ausführen kann, umfassend ein von einem Mikroorganismus abgeleitetes Enzym und einen Cofaktor für das Enzym, und Inkubieren des erhaltenen Gemisches unter ausreichenden Bedingungen, um mehr von der Verbindung der Formel (II) als der Verbindung der Formel (III) zu erhalten, wobei somit mehr von der Verbindung der Formel (V) nicht umgesetzt als der Verbindung der Formel (IV) nicht umgesetzt verbleibt, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Hansenula polymorpha ATCC Nr. 26012, Hansenula polymorpha ATCC Nr. 74449 und Mutanten davon, die die Reduktion ausführen können.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Enzymreduktionssystem in einem Lösungsmittel vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei das In-Kontakt-Bringen durch Hinzufügen der Verbindung der Formel (I) zu dem Lösungsmittel erfolgt.