DE1517784C

DE1517784C - Verfahren zum Verbessern des Ribonucleinsäuregehalts von Hefezellen

Info

Publication number: DE1517784C
Authority: DE
Inventors: Yoshio Ibaraki; Banno Isao; Kuno Mitsuzo; Suita; Nakao (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Verbessern des Ribonucleinsäuregehalts von Hefezellen durch Züchten von Hefezellen unter aeroben Bedingungen mit bestimmten Mikroorganismen.

Ribonucleinsäure ist sehr wichtig als Ausgangsmaterial für die Herstellung von 5'-Inosinsäure und 5'-Guanylsäure, die beide weitgehend als Komponenten von Würzen verwendet werden. Im Großverfahren wird Ribonucleinsäure gewöhnlich durch Extraktion der in Hefezellen enthaltenen Ribonucleinsäure gewonnen..

Es ist bereits bekannt, Hefen auf Kohlenhydraten als Kohlenstoffquellen, z. B. Glucose, Melasse und Stärkehydrolysat, zu züchten und'das erhaltene Rohmaterial zur Gewinnung von Ribonucleinsäure zu extrahieren. Solche mit Kohlenhydraten als Kohlenstoffquelle arbeitenden Verfahren -sind jedoch nachteilig, da die Kohlenhydrate verhältnismäßig teuer sind.

Aus der USA.-Patentschrift 3 193 390 ist auch bereits ein Verfahren zum Züchten von Hefen der Gattung Candida unter aeroben Bedingungen in einem " Nährmedium bekannt, das Paraffinkohlenwasserstoffe, vorzugsweise n-Paraffinkohlenwasserstoffe, als Hauptkohlenstoffquelle enthält. Die Züchtung erfolgt in einem pH-Bereich von 3 bis 6 bei Temperaturen von ■25 bis 35°C.

In der französischen Patentschrift 1 381 311 ist-ein Verfahren beschrieben, bei dem bestimmte Hefestämme der Gattungen Candida und Torulopsis unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium gezüchtet werden, die Kohlenwasserstoffe als einzige Kohlenstoffquelle enthalten. Nach der Züchtung wird eine mikroorganismenhaltige Fraktion abgetrennt und diese Fraktion einer Lösungsmittelextraktion unterworfen. Mit der Extraktion soll der hohe Lipidgehalt einer auf Kohlenwasserstoffen gezüchteten Hefe, der für den eingenartigen und unangenehmen Geschmack einer solchen Hefe verantwortlich ist, herabgesetzt und damit eine Geschmacksverbesserung erzielt werden.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man Hefezellen mit gegenüber den bekannten Verfahren erhöhtem Gehalt an Ribonucleinsäure erhält, wenn man unter aeroben Bedingungen und üblichen pH- und Temperaturverhältnissen bestimmte Mutanten der Gattung Candida in einem als Hauptkohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe, insbesondere n-Paraffine mit 14 bis 21 Kohlenstoffatomen, enthaltenden Medium züchtet. Die verwendeten Mutanten der Gattung Candida sind gegen Thiazin-, Oxazin- und Acridinfarbstoffe resistent. Demgegenüber werden Hefezellen mit nur einer geringen Menge Ribonuclein erhalten, wenn Wildstämme der genannten Hefen an Stelle der Mutanten in diesem Kulturmedium gezüchtet werden. Die Mutanten können künstlich oder spontan aus den natürlich vorkommenden Stämmen erhalten werden.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Verbessern des Ribonucleinsäuregehalts von Hefezellen durch Züchten von Hefezellen unter aeroben Bedingungen und üblichen pH- und Temperaturverhä.'tnissen in einem Nährmedium, welches als Hauptkohlenstoffquelle Kohlenwasserstoffe, die wenigstens 10 Volumen pro Volumen an n-Parafünen mit 14 bis 21 Kohlenstoffatomen .aufweisen und übliche Nährstoffe enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Hefe Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 005, 20 006 und 20 007 oder Candida parapsilosis Langeron et Talice ATCC 20008 einsetzt. Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden Stämme, die zur Gattung Candida gehören, als, ursprüngliche Mikroorganismen verwendet, aus denen die gewünschten Mutanten erzeugt werden können. Das Wachstum von Wildstämmen, die zur Gattung Candida gehören, einschließlich Candida tropicalis Berkhout und Candida parapsilosis Langeron et Talice, wird in Gegenwart von Thiazinfarbstoffen, wie 3,7-Diaminphenothiazoniumchlorid,3,7-Bis-(dimethylamino)-phenazathioniumchlorid, Oxazinfarbstoffe^ wie Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid, oder Acridinfarbstoffen, wie 2,8-Bis-(dimethylamino)-acridiniumchlorid, 2,8-Diamino-lO-methylacridiniumchlorid und 2,8-Diaminoacridiniumchlorid, gehemmt. Die Mutanten, die gegen diese Farbstoffe resistent sind, können erzeugt werden durch Behandlung von Wildstämmen der Gattung Candida mit einem Mutagen, z. B..durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen* oder Behandlung mit salpetriger Säure oder durch Wahl und Isolierung eines Stammes von natürlich und spontan auftretenden Mutanten der Wildstämme. Das Wachstum der- so erhaltenen Mutanten wird durch diese Farbstoffe nicht mehr gehemmt. Die gewünschte Mutation eines Wildstammes der Gattung Candida kann nach beliebigen an sich bekannten Methoden hervorgerufen werden, die in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben sind, z. B. in »Methods in Medical Research«, Bd. 3, von R. W. G e r a r d, Year Book Publishers, Inc., Chicago, 1950, und »Nature«, 183, S. 1829 (1959), in einer Arbeit von F. Kaudewitz.

Vom Standpunkt des Wachstums und der in den Zellen angereicherten Ribonucleinsäuremenge werden : von den so erhaltenen, gegen die genannten Farbstoffe resistenten Mutanten vorzugsweise solche verwendet, die auf einem Kulturmedium zu wachsen vermögen, das die Farbstoffe in wenigstens der 5fachen Mindestkonzentration enthält, die das Wachstum der Wildstämme, aus denen die Mutanten erhalten wurden, hemmt. ■

Von den erfindungsgemäßen Mutanten ist Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 005 gegen 3,7-Diaminophenothiazoniumchlorid resistent, Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 006 gegen Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid resistent, Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 007 gegen 2,8-Bis-(dimethylamino)-acridiniumchlorid resistent und Candida parapsilosis Langeron et Talice ATCC 20 008 gegen Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid resistent. Die Zahlen hinter der Abkürzung »ATCC« sind die Zugangsnummern der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, USA.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird im allgemeinen vorzugsweise unter Verwendung eines flüssigen Kulturmediums durchgeführt. Die Kultivierung erfolgt aerob, d. h. unter Belüftung, unter statischen oder submersen Bedingungen. Das gemäß der Erfindung verwendete Kulturmedium muß als Kohlenstoffquelle wenigstens Kohlenwasserstoffe enthalten, die Normalparaffine einer C-Zahl im Bereich von 14 bis 21 enthalten.

Vom Standpunkt des Wachstums des Mutanten und der in den Zellen angereicherten Ribonucleinsäuremenge beträgt die Menge der in den Kohlenwasserstoffen enthaltenen Normalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14 bis 21 vorzugsweise wenigstens 10 Volumprozent. Die genannten Normalparaffine selbst bilden vorteilhaft zu 100 °/₀ die Kohlenstoffquelle beim Verfahren gemäß der Erfindung.

1OiY 7Ö4

Die Normalparaffine bestehen entweder nur aus einer Art von C₁₄- bis C₂₁-Normalparaffinen oder aus zwei oder mehr Arten von Normalparaffinen, deren C-Zahl jeweils im genannten Bereich liegt. Außer den Q₄- bis Cai-Normalparaffinen kann die erfindungsgemäß verwendete Kohlenwasserstoffquelle noch andere Kohlenwasserstoffe enthalten (z. B. verzweigte Paraffine, Olefine, cyclische Paraffine, aromatische Kohlenwasserstoffe, Normalparaffine mit 1 bis 13 oder wenigstens 22 C-Atomen), solange die Ci₄- bis Cji-Normalparaffine insgesamt in einer Menge von wenigstens 10% (Vol./Vol.) vorhanden sind. .

Vorzugsweise verwendet man als Kohlenwasserstoffe reines n-Hexadecan, schwere Paraffine, die etwa 90 Volumprozent Normalparaffine enthalten, die C-Zahlen im Bereich von 14 bis 21 und einen Siedebereich von etwa 262 bis 349⁰C haben, schweres Gasöl, das etwa 17% Normalparaffine einer C-Zahl im Bereich von 15 bis 20 enthält und einen Siedebereich von etwa 272 bis 386⁰C hat, und Gasöl, das etwa 14% Normalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14 bis 17 enthält und einen Siedebereich von etwa 180 bis 35O°C hat. Vom Standpunkt des Wachstums des Mu-. tanten und der in den Zellen angereicherten Menge der Ribonucleinsäure. werden die Kohlenwasserstoffe im allgemeinen in einer solchen Menge verwendet, daß die Konzentration der Normalparaffine mit C-Zahlen im Bereich von 14 bis 21 im Kulturmedium insgesamt etwa 3 bis 20 Volumprozent beträgt.

Da diese Kohlenwasserstoffe in Wasser schwerlöslich sind, erfolgt ihre Zugabe praktisch zu einem wäßrigen Kulturmedium unter Rühren oder Schütteln, wobei eine Suspension gebildet wird, die sehr feine Teilchen enthält. Gegebenenfalls kann ein Suspendiermittel, z. B. eine oberflächenaktive Substanz vom Typ des Polyoxyäthylensorbitanmonostearats verwendet werden. Diese Kohlenwasserstoffe genügen als solche als Kohlenstoffquelle, jedoch können gegebenenfalls üblicherweise verwendete Kohlenstoffquellen, wie Kohlenhydrate, (z. B. Glucose), zusammen mit den Kohlenwasserstoffen verwendet werden.

Das Kulturmedium muß eine oder mehrere Stickstoffquellen sowie die Kohlenwasserstoffe als Nährstoffe enthalten. Geeignet sind die bei den bekannten Verfahren verwendeten Stickstoffquellen, beispielsweise Pepton, Sojabohnenpulver, Maisquell wasser, Fleischextrakt, Ammoniumsalze, organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder stickstoffhaltige Stoffe. Ferner können anorganische Salze, z.B. Natriumchlorid, Metallsalze, z.B. Zink-, Eisen- und Mangansalze, dem Medium in geringen Mengen zugesetzt werden.

Die Kultivierungsbedingungen, z. B. der pH-Wert des Mediums und die Kultivierungstemperatur, müssen so geregelt werden, daß maximales Wachstum der Zellen im Kulturmedium und maximale Anreicherung von Ribonucleinsäure in diesen Zellen .erzielt werden. Im allgemeinen wird der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums auf etwa 4,0 bis 8,0 und die Kultivierungstemperatur auf etwa 20 bis 40° C eingestellt. Unter diesen Kultivierühgsbedingungen werden Zellen, die eine sehr hohe Ribonucleinsäuremenge enthalten, im Laufe der Zeit im Kulturmedium gebildet. .

Die Kultivierung wird fortgesetzt, bis die maximale Ribonucleinsäuremenge in den gezüchteten Zellen angereichert ist. Die Zeit, die bis zur maximalen Anreicherung der Ribonucleinsäure erforderlich ist, ist in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren unterschiedlich, jedoch erreicht die Menge der Ribonucleinsäure in den Zellen im allgemeinen das Maximum in etwa 5 bis 36 Stunden nach Beginn der Kultivierung. Λ Die auf diese Weise erhaltenen Zellen, die eine sehr hohe Menge Ribonucleinsäure enthalten, können von dem Kultivierungsmedium in beliebiger geeigneter Weise, z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt werden. Die in den so erhaltenen Hefezellen enthaltene Ribonucleinsäure kann von den Hefezellen nach Belieben als Ribonucleinsäure oder als Oligonucleotid nach beliebigen Methoden gewonnen werden, die für diesen Zweck bekannt sind. Beispielsweise kann die Ribonucleinsäure durch eine Extraktionsbehandlung gewonnen werden, bei der man die Hefe, die in einer 5 bis 15%igen wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert ist, 0,5 bis 100 Stunden auf eine Temperatur von etwa 60 bis 90°C erhitzt und den flüssigen Anteil vom festen Anteil abtrennt (s. »Biochemical Journal«, II, S. 319 [1"917]). Oligonucleotid kann gewonnen werden, indem die wäßrige Hefesuspension bei pH 7 bis 8,0 für eine Dauer von 0,5 bis 10 Stunden auf eine Temperatur von etwa-80 bis 130⁰C erhitzt und der flüssige Anteil vom festen Anteil abgetrennt wird (s. japanische Patentveröffentlichung 9 991/1962). · ' -

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, in denen die Prozentsätze sich auf Volumen pro Volumen beziehen, falls nicht anders angegeben. Hierbei verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Millimeter.

Beispiel!

10 ml Kulturmedium der nachstehend in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung werden nach Zugabe von 400 MikrogrammTetramethyldiaminoxanthyliumchlorid'pro Milliliter mit Candida tropicalis Berkhout beimpft. Das Medium wird 4 Tage bei 28°C unter Schütteln bebrütet.

Tabelle 1

Saccharose .-. 50 g/l

Natriumglutamat 2 g/l

Ammoniumsulfat "25 g/l

KH₂Po₄ ........... ig/i

MgSO₄ · 7H₂O 0,5 g/l

CaCl₂ 0,1 g/l

Biotin 2 μ g/l

Calciumpantothenat 400 μ g/l

Inosit '2000 μ g/1

Nicotinsäure 400 μ g/l

p-Aminobenzoesäure ...... 200 μ g/l

Pyridoxinhydrochlorid . 400 μ g/l

Riboflavin 200 μ g/l

Thiaminhydrochlorid 400 μ g/l

pH 5,8

Aus der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan gebildete Mutanten isoliert, die gegen Tetramethyl-

diaminoxanthyliumchlorid resistent sind. Von diesen isolierten Mutanten wird ein Stamm Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 006 in 50 Raumteile eines Kulturmediums der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung geimpft. Das Medium wird 24 Stunden bei 5 28°C geschüttelt.

Tabelle 2

Gewichtsteile .

Schwere Paraffine* 100

NH₄NO₃ 10

KH₂PO₄ 20

K₂HPO₄ 10

MgSO₄-7H₂O ... 1

MnSO₄ · 4H₂O 0,01

ZnSO₄-7H₂O; 0,01

FeSO₄ · 7H₂O 0,01 .

Maisquellwasser 10

Wasser 1000 Raumteile

pH-Wert 6,0
* a) Zusammensetzung:

Cu-Qü-Normalparaffine 90,7%

Cn-Qa-Normalparaffine 1,9%

Qo-Csa-Normalparaffine 8,5 %

b) Siedebereich 262 bis 349⁰C

Mit der erhaltenen Kulturbrühe werden 1000 Raumteile des Kulturmediums der in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 20 Stunden bei 28° C geschüttelt wird. Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 24 Gewichtsteile (als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 12% Ribonucleinsäure enthalten. Die Zellen werden in 250 Raumteilen einer auf pH 8,0 eingestellten 0,5molaren Natriumchloridlösung suspendiert. Die Suspension wird 30 Minuten auf 9O⁰C erhitzt, um die Ribonucleinsäure zu extrahieren. Anschließend werden die Zellen abfiltriert. Zum erhaltenen Filtrat werden 100 Raumteile Äthanol gegeben, wobei 2,2 Gewichtsteile Ribonucleinsäure erhalten werden.

Wenn ein. Wildstamm von Candida tropicalis Berkhout an Stelle des genannten Mutanten unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 20 Gewichtsteile (als Trockensubstanz) Zellen erhalten, die bezogen auf das Gesamtgewicht, nur 4,0% Ribonucleinsäure enthalten.

Beispiel 2

Mit Candida arapsilosis Langeron et Talice werden 10 ml des Kulturmediums der in Tabelle 1 von Beispeil 1" genannten Zusammensetzung, dem 400 μg Tetramethyldiaminoxanthyliumchlorid pro Milliliter zugesetzt worden waren, geimpft. Das Medium wird 4 Tage bei 28° C geschüttelt. Von der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan auftretende Mutanten isoliert, die gegen Tetramethyldiaminqxanthyliumchlorid resistent sind. Von den isolierten Mutanten wird ein Stamm, der als Candida parapsilosis Langeron et Talice ATCC 20 008 bezeichnet wird, in 50 Raumteile des in der folgenden Tabelle 3 genannten Kulturmediums geimpft, das 24 Stunden unter Schütteln bei 28⁰C bebrütet wird.

Tabelle 3

Gewichtsteile
.. 300

Gasöl*

NH₄NO₃ 10

KH₂PO₄ 20

K₂HPO₄ 10

MgSO₄-7H₂O :.... 1

MnSO₄-4H₂O ...' 0,01

ZnSO₄-7H₂O 0,01

FeSO₄-7H₂O ..... 0,01

Maisquellwasser 10

Wasser .- 1000 Raumteile

pH-Wert 6,0
* a) Zusammensetzung:

CvCT-Normalparaffine - - - 13,5 %

C₁₂-C_I3-Normalparaffine 6,5 %

Verzweigte Paraffine .· 10%

Monocyclische Paraffine 25 %

Dicyclische Paraffine -20%

Monoaromatische Kohlenwasserstoffe 12 %
Diaromatische Kohlenwasserstoffe ... 8 %

b) Siedebereich 180 bis 35O°C

c) Flammpunkt etwa 71° C

Die erhaltene Kulturbrühe wird zu 1000 Raumteilen des Kulturmediums der in Tabelle 3 genannten Zusammensetzung gegeben, worauf 24 Stunden bei 28° C geschüttelt wird. Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 22 Gewichtsteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die 11,8% (bezogen auf das Gesamtgewicht) Ribonucleinsäure enthalten. Die Zellen werden in 250 Raumteilen einer auf pH 0,8 eingestellten 0,5molaren wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert. Die Suspension wird 30 Minuten auf 90° C erhitzt, wobei die Ribonucleinsäure extrahiert wird. Nach Entfernung der Zellen durch Filtration werden zum erhaltenen Filtrat 100 Raumteile Äthanol gegeben, wobei 2,1 Gewichtsteile Ribonucleinsäure erhalten werden.

Wenn an Stelle des genannten Mutanten ein Wildstamm von Candida parapsilosis Langeron et Talice unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 21 Gewichtsteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten, die nur 3,5 Gewichtsprozent * (bezogen auf das Gesamtgewicht) Ribonucleinsäure enthalten. . . .

Beispiel 3

Mit Candida tropicalis Berkhout werden 10 ml des Kulturmediums der in Tabelle 1 von Beispiel 1 genannten Zusammensetzung beimpft, dem 400 μg 2,8-Bis-(dimethylamino)-acridiniumchlorid pro Milliliter zugesetzt worden waren. Das Medium wird 4 Tage bei 28 ⁰C unter Schütteln bebrütet. Von der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan auftretende Mutanten isoliert, die gegen 2,8-Bis-(dimethylamino)-acridiniumchlorid resistent sind.

Von den isolierten Mutanten wird ein Stamm, der als Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 007 bezeichnet wird, in 50 Raumteile des Kulturmediums der in der folgenden Tabelle 4 genannten Zusammensetzung geimpft. Das Medium wird 24 Stunden unter Schütteln bei 28⁰C bebrütet.

Tabelle 4

Gewichtsteile

Schweres Gasöl* 200

NH₄NO₃ .10

KH₂PO₄ 20

K₂HPO₄ 10

MgSO₁-7 H₂O 1

MnSO₄-4H₂O 0,01

ZnSO₄-7H₂O 0,01

FeSO₄ -7H₂O 0,01

Maisquellwasser 10

. Wasser 1000 Raumteile

pH-Wert 6,0

a) Enthält 20°/,. C₁₅-C.,„-Normalparaffine.

b) Siedebereich 272 bis 380" C.

c) Flammpunkt etwa 140'C.
(1) Spezifisches Gewicht 0,866.

Mit der erhaltenen Kulturbrühe werden 1000 Raumteile des Kulturmediums der in Tabelle 4 genannten Zusammensetzung geimpft, worauf 20Stunden bei 28°C geschüttelt wird. Die erhaltene Kulturbrühe tfird zentrifugiert, wobei 22 Gewichtsteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 11,5 °/₀ Ribonucleinsäure enthalten. Die Aufarbeitung der Zellen auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ergibt 2,3 Gewichtsteile Ribonucleinsäure.

Wenn ein Wildstamm von Candida tropicalis Berkliout an Stelle des genannten Mutanten unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird, werden 22 Gewichtsteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten, die nur 3,3 °/₀ (bezogen auf das Gesamtgewicht) Ribonucleinsäure enthalten.

Beispiel 4

Nach Bestrahlung mit Ultraviolettlicht (15 W) für eine Dauer von 30 Sekunden aus einer Höhe von 50 cm werden mit Zellen von Candida tropicalis Berkhout 10 ml des Kulturmediums der in. Tabelle 1 von Beispiel Γ genannten Zusammensetzung geimpft, dem 500 [j.g 3,7-Diaminophenothiazoniiimchlorid pro Milliliter zugesetzt worden waren, worauf 4 Tage bei 28 ⁰C geschüttelt wird. Von der erhaltenen Kulturbrühe werden spontan auftretende Mutanten isoliert, die gegen 3,7-Diaminophenothiazoniumchlorid resistent sind.

Von den isolierten Mutanten wird ein Stamm, der als Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 005 bezeichnet wird, in 50 Raumteile eines Kulturmediums geimpft, das die in Tabelle 2 von Beispiel 1 genannte Zusammensetzung hat, jedoch an Stelle der schweren Paraffine reines n-Hexadecan enthält. Anschließend wird 24 Stunden bei 28°C geschüttelt.

Mit der erhaltenen Kulturbrühe werden 1000 Raumteile des Kulturmediums beimpft, das die vorstehend genannte Zusammensetzung hat, worauf 22 Stunden bei 28¹C unter Schütteln bebrütet wird. Die erhaltene Kulturbrühe wird zentrifugiert, wobei 25 Raumteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 12,2% Ribonucleinsäure enthalten. Die Zellen werden auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei

G 2,5 Gewichtsteile Ribonucleinsäure erhalten werden. Wenn ein Wildstamm von Candida tropicalis Berkhout an Stelle des genannten Mutanten unter den gleichen Bedingungen kultiviert wird,, werden 22 Gewichtsteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen

ίο erhalten, die nur 3,4 °/₀ Ribonucleinsäure enthalten.

B e i s ρ i e I 5

Mit dem gegen 3,7-Diaminophenothiazoniumchlorid resistenten Mutanten Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 005 werden 1000 Raumteile des Kulturmediums der" in Tabelle 2 genannten Zusammensetzung auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise geimpft, wobei 24 Gewichtsteile (gerechnet als Trockensubstanz) Zellen erhalten werden, die, bezogen auf das Gesamtgewicht, 11,4% Ribonucleinsäure enthalten. Die Zellen werden in 250 Raumteilen einer Natriumhydroxidlösung suspendiert, deren pH-Wert 8,0 beträgt. Die Suspension wird 60 Minuten auf 13O⁰C erhitzt. Zur Suspension werden 50 Gewichtsteile eines im Handel erhältlichen Filterhilfsmittels gegeben. Das erhaltene Gemisch wird unter' Druck filtriert. Zum Filtrat werden 1000 Raumteile Äthanol gegeben, wobei 23 Gewichtsteile Oligonucleotid erhalten werden.

Isolierung und Selektion der verwendeten Mutanten

Mit Zellen der Mikroorganismen werden 10 ml eines Kulturmediums geimpft, das hergestellt wird, indem das Kulturmedium der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung durch die entsprechend bemessene Menge (in Konzentration) des Farbstoffs ergänzt wird, worauf das Medium 4 Tage bei 28°C geschüttelt wird. Im Gegensatz zu Zellen von Wildstämmen, die praktisch nicht wachsen, sind die Mutantenzellen in der tage, zu wachsen. Die erhaltene Kulturbrühe wird auf der Oberfläche einer synthetischen Agarplatte ausgebreitet, die die entsprechend bemessene Menge des Farbstoffs enthält, wodurch die Zellen des Mutanten auf der Oberfläche der Agarplatte während der Bebrütung für eine Dauer von 3 bis 7 Tagen zu Kolonien heranwachsen können. Diese Kolonien, die aus Mutantenzellen bestehen, die gegen den Farbstoff resistent sind, werden voneinander isoliert.' Mit jedem dieser Mutanten wird das synthetische flüssige Medium beimpft, worauf unter den in jedem Beispiel genannten Bedingungen kultiviert wird. Die Trübungen der Kulturbrühe werden gemessen, um die Fortpflanzung der Mutanten zu ermitteln.

Von diesen Mutanten wird der Stamm, der eine hohe Dichte ergibt, für die Erzeugung in der beschriebenen Weise ausgewählt.

In den nachfolgenden Vergleichsversuchen werden die Hefen der französischen Patentschrift 1 381 311 hinsichtlich ihrer Ribonucleinsäure ansammelnden Wirkung mit den erfindungsgemäßen Hefen verglichen.

Vergleichsversuche

Teströhrchen werden mit je 5 ml eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung gefüllt:

209 611/88

9 10

Gasöl* 300 g Jedes der Teströhrchen wird mit einer öse der in

NH₄NO₃ 10 g der nachfolgenden Tabelle aufgezählten Stämme be-

KH₂PO₄ 20 g impft und 24 Stunden bei 28°C unt;r Schütten be-

K₂HPO₄ 10 g brütet. Dann werden Schüttilflaschen mit einem

MgSO₄ · 7H₂O Ig 5 Fassungsvermögen von 200 ml mit jeweils 20 ml· des

MnSO₄ · 4H₂O 0,01 g Kulturmediums beschickt und jeweils mit 0,4 ml der

ZnSO₄ · 7H₂O 0,01 g jeweiligen Kulturbrühe geimpft und 24 Stunden bei

FeSO₄ -7H₂O ....... 0,01 g 28° C unter Schütteln bebrütet. Di; Zellausbeute und

Maisquellwasser .'.'...' 10 g der Gehalt der Zellen an Ribonuchinsäiire wird beWasser '....'. r.. zu 1 Liter io zogen auf die trockene ZeIh bestimmt.¹ Die Ergebnisse

pH 6,0 zeigt die nachfolgende Tabelle. . , .

♦ Das verwendete Gasöl hat folgende Eigenschaften: Die Vergleichsversuche zeigen, daß von den sechs

Έ) Bestandteile: Hefen der französischen Patentschrift 1 381 311 nur

R^vh^nTiV^ii¹⁶"⁵¹⁰^¹¹¹⁶" ""n «./ Candida lipolytica CBS 599 überhaupt auf dem gas-

η-Paraffine mit Kohlenstoffzahlen im ¹S ölhaltigen Kulturmedium wachst, während die anderen

. Bereich von 12 bis 13 6,5% fünf Stämme kein Wachstum zeigen. Auch bei Candida

verzweigtkettige Paraffine 10°/„ lipolytica CBS 599 ist jedoch die Anreicherung von

-- dgSSSSSJSf!¹!'.:!!"!!"!".!Si!: Ribonucleinsäure wesentlich gering*, als bei den

monoaromatische Kohlenwasserstoffe 12% Mutanten gemäß der Erfindung,

diaromatische Kohlenwasserstoffe ... 8 % ²⁰ -

b) Siedebereich 180 bis 35O°C

c) Flammpunkt etwa71°C - -

^:' Stämme	Zellausbcute	Ribonucleinsäure- gehalt der Zellen _
a) französische Patentschrift 1 381 311 Candida lipolytica CBS 599 Candida pulcherrima CBS 610 Candida utilis CBS 890	18,0 mg/ml kein Wachstum kein Wachstum kein Wachstum kein Wachstum kein Wachstum 20,0 mg/ml 21,2 mg/ml 21,3 mg/ml 21,8 mg/ml	7,5 °/o ,
Candida utilis var. major CBS 841 Candida Tropicalis CBS 2317 . Torulopsis colliculosa CBS 133 i>) Erfindung Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 006 Candida parapsilosis Langeron et Talice ATCC 20 008 Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 007 Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 005 λ	. ll,8°/o 11,9% 11,7 °/o ■12,17ο

Claims

Patentanspruch:

, Verfahren zum Verbsssern des Ribonucleinsäuregehalts von Hefezellen durch Züchten von Hefe- 45 zellen unter aeroben Bedingungen und üblichen pH- und Temperaturverhältnissen in einem Nährmedium, welches als Hauptkohlenstoffquelle Kohlenstoffe, die wenigstens 10 Volumen pro Volumen an η-Paraffinen mit 14 bis 21. Kohlenstoffatomen aufweisen, und übliche Nährstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida tropicalis Berkhout ATCC 20 005, 20 006 und 20 007 oder Candida parapsilosis Langeron et Talice ATCC 20 008 einsetzt.