DE69626820T2

DE69626820T2 - Reduktion von ketongruppen

Info

Publication number: DE69626820T2
Application number: DE69626820T
Authority: DE
Inventors: David Christopher Great Ayton REEVE
Original assignee: Avecia Ltd
Current assignee: NPIL Pharmaceuticals UK Ltd
Priority date: 1995-06-23
Filing date: 1996-06-17
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2016-06-18
Also published as: EP0833938A1; JPH11507204A; AU6230696A; DK0833938T3; EP0833938B1; WO1997000968A1; CA2221800A1; US6001615A; JP3580825B2; CA2221800C; DE69626820D1; ATE234935T1; ES2194995T3; CZ412997A3; CZ291886B6; GB9512837D0

Description

Die folgende Erfindung betrifft die Reduktion von Ketongruppen.
Aus Brower et al. Tetrahedron letters 1992, Seiten 2279-2282 ist die Synthese einer Verbindung der Formel
durch diastereoselektive Reduktion einer Verbindung der Formel
unter Verwendung des Verfahrens von Chen et al, Tetrahedron Letters 1987 28 155 und Chem Lett 1987 1923 mit nachfolgendem Schützen als Acetonid bekannt. Die Darstellung der Verbindung (I) über eine gekreuzte Claisen-Reaktion wurde ebenfalls beschrieben. Bei diesen Synthesewegen wurden Temperaturen von –90°C verwendet, weswegen sie teuer und unpraktisch sind.
Die Verbindung (I) läßt sich als Zwischenverbindung bei der Synthese von CI-981, einem Inhibitor der HMG-CoA-Reduktase, die das Gesamtplasmacholesterin sowie „Low Density”-Lipoprotein-Cholesterin im menschlichen Körper reduziert, einsetzen. Sein entscheidendes Strukturmerkmal läßt sich auch aus einer Verbindung der Formel
ableiten.
In der obigen Formel bedeutet R eine Alkylgruppe, vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, und besonders bevorzugt eine t-Butylgruppe.
Es wurde nun gefunden, daß sich Verbindung (III) durch Reduktion der Verbindung (II) mit mäßiger bis hoher Selektivität und bei günstigen Temperaturen unter Verwendung einer üblicherweise in Spezies der Gattungen Beauveria, Pichia, Candida, Kluyveromyces und Torulaspora gefundenen Ketonreduktase darstellen lassen, wobei jedoch in jeder Gattung Ausnahmen auftreten können bzw. das Enzym möglicherweise von einem Enzym mit entgegengesetzter Stereospezifität begleitet wird.
In der vorliegenden Erfindung wird daher eine Verbindung der Formel (III) durch selektive Reduktion einer Verbindung der Formel (II)
unter Verwendung einer Reduktase, die die Eigenschaften von von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus Beauveria, vorzugsweise Beauveria bassiana, Pichia, vorzugsweise Pichia pastoris, haplophila oder membranefaciens, Candida, vorzugsweise Candida humicola, solani, diddenssiae oder friedrichii, Kluyveromyces, vorzugsweise Kluyveromyces drosophilarum oder Torulaspora, vorzugsweise Torulaspora hansenii und vorzugsweise Pichia angusta, produzierten Reduktasen besitzt, hergestellt.
In der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls eine Verbindung der Formel (III) durch selektive Reduktion einer Verbindung der Formel (II) unter Verwendung von ganzen Zellen von oder Extrakten aus den genannten Mikroorganismen, vorzugsweise Beauveria bassiana, Pichia pastoris, Pichia haplophila, Pichia membranefaciens, Candida humicola, Candida solani, Candida diddensiae, Candida friedrichii, Kluyveromyces drosophilarum, Torulaspora hansenii oder vorzugsweise Pichia angusta, hergestellt.
Die Erfindung wird vorzugsweise unter Verwendung ganzer Zellen des Organismus durchgeführt, da dadurch die Notwendigkeit zur Abtrennung des gewünschten Enzyms wegfällt und für die Reaktion benötigte Cofaktoren bereitgestellt werden.
Es läßt sich jede beliebige der obigen Spezies einsetzen; um hohe Umsätze sowie eine hohe Selektivität zu erzielen, ist jedoch die Verwendung des Enzyms oder ganzer Zellen von Pichia haplophila oder insbesondere von Pichia angusta bevorzugt.
Zur Durchführung der Reaktion werden im allgemeinen ein Cofaktor, normalerweise NAD(P)H (Nicotinamidadenindinukleotid bzw. Nicotinamidadenindinukleotidphosphat) und ein System zur Regenerierung des Cofaktors, z. B. Glucose und Glucose-Dehydrogenase, zusammen mit dem Enzym verwendet. Da geeignete Cofaktoren und Reduktionsmechanismen in den ganzen Zellen vorhanden sind, ist die Verwendung der ganzen Zellen in einem Nährmedium, das vorzugsweise eine geeignete Kohlenstoffquelle enthält, bevorzugt, wobei es sich bei der Kohlenstoffquelle unter anderem um eine oder mehrere der folgenden Verbindungen handeln kann: einen Zucker, z. B. Maltose, Saccharose oder vorzugsweise Glucose, einen Polyol, z. B. Glycerin oder Sorbit, Citronensäure, oder einen niedrigen Alkohol, z. B. Methanol oder Ethanol.
Falls die ganzen Zellen während der Reaktion wachsen sollen, sollten Stickstoff- und Phosphorquellen sowie Spurenelemente im Medium vorhanden sein. Dabei kann es sich um solche Verbindungen handeln, die typischerweise bei der Kultivierung des Organismus verwendet werden.
Das Verfahren läßt sich durchführen, indem eine Verbindung der Formel II zu einer Kultur des wachsenden Organismus in einem zur Wachstumsunterstützung fähigen Medium oder zu einer Suspension der Lebendzellen in einem Medium, das vorzugsweise eine Kohlenstoffquelle enthält, dem jedoch ein oder mehrere für das Wachstum notwendige Nährstoffe fehlen, gegeben wird. Tote Zellen lassen sich ebenfalls verwenden, vorausgesetzt, daß die notwendigen Enzyme und Cofaktoren vorhanden sind; diese können erforderlichenenfalls den toten Zellen zugegeben werden.
Falls gewünscht, können die Zellen auf einem Träger immobilisiert werden, der mit der Verbindung der Formel II vorzugsweise in Gegenwart einer wie oben beschriebenen, geeigneten Kohlenstoffquelle in Kontakt gebracht wird.
Der pH-Wert liegt geeigneterweise bei 3,5 bis 9, beispielsweise 4 bis 9, vorzugsweise bei höchstens 6,5 und insbesondere bei höchstens 5,5. Ganz besonders geeignet ist ein pH-Wert von 4 bis 5. Das Verfahren läßt sich geeigneterweise bei einer Temperatur von 10 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C und insbesondere 25 bis 35°C durchführen. Es wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen gearbeitet, wenn lebende, ganze Zellen der obengenannten Organismen vorhanden sind. Geeigneterweise wird eine Belüftungsrate, die 0,01 bis 1,0 Volumen Sauerstoff, gemessen bei Standardtemperatur und -druck, pro Volumen Kulturmedium pro Minute entspricht, unter den vorgenannten pH- und Temperaturbedingungen eingesetzt, doch versteht es sich, daß hierbei erhebliche Variationsmöglichkeiten bestehen. Der Sauerstoff läßt sich in Form von Luft zuführen. Während der Anzucht des Organismus können ähnliche pH-, Temperatur- und Belüftungsbedingungen verwendet werden, falls diese getrennt von dem Verfahren durchgeführt wird.
Gereinigte Enzyme lassen sich mittels bekannter Techniken isolieren, indem geeigneterweise eine Suspension aus aufgebrochenen Zellen zentrifugiert und eine klare Lösung von den Zelltrümmern abgetrennt wird und das gewünschte Enzym aus der Lösung beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, wobei geeigneterweise mit Flüssigkeit mit zunehmender Ionenstärke von der Säule eluiert wird, und/oder durch selektive Präzipitation durch Zugabe eines ionischen Materials, beispielsweise Ammoniumsulfat, abgetrennt wird. Solche Arbeitsvorgänge können gewünschtenfalls zur Verbesserung der Reinheit wiederholt werden.
BEISPIEL 1 Darstellung der Verbindung der Formel (III).
Die Mikroorganismen wurden auf YM (Oxoid Company)-Agarplatten gehalten, die durch Auflösen von 41 g „Yeast and Mold"-Agar in 1 1 destilliertem Wasser und Sterilisieren in einem Autoklaven hergestellt wurden.
Für das Wachstum in Flüssigmedium wurde eine Impföse Mikrobenzellen aseptisch von einer Agarplatte in einen 1-1-Kolben mit Schikanen übertragen, der 200 ml eines Mineralsalzmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt (Angaben pro Liter): K₂HPO₄ (1,9 g) , NaH₂PO₄·2H₂O (2,02 g) , (NH₄)₂SO₄ (1,8 g) , MgSO₄ 7H₂O (0,2 g) , FeCl₃ (0,97 mg) und Spurenelementlösung (1 ml). Die Spurenelementlösung bestand aus CuSO₄· 5H₂O (0,02 g) , MnSO₄. 4H₂O (0,1 g) , ZnSO₄·7H₂O (0,1 g) und CaCO₃ (1,8 g) (Angaben pro Liter). Das Minimalmedium wurde mit 0,2% (w/v) Hefeextrakt und 2,25% (w/v) Glucose supplementiert.
Die Mikroorganismen wurden bei 28°C auf einem Rundschüttler bei 150 UpM 24-48 Stunden angezogen.
Die Mikrobenzellen wurden durch 20minütige Zentrifugation bei 7000 UpM und 10°C geerntet. Das Zellpellet wurde in 100 ml 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,4 resuspendiert und die Zellen durch Zentrifugation wie oben gewaschen. Das Zellpellet wurde schließlich in 50 ml des obigen Puffers resuspendiert.
Zu den 50 ml Zellsuspension wurde in einem 250-ml-Kolben mit Schikanen Glucose (10 g pro Liter) und die Verbindung der Formel II (2 g pro Liter) gegeben. Die Zellen wurden bei 28°C auf einem Rotationsschüttler bei 150 UpM 18-24 Stunden inkubiert.
Die gesamte Reaktionsbrühe wurde mit 2 x 1 Volumen Essigester extrahiert. Dabei bildete sich in vielen Fällen eine Emulsion, die durch 5minütige Zentrifugation bei 10.000 UpM und 28°C getrennt wurde. Die vereinigten Essigesterextrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde mittels Vakuumdestillation unter Erhalt eines goldenen Öls entfernt.

Das Ausmaß der Umsetzung der Verbindung der Formel II zur Verbindung der Formel III sowie die enantiomere Zusammensetzung der Verbindung der Formel III wurde durch HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) bestimmt. Die Bedingungen für die HPLC sind im folgenden beschrieben:

HPLC:	Waters 590 programmierbare Pumpe
Säule:	„Chiracel" OJ (250 mm ×4,6 mm) (Chiracel ist ein Handelsname der Firma Diacel Chemical Industries Ltd) mit einer Vorsäule von 50 mm × 4,6 mm mit einer Partikelgröße von 10 μm
Lösungsmittel:	Hexan; Ethanol (95:5)
Fließgeschwindigkeit:	1 ml min^-1
Temperatur:	Umgebungstemperatur
Nachweis:	Brechungsindex Waters Differentialrefraktometer R401

Die Retentionszeiten der Verbindungen der Formel II, III und des Diastereoisomers von III, IV betrugen 43 Minuten, 27 Minuten bzw. 21 Minuten.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
TABELLE 1
BEISPIEL 2
Darstellung der Verbindung IV, des Diastereoisomers der Verbindung der Formel III
Die Mikroorganismen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gehalten und angezogen. Die Biotransformation und die Analyse wurden ebenfalls genau wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. TABELLE 2
Aus den obigen Ergebnissen läßt sich ersehen, daß jeweils bestimmte Mitglieder der Gattungen Candida und Pichia beide Diastereoisomere produzieren. Die Spezifität von beispielsweise Pichia angusta auf der einen und Hansenula anomola auf der andere Seite für unterschiedliche Diastereoisomere deutet auf die Existenz von zwei Enzymen entgegengesetzter Stereospezifität, wobei in einigen Spezies beide Enzyme und/oder ein weiteres Enzym mit geringerer Stereospezifität vorhanden sein können.
BEISPIEL 3
Anzucht von Pichia angusta NCYC R320 in Fermentern und in-situ-Darstellung der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl)
Pichia angusta NCYC R320 wurde sowohl in diskontinuierlicher (Batch) und semikontinuierlicher (Fed-Batch) Kultur in einem 5–1 Braun Biostat ED/ER5-Fermenter angezogen.
Die Anzucht in Batch-Kultur wurde in 5 1 Medium mit der folgenden Zusammensetzung durchgeführt (Angaben pro Liter) : Glucose, 40 g; MgSO₄ 7H₂O, 1, 2 g; K₂SO₄, 0,21 g; KH₂PO₉, 0,69 g; H₃PO₄ (17M) , 1 ml; Hefe-Autolysat, 2 g; FeSO₄ 7H₂0, 0,05 g; Polypropylenglykol-Antischaummittel, 0,3 ml; Spurenelementlösung, 2 ml. Die Spurenelementlösung bestand aus ZnSO₄ 7H₂O, 10 g; MnSO₄ 4H₂O, 10 g; CuSO₄ 5H₂O, 1 g und H₃PO₄ (11, 6M) , 1 ml (Angaben pro Liter). Das Medium wurde mit Leitungswasser hergestellt, und die Einstellung und Kontrolle des gewünschten pH-Werts erfolgte durch Zugabe von 7M NH₄OH.
Die Anzucht in Fed-Batch-Kultur wurde wie für die Batch-Kultur beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß, nachdem die Glucosekonzentration auf <10 g/l abgefallen war, 1 1 der Fermentationsbrühe aseptisch entfernt und 1 1 Medium, das sich aus Glucose, 240 g; Hefe-Autolysat, 7 g; FeSO₄ 7H₂0, 0,175 g, Polypropylenglykol-Antischaummittel, 1 ml und Spurenelementlösung, 7 ml (Angaben pro Liter) zusammensetzte, mit einer solchen Rate zugeführt wurde, daß die Glucosekonzentration im Bereich von 2 bis 5 g/l gehalten werden konnte.
Sowohl als Batch- als auch als Fed-Batch-Kultur durchgeführte Fermentationen wurden durch Zugabe einer Animpfkultur von Pichia angusta NCYC R320 gestartet. Die Animpfkultur wurde in 200 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Mineralsalzmediums angesetzt und bei 28°C auf einem Rundschüttler bei 150 UpM 18-20 Stunden angezogen. Vor dem Animpfen des Fermenters wurde die Animpfkultur in sterilem Medium derselben Zusammensetzung 10fach verdünnt.
Die Fermentationen wurden unter den folgenden pH-, Temperatur-, Belüftungs- und Rührbedingungen durchgeführt, bis ein Zelltrockengewicht im Bereich von 10 bis 15 g/l erreicht wurde:
Temperatur: 28, 34, 40°C
pH-Wert: 4,5, 5,5, 6,5
Belüftung: 0,1, 1,0 vvm (Volumen Luft pro Volumen Medium pro Minute)
Rühren: 600 UpM
Die Herstellung der Verbindung der Formel (III) (R= t-Butyl) wurde durch Zugabe der Verbindung der Formel II (R=t-Butyl) als ungereinigtes Öl mit einer Konzentration von ungefähr 65% w/w, wobei der Rest im wesentlichen aus t-Butyl-Acetoacetat bestand, gestartet. Die Verbindung der Formel (II) (R=t-Butyl) wurde in kontinuierlicher Weise mit einer Rate, bei der eine Konzentration der Verbindung von typischerweise 1 bis 5 g/l, vorzugsweise 2 g/l, aufrechterhalten werden kann, zugegeben. Als Cosubstrat wurde der Fermentationsbrühe Glucose in fester Form zugegeben, wobei eine Konzentration von 1 bis 5 g/l aufrechterhalten wurde. In allen Experimenten wurde die Herstellung der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl) unter denselben Bedingungen bezüglich Temperatur, pH-Wert, Belüftung und Rühren wie für die Anzuchtsphase des Mikroorganismus durchgeführt.

Die Konzentration der Verbindungen der Formel (II) (R=t-Butyl) und (III) (R=t-Butyl) in der Fermentationsbrühe wurden durch Reverse-Phase-HPLC gemessen. Die Bedingungen für die HPLC sind im folgenden beschrieben:

HPLC:	Hewlett Packard HP 1050
Säule:	Waters Nova-Pak^R C18-Säule, Abmessung: 3,9 × 300 mm, Partikelgröße: 4 μm. Nova-Pak ist ein geschützter Handelsname der Millipore Corporation.
Lösungsmittel:	0,02M Phosphorsäure inWasser:Acetonitril (60:40)
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Detektor:	Hewlett Packard HP 1047A
	Brechungsindexdetektor
Temperatur:	Umgebungstemperatur

Die Retentionszeiten der Verbindungen der Formel (II) (R=t-Butyl) und (III) (R=t-Butyl) betrugen 4,0 Minuten bzw. 3, 1 Minuten.
Nach Beendigung der Bioreduktionsphase wurde die Fermentationsbrühe 20 Minuten bei 5000 UpM und 20–22°C zentrifugiert. Die Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl) wurde aus dem Überstand durch Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie z. B. Toluol, Isoamylacetat, 2-Pentanon, Essigester oder 4-Methyl-2-pentanon, vorzugsweise Essigester oder 2-Pentanon, isoliert. Der Lösungsmittelextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel mittels Vakuumdestillation unter Erhalt des Rohprodukts der Formel III (R=t-Butyl) als goldfarbenes Öl entfernt.

Das Verhältnis der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl) zu seinem Diastereoisomer (IV) (R=t-Butyl) wurde entweder durch HPLC des Rohprodukts nach der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise oder durch HPLC-Messung des Verhältnisses der entsprechenden Isopropylidenderivate (I) und seines Diastereoisomers (V)

unter den folgenden Bedingungen gemessen:

HPLC:	Hewlett Packard HP 1050
Säule:	YMC ODS AQ303, Abmessung: 4,6 × 250 mm, Partikelgröße: 5 μm. Erhältlich von HichromLimited.
Lösungsmittel:	Methanol:Wasser (50:50)
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Detektor:	Hewlett Packard HP 1047A
	Brechungsindexdetektor
Temperatur:	Umgebungstemperatur

Die Retentionszeiten der Verbindungen der Formel (I) und (V) betrugen 31,0 Minuten bzw. 35,5 Minuten.
BEISPIEL 4
Herstellung des Isopropylidenderivats (I) und seines Diastereoisomers (V)
Proben der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl), (IV) (R=t-Butyl) und des Rohprodukts aus der Bioreduktion der Verbindung der Formel (II) (R=t-Butyl) wurden zu dem entsprechenden Isopropylidenderivat durch Umsetzung mit 2,2-Dimethoxypropan in trockenem Aceton in Gegenwart einer katalytischen Menge Methansulfonsäure umgesetzt. In einer typischen Reaktion wurden 3 g des rohen Bioreduktionsprodukts mit 2,2-Dimethoxypropan (7 ml) in trockenem Aceton (5 ml), das Methansulfonsäure (5 μl) enthielt, 2 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Lösung wurde dann in 15 ml 2% w/v wäßriges Natriumhydrogencarbonat gegossen und weitere 5 Minuten gerührt. Das entstandene Gemisch wurde mit 30 ml Essigester extrahiert. Der Essigesterextrakt wurde abgetrennt, mit 15 ml n-Hexan vereinigt und der vereinigte organische Extrakt mit 30 ml destilliertem Wasser abgewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel mittels Vakuumdestillation unter Erhalt eines tief orangefarbenen Öls, das sich beim Abkühlen verfestigte, entfernt.
BEISPIEL 5–13
Darstellung der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl) unter verschiedenen pH-, Temperatur- und Belüftungsbedingungen bzw. Fermentationsansätzen
Die Beispiele 5–13 dienen der Erläuterung der Durchführung des Verfahrens unter Verwendung von Pichia angusta NCYC R320 mit jeweils einem Start-Zelltrockengewicht im Bereich von 10 bis 15 g/l zur Herstellung der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl) aus der Verbindung der Formel (II) (R=t-Butyl). Das Verfahren wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, außer wenn in Tabelle 3 anders angegeben.
Die Ergebnisse der Durchführung des Verfahrens unter den in Tabelle 3 aufgeführten Bedingungen sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Der bei der Durchführung des Verfahrens unter den in Beispiel 13 aufgeführten Bedingungen erhaltene Reaktionsverlauf ist in 1 gezeigt. In diesem Fall betrug das Start-Zelltrockengewicht 12,67 g/l.
TABELLE 3

VVM bedeutet Volumen Luft (gemessen bei Standardtemperatur und -druck) pro Volumen Kulturmedium pro Minute.
BEISPIEL 14
Charakterisierung der Verbindung der Formel (III) (R=t-Butyl )
Das bei dem wie in Beispiel 5 durchgeführten Verfahren erhaltene Rohprodukt (III) (R=t-Butyl) wurde zu seinem Isopropylidenderivat (I) gemäß der im folgenden beschriebenen Vorgehensweise umgesetzt:
Das Rohprodukt (145 g, mit 65 g III, 0,28 mol) wurde in einem 1-1-Rundkolben mit Magnetrührer gegeben. Danach wurde trockenes Aceton (200 ml), 2,2-Dimethoxypropan (294 ml, 2,39 mol) und Methansulfonsäure (1,5 ml) in den Kolben gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde überprüft, indem eine kleine Probenmenge auf ein Stückchen feuchtes pH-Indikatorpapier aufgetragen wurde, um sicherzustellen, daß er sich im sauren Bereich befand. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur gerührt und das Verschwinden von (III) mit HPLC unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls verfolgt. Die Reaktion war nach 3 Stunden beendet, wonach 550 ml 2% w/v wäßriges Natriumhydrogencarbonat zugegeben wurden. Der pH-Wert wurde wiederum wie oben überprüft, um sicherzustellen, daß er sich im Bereich 7-9 befand. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 400 ml Essigester extrahiert. Der Essigester wurde entfernt und die wäßrige mit weiteren 200 ml Essigester nochmals extrahiert. Die Essigesterextrakte wurden vereinigt und 1 1 n-Hexan zugegeben. Die vereinigte Essigester- und Hexanlösung wurde mit 3 x 1 1 destilliertem Wasser gewaschen und die organische Phase abgetrennt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde mittels Vakuumdestillation unter Erhalt eines roten Öls, das sich beim Abkühlen verfestigte, entfernt.
Das Isopropyliden (I) wurde aus n-Hexan kristallisiert und aus n-Heptan unter Erhalt eines weißen kristallinen Produkts mit 81% Ausbeute umkristallisiert. Es wurde gefunden, daß das Isopropyliden (I) eine chemische Reinheit von 98,65 besaß, frei von den Verbindungen (II), (III) und (V) (R=t-Butyl) war und sich weder durch Infrarotspektroskopie noch ¹H-NMR-Spektroskopie bei 250 MHz von einer authentischen Probe von (I) unterscheiden ließ.
Quellenangaben:

ATCC	American Type Culture Collection, 123031Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA.
CBS	Centraal Bureau Voor Schimmel Cultures, Oosterstraat 1, Postbus 273, NL-3740 AG Baarn,Niederlande.
DSM	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-330Braunschweig, Deutschland.
NCYC	National Collection of Yeast Cultures Instituteof Food Research, Norwich Laboratory, NorwichResearch Park, Colney, Norwich NR4 7UA
BPCC	ZENECA Limited, Bioproducts Culture Collection(Nicht öffentlich erhältlich)

Claims

Verfahren, bei dem eine Verbindung der Formel (III)
durch selektive Reduktion einer Verbindung der Formel (II)
worin R für eine Alkylgruppe steht, wobei eine aus Beauveria, Candida, Kluyveromyces, Torulaspora oder Pichia erhältliche Reduktase verwendet wird, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eine Verbindung der Formel (III) durch selektive Reduktion einer Verbindung der Formel (II), wobei eine aus Beauveria bassiana, Pichia pastoris, Pichia haplophila, Pichia membranefaciens, Candida humicola, Candida solani, Candida diddensiae, Candida friedrichii, Kluyveromyces drosophilarum, Torulaspora hansenii oder Pichia angusta erhältliche Reduktase verwendet wird, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Reduktase durch die Anwesenheit ganzer Zellen von Beauveria, Candida, Kluyveromyces, Torulaspora oder Pichia während der selektiven Reduktion bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem es sich bei der Reduktase um eine von Pichia produzierte Reduktase handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem es sich bei der Reduktase um die von Pichia haplophila oder Pichia angusta produzierte Reduktase handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das in Anwesenheit ganzer Zellen eines Organismus, der die Reduktase in einem eine Kohlenstoffquelle für den Organismus enthaltenden Nährmedium produziert, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem Stickstoff- und Phosphorquellen sowie Spurenelemente zugegen sind.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, das unter aeroben Bedingungen durchgeführt wird.
Verfahren, bei dem eine Verbindung der Formel
worin R für eine Alkylgruppe steht, durch selektive Reduktion einer Verbindung der Formel II, wie in Anspruch 1 gezeigt, wobei eine aus Candida pelliculosa, Neurospora crassa, Pichia trehalophila oder vorzugsweise Hansenula anomola erhältliche Reduktase verwendet wird, hergestellt wird.