DE2115514A1 - Verfahren zur Herstellung von Citronensäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von CitronensäureInfo
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Description
KQLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 25.3.1971
Kl/Ax/Hz
27j Doshomachi 2-chome» Higashi-ku, Osaka (Japan).
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Citronensäure, für die ein größer Bedarf besteilt, und die
beispielsweise als Säueiningsraittel in Getränken und in
pharmazeutischen Zubereitungen verwendet wird·
Bö ist bekannt, daß gewisse Hefen während der Kultivierung
Citronensäure und C+)-ISöcitronenöäurö anreichern, Jedoch
sind die Ausbeuten an diesen Säuren, bezögen auf die ver*-
brauchten Kohlenstoffquellen, nicht unbedingt zufriedenstellend* Da ferner gleichzeitig C+^Isöcitrönensäure gebildet wird, tritis eine entsprechende wesentliche Verschlechterung der Ausbeute an Citronensäure ein.
ferner erfordert die Kötwendigkeit der Abtrennung der
Citronensäure von der C+)-Isoeitrönensäure eine zusätzliche Arbeitsstufe, die eine weitere Senkung der Ausbeute
an Citronensäure mit sich bringt» Das vorstehend beschrie-bene
Verfahren ist' somit mm wirtschaftlichen und technischen
Standpunkt unbefriedigend für die Herstellung von
Citronensäure·
Die Bemühungen der Anmelderin, den Nachteil des oben genannten
Verfahrens auszuschalten, führten zur Isolierung einer großen Zahl von Mikroorganismen, die einzigartige
metabolische Eigenschaften aufweisen. Während dieser Untersuchungen
wurde gefunden, daß sich unter den hierbei isolierten
Mikroorganismen einige befinden, die eine erheblich größere Fähigkeit zur Anreicherung von Citronensäure
bei gleichzeitiger geringerer Fähigkeit zur Anreicherung von (+)-Isocitronensäure haben, und daß das Wachstum dieser
Mikroorganismen durch einen Gitronensäure-Antimetaboliten oder seine Vorstufe gehemmt wird. Diese Feststellungen
liegen der Erfindung zugrunde·
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur
Herstellung von Citronensäure, das dadurch gekennzeichnet
is;t, daß man Hefen, Kleinpilze oder Bakterien, deren
Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder
dessen Vorstufe gehemmt wird, und die Citronensäure in erheblicher Menge in einem Kulturmedium anzuhäufen vermögen,
kultiviert und die hierbei angehäufte Citronensäure aus dem Medium isoliert.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung
von Citronensäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
man ein Medium, das einen Citronensäure-Antimetaboliten
oder dessen Vorstufe enthält, und ein Medium, das diesen
Antimetaboliten oder seine Vorstufe nicht enthält, mit
einer Hefe, einem Kleinpilz oder ein Bakterium impft, einen
Stamm auswählt, dessen Wachstum durch das erstgenannte
Medium gehemmt wird, der aber auf dem letztgenannten Medium
gut wächst, diesen ausgewählten Stamm in einem Medium zur
Anhäufung von Citronensäure im Medium kultiviert und die
auf diese; Weise angehäuifte Citronensäure aus dem Medium
Die vorstehend genannte "Hemmung des Wachstums" hängt von
verschiedenen Emtturfaktoren des jeweils verwendeten
Stammes,; von der Zusammensetzung und Konzentration des
Mediums usw» ab. Im Rahmen der Erfindung hat jedoch dieser
Ausdruck die folgende Bedeutung:
1) Im Falle eines Stammes eines Mikroorganismus, dessen
Wachstum von Natur aus durch einen Citronensäure-Antimetaboliten oder seine Vorstufe gehemmt wird, bezeichnet
der Ausdruck den Fall, in. dem die Wachstums geschwindigkeit
dieses Stammes in Gegenwart von wenigstens 1 mMol
dieser Substanz in einem statistisch bedeutenden Ausmaß unterdrückt und in Abwesenheit der gleichen Substanz
auf nicht mehr als 75% unterdrückt wird.
2) Im Falle eines Mutanten-Stamms des Mikroorganismus, der von einem Ursprungsstamm erhalten worden ist, der
von Hatur aus verhältnismäßig resistent gegenüber einem
Citronensäure-Antimetaboliten oder seiner Vorstufe ist,
jedoch durch Mutation eine Empfindlichkeit gegenüber dieser Substanz erworben hat, ist unter dem Ausdruck
die Situation zu verstehen, in der die Wachs turns geschwindigkeit
des Mutanten in einem statistisch bedeutsamen Ausmaß unterdrückt und bei der höchsten Konzentration
dieser Substanz, die das Wachstum des Ursprungsstamms nicht hemmt, auf praktisch nicht mehr als 75£6
der Wachstumsgeschwindigkeit des Ursprungsstamms unterdrückt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat zahlreiche Vorteile
gegenüber den bisher bekannten Verfahren. Erstens wird
beim Verfahren gemäß der Erfindung eine bei weitem höhere
Ausbeute erzielt. Da zweitens (>)-Isocitronensäure nicht
oder nur in einer Spurenmenge als Hebenprodukt gebildet wird, wird die Reinigung der Citronensäure vereinfacht.
Dies hat zur Folge, daß nicht nur die Ausbeute der Reinigung, sondern auch die Qualität des Endprodukts gesteigert
wird.
Die Erfxndung ermöglicht somit die Herstellung von Citronensäure
in guter Ausbeute. Sie macht ferner ein Verfahren
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1 til
zur Auswahl eines zur Bildung von Citronensäure in hoher
Ausbeute fähigen Mikroorganismus verfügbar und erleichtert die Reinigung der gewünschten Citronensäure.
Wie bereits erwähnt, werden für das Verfahren gemäß der
Erfindung beliebige Hefen, Kleinpilze und Bakterien verwendet, deren Wachstum durch einen Citronensäure-Antinietaboliten
oder seine Vorstufe gehemmt wird, und die unabhängig davon, ob sie aus natürlichen Quellen isoliert
oder durch künstliche Mutation erzeugt worden sind, die Fähigkeit haben, außerhalb der Zellen eine bedeutende Menge
Citronensäure anzuhäufen.
Geeignet sind beispielsweise Hefen der Gattungen Candida,
Trichosporon, Pichia, Debarymömyces, Hansenula, Torulopsis,
Endömycopsis, Saccharomyces, Kloeckera usw. Geeignete
Bakterien sind beispielsweise solche der Gattungen Brevibacterium, Escherichia, Corynebacterium, Ar throb ac ter,
Alkaligenes, Achromobacter, Mierococcus usw. Als Kleinpilze
können Stämme der Gattungen Aspergillus, PeniciIlium,
Mucor u.dergl. verwendet werden.
Als Beispiele von Spezies dieser Gattungen seien genannt: Hefespezies: Candida rugosa, Candida lipolytica, Candida
ehaimersii, Candida tropiealis, Candida guilliermondii, Candida parapBilosis, Candida albicans, Trichosporon
behrendii, Pichia farinosa, Pichia halophila, Debaryoiayces
hansenii, Debaryomyces kloeckeri, Hansenula sübpelliculosa,
Hansenula miso, Hansenula saturnus, Torulopsis famata, Torulopsis Candida, Saecharomyces acidifaciens, Saccharomyces
cerevisiäe, Saccharomyces willianus, Kloeckera apiculata.
Bakterienspezies: Brevibacterium thiogenitalis, Brevibacterium ammbniagenes, Brevibacterium flavum, Brevibacterium
debaricatum, Mierococcus glutamicus, Micrococcus
ammoniaphilum, Corynebacterium facians, Corynebacterium
hydrocarboclustus, Arthrobacter-Spezies, Achromobacter
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nucleoacidives, Alkaligenes martiarie*
Kleinpilz-Spezies: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Aspergillus saitoi, Aspergillus glaucus, Penicillium
elegans, Penicillium. citrinum und Mucor pyriformis.
Als Citronensäure-Antimetaboliten und ihre Vorstufen eignen sich für die Zwecke der Erfindung bexspielsweise
halogenierte niedere Alkylcarbonsäuren, die entsprechenden Ketocarbonsäuren und ihre Salze, Ester und wasserlöslichen
Amide. Speziell geeignet sind beispielsweise Halogencitronensäure, z.B. Monofluorcitronensäure, Monochlorcitronensäure
und ihre Salze, Amide und Ester.
Als Vorstufen dieser Antimetaboliten eignen sich beispielsweise
Halogenessigsäuren, z.B. Monofluoressigsäure, Monochloressigsäure, Halogenbrenztraubensäure, z.B. Monochlorbrenztraubensäure,
Halogenoxalessigsäure, z.B. Fluoroxalessigsäure, Halogenbernsteinsäure, z.B. Monofluorbernsteinsäure,
oder ihre Salze, Amide, Ester, z.B. Monofluoracetamid, und Monofluoracetylcoenzym A.
Zur Isolierung oder Auswahl eines geeigneten Mikroorganismus
aus natürlichen Quellen oder aus den künstlich erzeugten Mutanten wird vorzugsweise wie folgt verfahren:
Ein Kulturmedium, dem ein Citronensäure-Antimetabolit oder dessen Vorstufe zugesetzt worden ist,-und ein Kulturmedium,
das keinen Antimetaboliten oder seine Vorstufe enthält, werden mit einem Mikroorganismus geimpft. Gewählt
wird ein Mikroorganismus, dessen Wachstum auf dem erstgenannten Medium gehemmt wird, der aber auf dem letztgenannten
Medium gut wächst.
Zur Gewinnung eines Mikroorganismus mit solchen Eigenschaften
durch induzierte Mutation kann vorteilhaft eine Behandlung iait energiereicher Strahlung, z.B. Ultraviolett-
60
strahlung, Co -Strahlung, Röntgenstrahlung usw. oder eine Behandlung mit einem geeigneten chemischen Mutagen, z.B.
strahlung, Co -Strahlung, Röntgenstrahlung usw. oder eine Behandlung mit einem geeigneten chemischen Mutagen, z.B.
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Natriumnitrit, Hydroxylamin, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin,
Acriflavin, 8-Azaguanin oder Stickstofflost
angewandt werden. Unter den hierbei erhaltenen Mikro- ·
Organismen können sich Stämme befinden, die gleichzeitig
gewisse physiologische oder morphologische Mutationen
erfahren haben, z.B. den Erwerb der Eigenschaft, daß sie
Vitamine, Aminosäuren, Nucleinsäuren usw. zum Wachstum
benötigen, und fehlende Respiration, jedoch können auch diese Stämme für die Zwecke der Erfindung verwendet werden, soweit ihr Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten
oder seine Vorstufe gehemmt wird und sie gleichzeitig die Fähigkeit haben, Citronensäure anzuhäufen.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Mikroorganismus
mit den vorstehend genannten Eigenschaften auf einem
Kulturmedium gezüchtet. Im allgemeinen wird ein wässriges Medium verwendet, das entweder nach der stationären Kulturmethode oder nach der Schüttelkultürmethode bebrütet wird.
Bevorzugt wird im allgemeinen die Submerskultur mit Belüftung
und Bewegung. Dem Medium werden Kohlenstoff quellen, Stickstoffquellen und andere geringere Wachstumselemente
zugesetzt.
Geeignet sind alle Kohlenstoffquellen, die vom jeweils
verwendeten Mikroorganismus assimilierbar sind, z.B.
Glucose, Glycerin und organische Säuren, jedoch sind Kohlenwasserstoff e vom technischen und wirtschaftlichen Standpunkt
am vorteilhaftesten. Als Kohlenwasserstoffe können beispielsweise n-Alkane mit 10 bis 20 C-Atomen allein oder
in Kombination und Materialien, die solche Kohlenwasserstoffe
enthalten, verwendet werden.
Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise organische
und anorganische Stoffe, z.B. viele Ammoniumsalze, Nitrate, AminostickfliiOfiverb indungen sowie eine Anzahl von natürlichen Substanzen wie Trockenhefe, Fleischextrakt, Soja—
bohnenraehl, Fischmehl, Maisquellwasser und Brennereirückstände. Außer diesen Nährstoffen können anorganische und
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organische Metallsalze, z.B. die Salze von Eisen, Magnesium,
Calcium und Mangan, dem Medium nach Bedarf zugesetzt werden. Wenn der verwendete Mutant einen bestimmten Nährstoff
zum Wachstum benötigt, kann eine geeignete Menge des jeweiligen Nährstoffs dem Medium zugesetzt werden.
Der Mikroorganismus wird auf einem solchen Medium bei einem
Pjj-Wert von 2 bis 8, zweckmäßig zwischen 4 und 7» und· bei.
einer Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise zwischen
25 und 3Ö°G kultiviert. Während der Kultivierung kann es
zweckmäßig sein, nach Bedarf ein Antischaummittel, das die Fermentation nicht hemmt, z.B. ein Siliconöl, Polyoxypropylenderivate,
Sojabohnenöl u.dergl., zuzusetzen. Auf diese Weise wird eine erhebliche Citronensäuremenge in
der Gärmaische angehäuft.
Diese Gärmaische ist frei von Isocitronensäure und anderen
Nebenprodukten oder enthält davon nur Spurenmengen. Daher kann die Citronensäure in Kristallform nach üblichen Verfahren
der Isolierung von Citronensäure, die allein oder in geeigneter Kombination angewandt werden, isoliert
werden.
Die z.Z. bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden
in den folgenden Beispielen erläutert. In diesen Beispielen sind die Prozentsätze auf Gewicht/Volumen bezogen,
und die Ausbeuten sind in Gewichtseinheiten der gebildeten Citronensäure pro Gewichtseinheit der verbrauchten Kohlenstoff
quellen berechnet.
In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen
wie Gramm zu Kubikzentimeter.
Die IFO-Nummern nach den in den Beispielen gebrauchten
Bezeichnungen der Mikroorganismen sind die jeweiligen Hinterlegungsnummern beim Institute for Fermentation,
Osaka, Japan.
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_·8_ 211SSH
1) Auswahl von Mikroorganismen
Eine Schrägkultur von Candida lipolytica IPO 14-37 auf
einem Malzagar-Medium wird in steriler physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Zahl lebensfähiger Zellen von
etwa 10' bis 10 /ml suspendiert. 10 ml der Suspension werden in einer Petrischale ausgebreitet und mit Ultraviolettstrahlung
bestrahlt. 0,25 ml der bestrahlten Sus- .
pension v/erden auf ein Malzagar-Medium überführt, das
dann etwa 30 Stünden bei 280C bebrütet wird. Dieses Impfmaterial
wird dann nach der Plattenabdruckmethode (replica plate method) auf ein Medium (A), das aus 0,5% Natriumacetat,
0,1% KH2PO4, 0,1% NH4HO5, 0,1% ITH4Cl, 0,05%
MgSO4.7H2O, 0,1 mg Thiamin/1 und 2,2% Agar besteht, und
auf ein ähnliches Medium (B), das aus den Bestandteilen des Mediums (A) plus 0,1% Natriummonofluoracetat besteht,
übertragen'. Die beiden Medien werden 48 Stunden bei 28°C
bebrütet. Aus den Kolonien, die auf dem Medium (A) wachsen, aber ,auf dem Medium (B) nicht erscheinen, wird ein Mutantenstamm
F-12 (IFO 1545) gewonnen.
2) Herstellung von Citronensäure
Der Ursprungsstamm und der Mutant werden dann jeweils
zur Beimpfung von Fermentern verwendet, die je 120 Raumteile
eines wässrigen Mediums enthalten, das aus 6% n-Hexadecan, 0,01% KH2PO4, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,1% Trockenhefe
und 0,3% (NH4)2S04 und 5% zugesetztem CaCO,, das getrennt
unter trockenen Bedingungen sterilisiert worden ist, besteht.
Die Mikroorganismen werden 6 Sage bei 28°C bebrütet, wobei
Citronensäure gebildet wird. Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.
Citronensäure (+)—Isocitronensäure
Ursprungs stamm 4-2 mg/ml 3I mg/ml
Mutantenstamm . 78 mg/ml 2,5 mg/ml
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Zu je 100 Raumteilen der Kulturen dieser beiden Stämme
wird Ca(OH^ gegeben, bis ein p^-Werfr von 7»0 erreicht
ist· Die jeweiligen Gärmaischen werden dann 60 Minuten auf 8O0O erhitzt und im heißen Zustand zur Entfernung der
überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Die Sedimente werden mit Schwefelsäure gelöst. Das erhaltene Calciumsulfat
und die Hefezellen werden durch Zentrifugieren entfernt,
wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wird, die durch eine Säule von 5 Raumteilen des Ionenaustauscherharzes
"Amberlite IR-120(H+)" (Hersteller Rohm and Haas
Company) geleitet wird. Each Zusatz von 1 Gew.-Teil Aktivkohle wird der Ablauf filtriert* Das erhaltene Filtrat
wird unter vermindertem Druck eingeengt, wobei ein Produkt von Sirupkonsistenz erhalten wird, das über Nacht in einem
Kühlschrank stehengelassen wird.
Auf diese Weise werden 5 »4- Gew.-Teile Kristalle aus der
Kulturbrühe des Mutanten erhalten. Durch die gleiche Behandlung
der Mutterlauge werden weitere 1,2 Gev/.-Teile
Kristalle erhalten.
Dagegen werden aus der Kulturbrühe des Ursprungsstamms,
die in der gleichen Weise behandelt wird, praktisch keine
Kristalle gewonnen. Die Gärmaische wird durch tropfenweise zugesetztes 30%iges KOH auf p„ 3,5 eingestellt und über
Nacht in einem Kühlschrank stehengelassen. Die Fällung wird entfernt, worauf eine geringe Menge Impfkristalle
von Citronensäure der Mutterlauge zugesetzt wird, wobei 2,8 Gew.-% kristalline Citronensäure erhalten werden.
Debaryomyces sp. (IFO 0064) und Pichia halophila (IFO 0?A7) werden der in Beispiel 1 beschriebenen mutagenen Behandlung
unterworfen. Der erhaltene Mutant HF-79 (IFO 154-7)
des Ursprungsstamms Pichia halophila (IFO 0947) und der
Mutant DF-04 (IFO 1546) von Debaryomyces sp. (IFO 0064) werden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert.
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Die Ergebnisse sind nachstehend genannt·
Stamm Citronensäure <, mp;/inl
Piehia halophila (IFG Q94-7) 7
Bebaryomyces ap* (IFQ 0064·) ' ' 0,4-
Pichia halophila ΗΡ~79 (IFO 154?) " 4-8
Debaryomyces spö 'EF-(W- (IFO .1546) 36
Brettanomyees clauaenii- (IFO 0627) wird der in Beispiel 1
!beschriebenen mutagenen Behandlung unterworfen- Der erhaltene
Mutantenstamm ΒΚΓ-62 (IFO 15*4) hat eine erhöhte
Fähigkeit j. Citronensäure zu "bilden.
Die beiden Stäsme werden getrennt auf den in Beispiel 1.
beschriebenen Medien kultiviert, v/obei jedoch die Kohlenstoff
quelle durch 1Q% Glucose ersetzt worden ist. Hierbei
werden die folgenden Ergebnisse erhaltens
■ Gitronensäure, lag/ml
Ursprungsstamm IFO 0627 - 4-5
Mutantenstaam IFO 15^4 ■ 73
Eine Zellsuspension von Brevibacterium flavuia ITr. I5II
(ATCC 14-067) wird mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wobei
ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant BF 11 (IFO I5144-) erhalten wird. Dieser Mutant und dev Ursprungsstamm
werden getrennt auf dem in Beispiel 3 beschriebenen Medium kul ti viert« Während der Ursprungsstaom keine nachweisbare
Citronensäuremenge in der Gärmaische anhäuft, werden durch den Mutantenstamm 4-5 mg/ml Citronensäure angehäuft.
Achromobacter nuc 1 eo acido ve s ITr. 106 (IFO 13268) und
Oorynebacterium facians ITr. 803 (ATGC 214-61) werden mit
dem in Beispiel 1 verwendeten Mutägen behandelt, wobei
gegen Fluorcitronensäure empfindliche Stämme ITF-06
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(IFO 13145) und CF-03 (IFO 1314-5) erhalten werden. Diese
Stämme werden zur Beimpfung von Fermentern verwendet, die
120 Raumteile eines Mediums (pjr 7,0) enthalten, das 6%
η-Paraffin (Gemisch von C/^-^q)» °»5# HH4NO5, 0,2?£ KH2PO4,
0,0% MgSO4, 0,0173 FeSO^.7H2O, 0,1# Harnstoff, 0,1# Trokkenhefe
und Ψ/σ CaCO5 enthält und 5 Tage bei 28°C bebrütet
wird. Die folgenden Ergebnisse werden erhalten:
Ursprungsstämiae: Nr. 106 - 0,6 mg/ml
Nr. 803 4-3 mg/ml
Mutanten: NF-06 (IFO 1314-5) 72 mg/ml
CF-03 (IFO 1314-5) 61 mg/ml
Eine Suspension der Sporen von Penicillium chermisinum IFO-58OO wird auf die in·Beispiel 4- beschriebene Weise
behandelt, wobei ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher
Mutant PF-100 (IFO-9230) erhalten wird.
Mit dem Ursprungsstamm und dem Mutanten werden Fermenter beimpft, die 120 Raumteile eines wässrigen Llediums (pjj 7jO)
enthalten, das ΛΟβΌ n-Paraffin, 0,1% NH4NO5, 0,023Zo MgSO4,
0,03$ KH2PO4, 0,03% Ϊ^ΗΡ04.12Η20 und 4-% CaCO5 (pH 5,0)
enthält und 14 Tage bei 280C bebrütet wird. Auf diese Weise
werden ausgezeichnete Ergebnisse erhalten:
Ursprungsstamm 32 mg/ml
Mutant 77 mg/ml
Arthrobactor paraffineus ATCC 15591 wird in der gleichen
Weise behandelt, wobei Arthrobacter paraffineus Hr. AF-51
(IFO 13269), ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant, erhalten wird.
Der Ursprungsstamm und der Mutant werden getrennt 3 Tage
bei 28°G in 120 Raumteilen eines wässrigen Llediums (pTj 7*0)
bebrütet, das 4% n-Hexadecan, 0,1# Natriumacetat, 0,3/s
10 9 8 4 3/1223
21ISSU"
NH4NO3, 0,05% Harnstoff, 0,01% CSl, 0,05% MgSO4,
0,001% MnSO., 0,01% FeSO21^H9O, 0,05% KHoPO2,, 0,15%
K2HPO4 und 3% CaCO3 enthält. Der Mutant häuft 28 mg
und der Usprungsstamm 0,9 mg Citronensäure/ml an.
Candida lipolytiea IFO 1463 (ATCC 20237) wird mit N-Methyl N1-nitro-N-nitrosoguanidin
behandelt, wobei ein gegen Fluoressigsäure empfindlicher Mutant Nr. S-22 (IFO I566)
erhalten wird*
Der Ursprungsstamm und der Mutant werden getrennt 6 Tage
bei 280C auf die in Beispiel 7 beschriebene Weise kultiviert.
Die Ergebnisse sind nachstehend genannt.
Stamm Citronensäure Ausbeute
·* mg/ml %
Ursprungsstamm (IFO 1463) 87 145
Mutant (IFO 1566) 71 118,3
Im Vergleich zu den Ursprungs stammen wird das Wachstum
der gemäß den Beispielen 1 bis 8 verwendeten Mutantenstämme unter den folgenden Bedingungen untersucht:
1· Medium:
Grundzusammensetzung: 0,3% (NH4>2S04, 0,3% NH4NO3,
0,2% KH2PO4, 0,2% K2HPO4, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,0003%
FeSO4.7H2O, 0,0003% MnS04.4H20, 0,0001% CaCl2.2H20,
0,1% CSL, 0,05% Schmalzöl. "
Medium (I): Grundmedium + 1% Natriumacetat Medium (II): Grundmedium + 1% Glucose
Medium (III): Grundmedium + 0,2% Hefeextrakt
2. Citronensäure-Antimetaboliten oder Vorstufen:
30 mMol Fluoressigsäure oder Fluorcitronensäure werden
den Medien zugesetzt.
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3· Kultivierungsbedingungen: 48 Stunden bei 280O.
4· Bestimmung des Wachstums:
Ermittlung des Gewichts der trockenen Zellen.
5. Ergebnisse: ·
Mutant . Medium Verwendeter Wachstum
Antimetabolit . (%)* - oder Vorstufe**
Candida lipolytioa
F-12 (IFO 154-5) (I) PAA I3
Pichia halophila
HF-79 (U1O 1547) (II) FAA 21
Debaryomyces sp.
(IFO 15^6) (II) FAA 36
Brettanomyces clausenii
BN-62 (IFO 1544) (II) FAA 42
Brevibacterium flavum
BF-11 (IFO 13144) (I) FAA 1?
Arthrobacter
nucleoacideves HF-06 \
(IFO 13143) (III) FCA 32
Corynebacterium fäcians
CF-03 (IFO 13145) (HI) FCA 60
Penicillium chermisinum
PF-100 (IFO 923O) (I) FAA 63
Arthrobacter paraffineus
AF-Sl (IFO 13269) (I) FAA 41
Candida lipolytica
S-22 (IFO 1566) (I) FAA 12
* Berechnet auf Basis des Gewichts der Zellen des
unter den gleichen Bedingungen gezüchteten Ursprungsstamms·
♦* FAAi Fluoressigsäure
FCAi Fluorcitroiieösäure
FCAi Fluorcitroiieösäure
Claims (18)
1. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch
gekennzeichnet, daß man Hefen, Pilze oder Bakterien,
deren Wachstum durch einen Citronensäure-Antimetaboliten
oder dessen Vorstufe gehemmt wird, und die eine erhebliche Citronensäuremenge in einem Kulturmedium
anhäufen, kultiviert und die hierbei angehäufte Citronensäure
aus dem Medium isoliert.
2. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure, dadurch
gekennzeichnet, daß man ein Medium, das einen Citronensäure-Antimetaboliten
oder dessen Vorstufe enthält und ein Medium, das keinen Antimetäboliten oder eine
Vorstufe enthält, mit einer Hefe, einem Kleinpilz "*oder einem Bakterium impft, einen Stamm auswählt, dessen
Wachstum auf dem erstgenannten Medium gehemmt wird, der aber auf dem letztgenannten Medium gutes Wachstum
zeigt, diesen ausgewählten Stamm in einem Medium kultiviert
und die hierbei vom Mikroorganismus angehäufte Citronensäure aus dem Medium isoliertφ
3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Hefe die Gattungen Candida, Pichia,
Debaryomyces, Hansenula, Torulopsis, Endomycopsis,
Saccharomyees oder Kloeckera verwendet werden.
4· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Gattungen Brevibacterium,
Eseherichiar Gorynebacterium, Arthrobacter, Alkaligenes,
Achromobacter oder Micrococcus verwendet werden»
5. Verfahren nach Anspruch: 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet^
daß) Pilze der Gattungen Aspergillus, Penicillium
oder Mueor verwendet werden.;
211W14
6. Verfahren nacii Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Hefe Candida lipolytica (IFO 1545) verwendet
wird.
7· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Candida lipolytica (IFO 1566) ver- .
wendet wird.
8· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Hefe Pichia halophila (IFO 1547) verwendet
wird.
9· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Hefe Debaryomyces sp. (IFO 1546) verwendet
wird·
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Hefe Brettanomyces claussenii (IFO 1544)
verwendet wird.
verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Bakterium Brevibacteriuin flavum (IFO 13144)
verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Bakterium Achromobacter nucleoacidives
verwendet wird.
13· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Bakterium Corynebacterium facians
(IFO 13145) verwendet wird.
(IFO 13145) verwendet wird.
14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Bakterium Arthrobacter paraffineus
(IFO 13269) verwendet wird.
(IFO 13269) verwendet wird.
15· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als Pilz Penicillium chermisinum (IFO 9230)
verwendet wird.
verwendet wird.
1098 A3/1223
211S5T4
16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 1ß, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kultivierung bei einer Temperatur zwischen 20 und 350C durchgeführt wird.
17· Verfahren nach Anspruch 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH-V/ert zwischen
2 und 8 durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1 bis 17» dadurch gekennzeichnet,
daß als Citronensäure-Antimetabolit eine Halogencitronensäure
verwendet wird.
19· Verfahren nach Anspruch 1 bis 17» dadurch gekennzeichnet,
daß als Vorstufe, des Citronensäure-Antimetaboliten eine Halogenessigsäure, Halogenbrenztraubensäure,
^ Halogenoxalessigsäure oder Halogenbernsteinsäure verwendet
wird.
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