DE2316352C3

DE2316352C3 - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Chloramphenicolderivaten

Info

Publication number: DE2316352C3
Application number: DE2316352A
Authority: DE
Inventors: Haruo Honda; Hirofumi Nakano; Takeo Suzuki; Fusao Tomita
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1972-04-05
Filing date: 1973-04-02
Publication date: 1975-07-17
Also published as: FR2179014A1; CA993821A; FR2179014B1; US3847747A; JPS529758B2; GB1426448A; DE2316352A1; DE2316352B2; JPS4899388A

Description

OH H

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Chloramphenicolderivaien der allgemeinen Formel

in der R₁ ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom oder die Acetylgruppe bedeuten, unter Züchtung von Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Nocardia in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 784. Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 923. Nocardia paraffinica ATCC 21 785 oder Nocardia paraffinica ATCC 21 924 verwendet.

20

35

40 O, N

10 H NHR₁

I I

-C C-CH₂-OR,

I !

OR₃ H

in der R₁ ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen oder verzweigten Acylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R₂ und R₃ jeweils ein Wasserstoffatom oder die Acetylgruppe bedeuten, unter Züchtung von Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Nocardia in einem Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 784, Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 923, Nocardia paraffinica ATCC 21 785 oder Nocardia paraffinica ATCC 21 924 verwendet.

Spezielle Beispiele für nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbare Chloramphenicolderivate sind die Verbindungen der Formeln I bis VII

CH₃

NHCOCH

CH₃

-C-CH₂OH

OH H

D-threo-2-Isobutyramid-l-p-nitrophenyl-1,3-propandiol

H NHCOCH₂CH₃

I !
C C-CH₂OH

(H)

wurde erstmals aus der Gärmaische von aerob getüchteten Mikroorganismen der Art Streptomyces venezuelae isoliert; vgl. J. Ehrlich et al., Science, Bd. 106 (1947), S. 417.

Es sind Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Chloramphenicolderivaten durch Züchlung von Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter, Corynebacterium oder Nocardia bekannt. Vgl. deutsche Offenlegungsschriften 2120153,2166090, 2166091 und 2166092. Diese Verfahren haben jedoch den Nachteil, daß die eingesetzten Mikroorganismen in Gegenwart von etwa 15 bis 40 txg/ml Chloramphenicol und außerdem durch Chloramphenicolderivate gehemmt werden. Ferner sind die nach diesen Verfahren erhaltenen Ausbeuten an Chloramphenicolderivaten nicht zufriedenstellend.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein in hohen Ausbeuten verlaufendes Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Chloramphenicolderivaten unter Einsatz von Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Nocardia zur Verfugung zu stellen, die gegen Chloramphenicol und dessen Derivate resistent sind. Dieses Verfahren soll außerdem wirtschaftlich und großtechnisch durchführbar sein. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

OH H

D-threo-2-Propionamid-l-p-nitrophenyl-1,3-propandiol

O₂N

C-

NHCOCH₃
-C-CH₂OH

OH H

D-threo-2-Acetamid-1 -p-nitrophenyl-1,3-propandiol

(III)

O₂N

H NHCOCH₃

C C-CH₂OCOCH₃ (IV)

H
OCOCH₃

D-threo-2-Acetamid-l-p-nitrophenyl-1,3-propandiol-1,3-diacetylester

O₁N

H NHCOCH₂CH₃

C C CH₂OCOCH₃ (V)

OH H

D-threo-2-Propionamid-l-p-niirophenyl-1 ^-propandioW-acelylester

O, N-

H NHCOCH₃

I I

C C-CH₂OCOCH₃ (VI)

OH H

D-threo-2-Acetamid-1 -p-nitrophenyl-) J-propandiol-.Vacetylester

H NH,

O,N <f C C CH₂OH
OH H

(VII)

n-threo-2-Amino-1 -p-nitrophenyl-1.3-propandiol

Die Chloramphenicolderivate der Formeln 1. II und III sind wertvolle Antibiotika, während die Verbindungen der Formeln IV bis VI als Ausgangsverbindungen zur Herstellung der Verbindungen II und III geeignet sind. Außerdem können die Verbindungen der Formeini bis VII als Ausgangsverbindungen zur Herstellung voa Chloramphenicol verwendet werden. Dabei werden die Verbindungen der Formeln IV bis VI unter milden Bedingungen zu den Verbindungen II oder III hydrolysiert. Die Verbindungen I bis VI lassen sich zu Verbindung VII hydrolysieren, die mit Dichloressigsäure zu Chloramphenicol umgesetzt werden kann.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Stämme sind Mutanten von Stämmen der Gattungen Corynebacterium oder Nocardia, die *war eine relativ hohe Resistenz gegen Chloramphenicol im Vergleich zu Darmbakterien aufweisen, deren Wachstum aber in Gegenwart von etwa 15 bis 40 fxg/ml Chloramphenicol gehemmt ist. Das Wachstum dieser zur Herstellung von antibiotisch wirksamen Chloramphenicolderivaten geeigneter Ausgangsstämme wird außerdem durch Chloramphenicolderivate gehemmt. Im erfindungsgcrnäßen Verfahren werden Mutanten von Stämmen der Gattungen Corynebacterium oder Nocardia eingesetzi, die auch in Gegenwart von hohen Konzentrationen von Chloramphenicol oder dessen Derivaten wachsen. Diese Mutanten sind im allgemeinen gegen Chloramphenicolkonzentrationen von mehr als 4(^gZmI resistent. Die Maximalkonzentration, gegenüber der die Stämme resistent sind, hängt jeweils von der Art der einzelnen Mutanten ab. Die erfindungsgemäß eingesetzten Mutanten bilden wesentlich größere Chloramphenicolmengen als bekannte Stämme.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten mit einer Resistenz gegen Chloramphenicol oder Chloramphenicolderivate können nach üblichen Verfahren zur Erzeugung von Mutanten erhalten werden; vgl. J.Starka, Physiologie und Biochemie der Mikroorganismen, Gustav Fischer Verlag Stuttgart, 1968, S. 494 bis 519. Der Stamm Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21628, der zur Bildung von Chloramphenicolderivaten befähigt ist, aber eine geringe Resistenz gegen Chloramphenicol und dessen Derivate aufweist, wird nach üblichen Verfahren, wie Behandlung mit Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, salpetriger Säure, Stickstofflost oder Nitrosoguanidin, der Mutation unterzogen. Nach der Behandlung ίο werden die Zellen auf einem Agarmedium gezüchtet, das die gewünschte Menge an Chloramphenicol oder dessen Derivaten, z. B. eine der Verbindungen der Formeln I bis VII, enthält. Auf diese Weise läßt sich ein gegen Chloramphenicol oder dessen De-

■ ₅ rivate resistenter Stamm isolieren. Die Resistenz der erhaltenen Mutante hängt von der Konzentration des Chloramphenicols oder dessen Derivate im Medium ab. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden im allgemeinen Mutanten, die gegen Konzentrationen von mehr als 40 μg ml Chloramphenicol resistent sind, eingesetzt.

Beispielsweise wird der Stamm Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21 628 in einem Nährmedium, das 1 % Fleischextrakt. 1 % Polypepton, 0,5% Hefeextrakt.0,3% Natriumchlorid und 2% Saccharose enthält und einen pH-Wert von 7,3 aufweist, angezüchtet. Die erhaltene Kultur wird mit isotonischer Natriumchloridlösung gründlich gewaschen und in einer Konzentration von etwa 5 · 10⁸ Zellen pro 1 ml in isotonischer Natriumchloridlösung resuspendiert. 5 ml der Suspension werden in eine Petrischale von 9 cm Durchmesser gegeben und von oben aus einem Abstand von 30 cm mit einer handelsüblichen UV-Lampe von 20 W 2 Minuten belichtet. Dabei wird die Petrischale gelegentlich geschüttelt. Nach der Bestrahlung sind 99,99% der Zellen abgetötet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert und in einem Nährmedium der vorbeschriebenen Zusammensetzung, das zusätzlich 200 bzw. 500 \x%/ml Chloramphenicol enthält, 5 Tage gezüchtet Fin Teil der auf diese Weise erhaltenen Zellkulturen wird nochmals in den vorgenannten Chloramphenicol enthaltenden Nährmedien gezüchtet. Die erhaltenen Gärmaischen werden schrittweise auf geeignete Konzentrationen verdünnt und auf feste Nährböden aufgetragen, die durch Zusatz von 2% Agar zu den vorgenannten Chloramphenicol enthaltenden Nährmedien hergestellt wurden.
Die auf den festen Nährböden gewachsenen KuI-türen werden auf feste Nährböden der gleichen Zusammensetzung übertragen, und ihr Wachstum wird festgestellt. Auf diese Weise erhält man Mikroorganismenstämme, die in Gegenwart von 200 bzw. 5(X) !xg/ml Chloramphenicol ein ausreichendes Wachstum aufweisen. Diese Stämme erhalten die Bezeichnung CHCM-11 (ATCC 21 923) bzw. CHCM-156 (ATCC 21 784).

1 η der Tabelle sind gegen Chloramphenicol resistente Stämme aufgeführt, die auf diese Weise erhalten wurden. Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die erhaltenen Mutanten eine wesentlich höhere Resistenz gegen Chloramphenicol als die entsprechenden Aiisgangsstämme aufweisen. Die in der Tabelle aufgeführten Stämme sind außer gegen Chloramphenicol auch gegen die vorstehend erwähnten Chloramphenicolderivate resistent. Sie weisen eine Kreuzresistenz auf. Es wird angenommen, daß die einzelnen Resistenzmechanismen einander ähnlich sind.

Resistenz gegen Chloramphenicol

Corynebacterium
hydrocarboclastus
ATCC 21628
(Ausgangsstamm)

Minimale Chloramphenicol-Hemtnkonzcntration. i

40

Chloramphenicolkonzentration
im zur Isolation verwendeten Nährmedium, ug/ml

CHCM-Il

(resistenter Stamm) 200

ATCC 21 923

CHCM-156

(resistenter Stamm) 500

ATCC 21 784

Minimale Chloiamphenicol-Hemmkonzentration. ag/ml

Nocardia paraffinica

ATCC 21 198

(Ausgangsstamm) 15

Chloramphenicolkonzentration im zur Isolation
verwendeten Nährmedium, a.e, ml

NCCM-3

(resistenter Stamm)

ATCC 21 924 50

NCCM-305

(resistenter Stamm)

ATCC 21785 100

Beispiel I

Nocardia paraffinica NCCM-305 (FERM-P Nr. 1409; ATCC21 785) wird 24Stunden in einem 1% Fleischextrakt, 1,0% Pepton, 0,5% Natriumchlorid und 2% Sorbit enthaltendem Nährmedium, das vor der Sterilisation einen pH-Wert von 7,2 aufweist, unter Schütteln gezüchtet. Die erhaltene Anzuchtkultur wird in einem Verhälinis von 10 Volumprozent ίο als Inoculum für 3,01 eines sterilisierten Nährmediums der folgenden Zusammensetzung, das sich in einem Schüttelfermenter von 5 I Fassungsvermögen befindet, verwendet:

KH,PO₄ 0.2%

Na₂HPO₄ 0,2%

MgSO₄- 7H,O 0,1%

MnSO₄ ·4Η"₂Ο 0,002%

FeSO₄- 7H₁O 0.02"»

ίο ZnSO₄ · 7H,O 0.001%

(NH₄),S0₄ .' 0.5%

CuCl₂ ■ 2H₂O 0.0003%

Maisquellflüssickeit 0.5" ο

hefeexlrakt 0.5%

η-Paraffine (Gemisch aus

Paraffin mil 12 bis 15 Kohlenstoffatomen) . ..: 10 Volumprozent

Als Kohlenstoffquellen werden bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise η-Paraffine oder Kohlenwasserstoff-Fraktionen, die n-Paraffine enthalten, verwendet. Besonders bevorzugt sind η-Paraffine mit 10 bis 22 und insbesondere 12 bis 18 Kohlenstoffatomen. Is können aber auch alle anderen von den Kohlenstoffquellen verwertbaren Kohlenwasserstoffe eingesetzt werden. Auch Kohlenhydrate, wie Fructose, Glucose oder Saccharose, Zuckeralkohole, wie Sorbit, Alkohol oder organische Säuren, wie Essigsäure, können verwendet werden. Als Stickstoffquellen werden übliche anorganische oder organische Swckstoffhaltige Verbindungen verwendet. Beispiele für Stickstoffquellen sind Maisquellflüssigkeit und Hefeextrakt. Außerdem werden gegebenenfalls anorganische Salze, wie Eisen-, Mangan-, Magnesium-, Kalium- oder Natriumsalze, und übliche Wachstumsfaktoren, wie Vitamine, beispielsweise Thiamin oder Pantothensäure, und Aminosäuren, wie Valin oder Leucin, dem Nährmedium zugesetzt.

Vor dem Animpfen mit dem Mikroorganismus wird das Nährmedium sterilisiert. Die Züchtung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen hei Temperaturen von 20 bis 45° C durchgeführt. Während der Züchtung wird der pH-Wert durch Zusatz von Harnstoff-, Ammoniak- oder Ammoniumcarbonatlösungen auf 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, eingestellt. Die Züchtungsdauer beträgt im allgemeinen 2 bis 7 Tage.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die Züchtung wird 65 Stunden bei 30 C" unier Rühren mit 650 U/Min, und einer Belüftung mit sterilisierter Luft von 1 1/1/Min. durchgerührt. Der pH-Wert des Nährmediums wird mit wäßriger Ammoniaklösung automatisch im Bereich von 6,5 bis 6,8 gehalten. Außerdem wird das Nährmedium dreimal im Abstand von 12 Stunden mit 100 ml n-Paraffine ergänzt. Nach der Züchtung sind die n-Paraffine praktisch vollständig verbraucht. Die Mikroorganismenzellen werden aus der erhaltenen Gärmaische abfiltriert. Das Filtrat wird an Kieselgel dünnschichtchromatographisch mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (93:7) als Laufmiltel aufgetrennt. Die einzelnen Flocken werden im UV-Lichl nachgewiesen. Die Flocken werden ausgekratzt, mit Methanol extrahiert und auf Grund ihrer Absorption bei 278 nm quantitativ analysiert. Man erhalt folgende Ergebnisse:

Verbindung I 2.0 g 1

Verbindung II 2,0 g 1

Verbindung III 1.0 g 1

Gleichzeitig wird das vorstehend beschriebene Verfahren unter Verwendung des Ausgangsstammes ATCC 21 198 durchgeführt. Dabei erhält man folgende Ergebnisse:

Verbindung I 0.5 g/l

Verbindung 11 0,6 g/l

Verbindung III 0,2 g/l

Beispiel 2

Der Stamm Nocardia paraffinica NCCM-305 (FERM-P Nr. 1409: ATCC 21 785) wird 70Stunden gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß an Stelle der n-Paraffine 10% Fructose verwendet werden. Die Aufarbeitung und Analyse der erhal-

tenen Produkte wird gemäß Beispiel 1 men. Man erhält folgende Ergebnisse:

Verbindung I 1,0 g/l

Verbindung 11 0,8 c/

Verbindung III 0,8 g,

Verbindung IV 0,1 g/

Verbindung V 0,1 g/i

Verbindung Vl 0.1 g/l

Gleichzeitig wird das vorstehend beschriebene Verfahren mit dem Ausgangsstrom ATCC 21 198 durchgeführt. Man gelangt zu folgenden Ergebnissen:

Verbindung I 0,2 g 1

Verbindung 11 0,15 g

Verbindung III 0,2 g 1

Verbindung IV bis Vl nicht

nachgewiesen

Beispiel 3

Corynebacterium hydrocarboclastus CHCM-156 (FERM-P Nr. 1408; ATCC 21 784) wird 80 Stunden gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Die Aufarbeitung und Analyse wird gemäß Beispiel 1 vorgenommen. Man erhält folgende Ergebnisse:

Verbindung I 3.0gl

Verbindung II 5,5 g 1

Verbindung III 4,0 g 1

Verbindung IV 3.0gl

VerbindungV l.Ogl

VerbindungVI l.Ogl

Verbindung VII 0.5 g 1

Gleichzeitig züchtet man den Ausgangsstamm ATCC 21 628 unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen. Man erhält folgende Ergebnisse:

Verbindung I 2,3 g 1

Verbindung II 4,0 g 1

Verbindung III 1.8 g/l

Verbindung IV 0,3 g4

Verbindung V 0,3 g 1

Verbindung VI 0,3 g/l

Verbindung VII nicht

nachgewiesen Beispiel 4

Corynebacterium hydrocarboclastus CHCM-156 (FERM-P Nr. 1408; ATCC 21 784 wird 75 Stunden gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß an Stelle von n-Paraffinen 10% Saccharose verwendet werden. Die Aufarbeitung und Analyse wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:

Verbindung I 2.7 g 1

Verbindung II 5.3 g 1

Verbindung III 4.2 gl

vorgenom- Verbindung IV 3,1 g/l

VerbindungV 1,0g/I

Verbindung Vl 1,0 g/l

VerbindungVlI 0,2 g/l

Die Verteilung der Produkte ist nahezu die gleiche wie im Beispiel 3.

Beispiel 5

Nocardia paraffinica NCCM-3 (ATCC 21 924) wird 80 Stunden gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Die Aufarbeitung und Analyse wird ebenfalls gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:

Verbindung I 1,0 g 1

Verbindung II l,0gl

Verbindung III 0.5 g 1

Beispiel 6

Corynebacterium hydrocarboclastus CHCM-Il (ATCC 21 923) wird 85 Stunden gemäß Beispiel 1 gezüchtet Die Aufarbeitung und Analyse wird ebenfalls gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält folgende Ergebnisse:

Verbindung I 2,5 g 1

Verbindung II 4,5 g 1

Verbindung III 2,5 g/l

Verbindung IV 0,8 g'l

VerbindungV 0,6g/l

Verbindung VI 0,5 g.-'l

Verbindung VlI 0,2 g 1

Beispiel 7

Corynebaclerium hydrocarboclastus CHCM-156 (FERM-P Nr. 1408; ATCC21 784) und Nocardia paraffinica NCCM-305 (FERM-P Nr. 1409; ATCC 21 785) werden jeweils 92 Stunden gemäß Beispiel 1 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß an Stelle von

10 Volumprozent n-Paraffinen 0,5% (Gewicht/Volumen) Natriumacetat eingesetzt werden. Während der Züchtung wird die Gärmaische kontinuierlich mit kleinen Mengen, die je nach Wachstum des Mikroorganismus festgelegt werden, einer 7%iger Lösung von Ammoniumacetat in halbkonzentriertei Essigsäure versetzt. Insgesamt werden 1,51 diesel Lösung zugegeben. Nach dem Abschluß der Züchtung erhält man folgende Ergebnisse:

50	Verbindung I	ATI C :i7K4	ATtC 21785
Verbindung II	2,4 g/l	l.Ogl
Verbindung III	3.0 g/l	0.9 g/l
⁵⁵ Verbindung IV	2,8 g/1	l.Ogl
Verbindung V	0,8 g/l	0.4 g'l
Verbindung VI	0,7 g/l	0.4 gl
Verbindung VII	0,4 g/l	0.4 gl
0,2 g/l	Spuren

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Chloramphenicolderivaten der allgemeinen Formel

Chloramphenicol der Formel
H

I -c-

NHCOCHCl₂
C-CH₅OH