DE3852103T2 - Riboflavin herstellende mikroorganismenstämme, verfahren für ihre selektion und fermentationsverfahren. - Google Patents
Riboflavin herstellende mikroorganismenstämme, verfahren für ihre selektion und fermentationsverfahren.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der in der Lage ist, hohe Mengen Riboflavin zu produzieren, und insbesondere Stämme der Hefe Candida flareri, die erhöhte Mengen Riboflavin produzieren, sowie ein Verfahren der Fermentation der Mikroorganismen. Die Erfindung betrifft außerdem Verfahren zur Selektion von Riboflavin überproduzierenden Mutanten.
- Riboflavin wird von einer Vielzahl von Mikroorganismen in Mengen produziert, die den metabolischen Bedarf des Organismus selbst weit übersteigen. Ascomyceten wie Ashbya gossypii und Eremothecium ashybii sind für die Riboflavinproduktion mittels Fermentation bekannt. In typischer Weise wird das von diesen Organismen produzierte Riboflavin als Futtermittelzusatz verwendet.
- Die Riboflavinproduktion mit Hilfe anderer Organismen ist ebenfalls bekannt. Beispielsweise sind für die Riboflavinproduktion die Bakterien der Genera Clostridium und Bacillus wie auch verschiedenen Hefen, einschließlich Candida, Saccharomyces, Hansenula und Pichia bekannt. Insbesondere beschreibt z. B. das US-Patent No. 3 433 707 (1969), erteilt an Matsubayashi et al., die Produktion von Riboflavin mit Hilfe von drei Pichia-Hefearten. Ausbeuten von zwischen 10,5 mg/l und 51 mg/l innerhalb von 12 Tagen wurden angegeben. Eine Überproduktion von Riboflavin von 6,42 g/l durch Ashbya gossypii ist von Szczesniak et al. (1973) beschrieben worden, wie in Perlman, Primary Products of Metabolism, 2 Econ. Microbiology, 5.312, (1978) diskutiert.
- Die üblicherweise angesprochene US-Anmeldung Nr. 811 234, angemeldet am 20. Dezember 1985, berichtet von der Entwicklung von Stämmen von Candida flareri mit gesteigerter Riboflavinproduktion. Diese in der US-Anmeldung Nr. 811 234 diskutierten Stämme von C.flareri produzieren 5 Gramm Riboflavin pro Liter innerhalb von sechs Tagen Fermentation.
- Untersuchungen zum metabolischen Bedarf Riboflavin produzierender Hefen haben eine Empfindlichkeit der Riboflavinproduktion gegenüber erhöhten Eisenkonzentrationen berichtet.
- Beispielsweise berichten Straube et al. in "The Influence of Iron Concentration and Temperature on Growth and Riboflavin Overproduction of Candida Guilliermondii", Biotechnology and Bioengeneering Symposium No. 4, 225-231(1973), daß Eisenkonzentrationen von 10&supmin;&sup5; M die Produktion von Riboflavin nahezu vollständig inhibieren und daß die Riboflavinproduktion annähernd umgekehrt proportional zur Eisenkonzentration ist. Straube et al. fanden außerdem, daß die Anwesenheit von Kobalt die inhibierende Wirkung von Eisen auf die Riboflavinproduktion rückgängig machen kann. Bei Kobaltkonzentrationen von 10&supmin;&sup4; M und Eisenkonzentrationen von 10&supmin;&sup5; M wurde genausoviel Riboflavin produziert wie ohne Kobalt und unter Beschränkung von Eisen auf 10&supmin;&sup7; M.
- Andere Quellen diskutieren die Eisensensibilität bei Riboflavin produzierenden Mikroorganismen und insbesondere die Tatsache, daß die Eisenempfindlichkeit teilweise überwunden werden kann, indem man dem Fermentationsmedium Kobalt, Zink oder Chelatoren zusetzt: Chopde et al. "Factors Influencing Riboflavin Synthesis by Cytophaga Hutchinsonii", Indian J. of Microbiology, v. 20 n. 2 (1980); Schlee et al., "Physiology and Biochemistry of Riboflavin Formation", Die Pharmazie, Nr. 12 (1984).
- Während Eisen die Riboflavinproduktion inhibiert, ist auch berichtet worden, daß erhöhte Mengen an Eisen das Zellwachstum fördern. Daher sollten Hefen mit verringerter Eisenempfindlichkeit der Flavinogenese hohe Mengen Riboflavin produzieren, weil durch erhöhte Eisenkonzentrationen gesteigerte Zelldichten erzielt werden können.
- Stämme Riboflavin produzierender Mikroorganismen mit verringerter Eisenempfindlichkeit der Riboflavinproduktion sind schon beschrieben worden, siehe Russisches Patent Nr. 330189 (Zusammenfassung), DD-108767 (Zusammenfassung).
- Dementsprechend besteht ein Bedarf an Mikroorganismen mit einem gesteigerten Grad der Riboflavinproduktion. Weiterhin besteht ein Bedarf an Stämmen flavinogener Mikroorganismen, welche gegen die Inhibition der Riboflavinproduktion durch Eisen resistent sind. Zusätzlich besteht ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Selektion Riboflavin überproduzierender Mikroorganismen. Außerdem besteht ein Bedarf an Fermentationsmedien, welche ein erhöhtes Zellwachstum sowie die Flavinogenese unterstützen. Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen produzieren Riboflavin in Mengen, die weit über denjenigen von Wildtyp-Stämmen flavogener Mikroorganismen liegen und die im Vergleich zu den Ausbeuten bekannter und entwickelter Stämme verbessert sind.
- Die Erfindung betrifft Stämme der Hefe Candida flareri, welche 10 Gramm Riboflavin pro Liter in sechs Tagen produzieren können. Riboflavinausbeuten von mehr als 20 Gramm pro Liter sind innerhalb von 200 Stunden erzielt worden. Die C.flareri-Stämme A und B, die unter den ATCC-Eingangsnummern 20849 bzw. 20850 zu identifizieren sind, sind die am stärksten flavinogenen Stämme der Erfindung. Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Stämme von C.flareri mit verringerter Empfindlichkeit der Flavinogenese gegen die Eiseninhibition. Solche Stämme haben die Eigenschaft gesteigerter Riboflavinproduktion pro Zelle bei erhöhter Eisenkonzentration im Fermentationsmedium. Entwickelte Stämme von C.flareri wurden auch im Hinblick auf die Resistenz gegen Wachstumsinhibition durch ausgelaugte Medien und durch Desoxyglukose selektiert.
- Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Selektionsverfahren für vermehrt Riboflavin produzierende Hefestämme, welche gegen Wachstumsinhibition durch ausgelaugte Medien resistent sind. Solche Stämme sind in der Lage, auf höhere Zelldichten heranzuwachsen, um größere Mengen an Metaboliten zu produzieren. Dieses Verfahren umfaßt die Herstellung eines ausgelaugten Mediums durch Heranziehen einer Mikroorganismenpopulation bis zum Stillstand des Zellwachstums. Die Mikroorganismen werden dann zur Gewinnung eines ausgelaugten Mediums aus dem Medium entfernt. Anschließend wird ein Selektionsmedium gebildet, welches das ausgelaugte Medium umfaßt. Eine Riboflavin produzierende Hefe wird der Mutagenese unterworfen und in das Selektionsmedium eingeführt. Die Stämme der mutierten Hefe, welche in der Lage sind, auf dem ausgelaugten Medium zu wachsen, werden selektiert. Vorzugsweise gehört die Hefepopulation derselben Spezies und in noch stärker bevorzugter Weise demselben Stamm an wie die erste Mikroorganismenpopulation, die das ausgelaugte Medium geformt hat.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfaßt die Erfindung ein Selektionsverfahren für Mikroorganismen, welche hohe Mengen Riboflavin produzieren. Dieses Verfahren schließt die Mutation einer Ausgangspopulation von Mikroorganismen ein. Die mutierte Population wird anschließend auf einem Nährmedium kultiviert, welches das Antibiotikum Tubercidin enthält, das wahrscheinlich den Purinstoffwechsel inhibiert. Das Tubercidin liegt in dem Nährmedium in Konzentrationen vor, welche ausreichen, um die Koloniebildung einiger Mikroorganismen in der mutierten Population zu inhibieren. Mikroorganismen mit der Fähigkeit, auf dem Tubercidinmedium Kolonien zu bilden, werden dann selektiert. Solche Organismen können auf Riboflavinüberproduktion hin untersucht werden. Es wurde gefunden, daß dieses Selektionsverfahren eine Auswahl Riboflavin überproduzierender Organismen gestattet.
- Eine andere Ausführungsform der Erfindung schließt ein Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch die Kultivierung von Stämmen von erfindungsgemäßen Mikroorganismen in einem Fermentationsmedium ein. Gesteigerte Riboflavinproduktion kann durch Eisenkonzentrationen im Medium zwischen 5,4 uM und 15 uM erzielt werden. Das Fermentationsmedium umfaßt außerdem Glycin in Konzentrationen von bis zu 7 g/l.
- Die Fermentation wird durchgeführt, indem man zur Unterstützung des Zellwachstums und der Riboflavinproduktion entsprechende Nährstoffkonzentrationen im Medium und andere Fermentationsbedingungen aufrecht hält. Nach Rückgang des Zellwachstums wird das Riboflavin aus dem Fermentationsmedium gewonnen.
- Stämme einer Riboflavin produzierenden Hefe der Spezies C.flareri wurden entwickelt, welche erhöhte Mengen Riboflavin produzieren. Ausbeuten von über 10 Gramm Riboflavin pro Liter Medium in 144 Stunden werden routinemäßig erreicht und es sind sogar Ausbeuten von über 20 Gramm Riboflavin pro Liter in 200 Stunden erreicht worden. Die erfindungsgeinäßen Stämme sind dreißig- bis vierzigmal flavinogener als C.flareri vom Wildtyp und drei- bis eineinhalbmal flavinogener als die bislang bekannten leistungsfähigsten Riboflavinproduzenten.
- Insbesondere der Stamm A mit der ACTT-Eingangsnummer 20849 kann über 20 Gramm Riboflavin in einem 200 stündigen Fermentationslauf produzieren. Aus dem Stamm A sind verschiedene Stämme entwickelt worden, die noch flavinogener als Stamm A sind, wie nach einem 2 ml-Rolfröhrchen-Riboflavin-Test bestimmt wurde. Dieser Test, der im Detail im Rahmen der Beispielen beschrieben wird, ist nicht dafür geeignet, die Riboflavinausbeute zu maximieren, sondern wird dazu verwendet, die Flavinogenese der Organismenstämme unter identischen Bedingungen miteinander zu vergleichen. Stamm B, ACTT-Eingangsnummer 20850, wurde aus Stamm A entwickelt und ist im Rollröhrchentest fünfzig Prozent flavinogener als Stamm A.
- Die erfindungsgemäßen Stämme von C.flareri weisen verringerte Empfindlichkeit der Riboflavinsynthese gegenüber der Eiseninhibition auf. Wie oben diskutiert, ist beschrieben worden, daß Eisen in vielen Organismen ein Inhibitor der Riboflavinsynthese ist, insbesondere in Spezies der Hefe Candida. Es wurde nun gefunden, daß erhöhte Eisenkonzentrationen im Fermentationsmedium nicht nur das Zellwachstum der erfindungsgemäßen C.flareri Stämme steigern, sondern auch die Riboflavinproduktion pro Zellmasse. Während angenommen wurde, daß das Riboflavin mit dem aufgrund der erhöhten Eisenkonzentrationen gesteigerten Zellwachstum vermehrt gebildet wird, war der beobachtete Riboflavinzuwachs größer als der aufgrund des gesteigerten Zellwachstums allein erwartete. Demzufolge ist die Flavinogenese der erfindungsgemäßen, Eisen resistenten Stämme nicht nur unempfindlich gegenüber der Inhibition durch Eisen, sondern wird durch höhere Eisenkonzentrationen auf einer Basis pro Zelle sogar stimuliert.
- Eine Stimulation der Riboflavinproduktion für die erfindungsgemäßen Stämme von C.flareri wurde bei Eisenkonzentrationen von etwa 3,6 Mikromol (uM) entdeckt. Oberhalb von Konzentrationen von ungefähr 16,1 uM neigt Eisen jedoch dazu, die Riboflavinsynthese selbst dieser Stämme zu inhibieren. Während der Fermentation sind molare Eisenkonzentrationen zwischen etwa 5,4 uM und ungefähr 15 uM bevorzugt, stärker bevorzugt zwischen etwa 6,12 uM und circa 12 uM und am meisten bevorzugt zwischen etwa 9,8 uM und 10,8 uM.
- Eine weitere wichtige Besonderheit des Stammes A und seiner Nachfahren ist seine Resistenz gegen die Inhibition der Riboflavinproduktion in einem Fermentationsmedium, in dem eine Kultur bis auf eine endgültige Zelldichte herangewachsen ist. Ein solches Medium wird als "ausgelaugtes Medium" bezeichnet. Diese Resistenz erlaubt durch das Erreichen höherer Zelldichten die Produktion höherer Riboflavinausbeuten. Es wurde außerdem gefunden, daß diese Stämme gesteigerte Riboflavinausbeuten auf Zellbasis ergeben.
- Die Diskussion der Erfindung wird hier auf die Hefe C.flareri bezogen. C.flareri ist auch als Torulopsis candida bekannt. Die erfindungsgemäßen Methoden und das Verfahren sind jedoch gleichermaßen auf andere Candida-Spezies sowie andere Riboflavin überproduzierende Hefen und Mikroorganismen anwendbar. Dementsprechend soll die Bezugnahme auf C.flareri die Erfindung nicht auf diese spezielle Spezies beschränken.
- Erfindungsgemäß werden verstärkt Riboflavin produzierende Stämme von Mikroorganismen durch Verfahren der Mutation einer Mikroorganismenkultur und Selektion von Stämmen mit verbesserten Eigenschaften der Riboflavinproduktion ausgewählt. Typischerweise werden mutierte Mikroorganismen auf einem festen, eine kleine Menge einer inhibierenden Verbindung enthalten Medium kultiviert. Die sich in Anwesenheit des Inhibitors bildenden Kolonien werden kultiviert und auf ihre Riboflavinproduktion getestet. Mikroorganismenstämme mit hoher Riboflavinproduktion werden dann selektiert.
- Die Mutagenese von Mikroorganismenkulturen kann mit jedem der verschiedenen, dem Stand der Technik bekannten Hilfsmittel durchgeführt werden und kann sowohl die chemische als auch die physikalische Mutagenese umfassen. Beispielsweise schließen die erfindungsgemäßen, chemischen Mutagene N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Diepoxybutan, Ethylmethansulfonat, Senfgasverbindungen, Hydrazin und Salpetersäure ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Physikalische Mutagene können UV- und Gammastrahlung einschließen, sind aber nicht auf sie beschränkt. Eine Ausgangskultur wird einem Mutagen in einer solchen Intensität ausgesetzt, daß eine Population bestimmter Größe überlebt. Diese Größe unterscheidet sich in bezug auf das Mutagen und hängt von der Anzahl an Mutationen ab, die ein Mutagen in der überlebenden Population bei einer bestimmten Abtötungsrate induziert. Beispielsweise sollte die angestrebte Abtötungsrate für NTG in etwa 10-50% der Ausgangspopulation am Leben lassen. Die Mutagenese mit Salpetersäure sollte ungefähr 0,01-0,1% der Ausgangspopulation und UV-Mutagenese sollte circa 1,0% überleben lassen. Die auf diese Weise behandelten Zellen werden geerntet, gewaschen und in einem das Wachstum nicht unterstützenden Medium wie einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Diese Zellen können anschließend einem oder mehreren Selektionsverfähren unterworfen werden.
- Während der Entwicklung der Stämme A und B sind unter Einsatz der im folgenden beschriebenen Selektionsverfahren eine Anzahl intermediärer Stämme von Riboflavin überproduzierenden Stämmen von C.flareri selektiert worden. Stamm C, ACTT-Eingangsnummer 20755, wurde über eine Anzahl von Selektionsschritten aus einem Wildtyp von C.flareri entwickelt und ist in der Anmeldung mit der Serial Number 811 234 beschrieben. Stamm C ist ein Vorläufer der unten beschriebenen Stämme, einschließlich A und B. Stamm C kann gemäß dem Rollröhrchentest 1,1 g/l Riboflavin in 7 Tagen produzieren. Unter Verwendung von Stamm C als Ausgangsmaterial wurde ein Selektionsverfahren mittels eines Glukoseanalogons durchgeführt, um auf Riboflavin überproduzierende Mutanten zu selektieren.
- Erfindungsgemäß kann auf Riboflavin überproduzierende Mutanten durch Selektion von Mutanten, die gegen Glukoseanaloga resistent sind, selektiert werden. Von solchen Mikroorganismenstämmen wird angenommen, daß sie effizienter Glukose akkumulieren, Glukose in Riboflavin umwandeln oder eine Glukoserepression überwinden. Entsprechend wird eine Ausgangskultur Riboflavin produzierender Mikroorganismen, wie oben beschrieben, mutiert. Die mutierte Population wird dann auf ein Medium ausplatiert, welches inhibierende Konzentrationen von Glukoseanalogen oder deren Gemischen enthält. Lebensfähige Kolonien der ausplatierten, mutierten Zellen werden aufgrund ihrer Resistenz gegen die Inhibition durch Glukoseanaloga selektiert. Diese Kolonien werden anschließend auf Riboflavinproduktion hin getestet.
- Die Konzentration des Glukoseanalogons hängt von verschiedenen Faktoren ab; diese schließen die Inhibitionswirkung des Analogons und die anfängliche Sensibilität der Kultur gegen die Inhibition der Riboflavinproduktion durch das Analogon ein. Typischerweise wird ein "Experiment der minimalen inhibierenden Konzentration" durchgeführt, um die minimale Konzentration, bei der das Analogon das Wachstum der nicht mutierten Ausgangskultur inhibiert, zu bestimmen. Diese minimale Konzentration wird im allgemeinen für das Selektionsverfahren eingesetzt; es sei jedoch angemerkt, daß höhere Konzentrationen bis zu einer Konzentrationen, die sogar das Wachstum resistenter Mutanten inhibiert, verwendet werden können.
- Im Falle von 2-Desoxyglukose als Analogon werden Konzentrationen zwischen ungefahr 700 ug/ml und etwa 1500 ug/ml, stärker bevorzugt zwischen etwa 700 ug/ml und ungefähr 1000 ug/ml und am meisten bevorzugt zwischen circa 700 ug/ml und etwa 800 ug/ml angestrebt.
- Stamm D wurde durch ein Selektionsverfahren mittels eines Glukoseanalogons selektiert, wobei Stamm C die Ausgangspopulation bildete, die mutiert und aus der selektiert wurde. Stamm D kann gemäß dem 2 ml-Rollröhrchentest 1,58 g/l Riboflavin in 7 Tagen produzieren. Dieser Stamm wurde wiederum als Ausgangspopulation für ein Selektionsverfahren auf Eisensensibilität verwendet, um auf Riboflavin überproduzierende Mutanten zu selektieren.
- Wie bereits oben angesprochen, wird die Riboflavinproduktion durch kleine Mengen Eisen inhibiert. Es wurde nun gefunden, daß es wünschenswert wäre, einen Riboflavin produzierenden Mikroorganismenstamm mit verringerter Empfindlichkeit gegen die Inhibition durch Eisen zu entwickeln, da der Stamm in einem Medium mit hoher Eisenkonzentration kultiviert werden könnte, was wiederum ein gesteigertes Zellwachstum fördern wurde.
- Um auf Riboflavin produzierende Mutanten mit verringerter Eisensensibilität zu selektieren, wird eine Kultur auf obengenannte Weise mutiert. Die erhaltene Kultur wird auf einem festen Medium ausgebreitet, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Elemente zusammen mit hohen Eisenkonzentrationen enthält. Ein geeignetes Medium ist beispielsweise das mit 2,23% Glycin ergänzte YMG-Medium (siehe Tabelle 1). Die mutierten Zellen werden auf diesem Medium bei einer für die Riboflavinproduktion geeigneten Temperatur herangezogen. Mutanten ohne gesteigerte Resistenz der Riboflavinproduktion gegenüber der Inhibition durch Eisen bilden weiße oder cremefarbene Kolonien, da Riboflavin nicht überproduziert wird. Mutantenkolonien mit erhöhter Resistenz der Riboflavinproduktion gegenüber der Inhibition durch Eisen sind aufgrund der Anwesenheit von Riboflavin gelb. Diese gelben Kolonien können auf leistungsfähige Riboflavin Überproduzenten getestet werden.
- Hefeextrakt 3 g/l
- Malzextrakt 3 g/l
- Pepton 5 g/l
- Kohlenstoffquelle (2%) 20 g/l.
- Die Eisenkonzentration während des Selektionsverfahrens hängt unter anderem von der Eisenempfindlichkeit der Ausgangspopulation ab. Falls beispielsweise das Verfahren auf Eisenempfindlichkeit mit einer Ausgangspopulation aus Wildtyp C.flareri ausgeführt würde, wäre die Eisenkonzentration geringer als in dem Fall, wenn die Ausgangspopulation ein Stamm von C.flareri wäre, der schon auf verringerte Sensibilität gegen die Inhibition der Riboflavinproduktion durch Eisen selektiert worden ist. Wie schon oben mit Bezug auf das Selektionsverfahren mittels eines Glukoseanalogons dargelegt wurde, wird die Eisenkonzentration üblicherweise durch ein Experiment der minimalen inhibierenden Konzentration ausgewählt. Erfindungsgemäß sind molare Eisenkonzentrationen zwischen etwa 5 uM und etwa 50 uM und in stärker bevorzugter Weise zwischen etwa 10 uM und etwa 30 uM und in am meisten bevorzugter Weise zwischen etwa 16 uM und etwa 20 uM für die Selektion in Richtung verringerter Eisenempfindlichkeit wirksam.
- Stamm E wurde über das Eisensensibilitätsverfahren mit Stamm D als Ausgangspopulation selektiert. Stamm E kann gemäß dem 2 ml-Rollröhrchentest 1,70 g/l Riboflavin in 7 Tagen produzieren. Dieser Stamm wurde als Ausgangspopulation in einem Selektionsverfahren mittels ausgelaugtem Medium eingesetzt, um auf Riboflavin überproduzierende Mutanten zu selektieren.
- Riboflavin-Überproduzenten können durch ihre Resistenz gegen Wachstumsinhibition auf einem ausgelaugten Medium selektiert werden. Es ist bekannt, daß in geschlossenen biologischen Systemen wie Labor-Hefekulturen Zellwachstum und Produktion von Bioprodukten eventuell zum Stillstand kommen, sogar in Anwesenheit eines Überschusses an Nährstoffen. Während die Ursachen für den Stopp des Zellwachstums und der Riboflavinproduktion für C.flareri nicht bekannt sind, wird angenommen, daß drei Gründe, mindestens teilweise dafür verantwortlich sind. So wird angenommen, daß die meisten Organismen Spurenelemente unterhalb einer bestimmten Konzentration nicht effizient nutzen können. Deshalb wird, wenn diese Spurenelemente bis auf eine bestimmte Konzentration aufgebraucht sind, das Wachstum inhibiert. Der zweite mögliche Grund dafür ist, daß während der Wachstums- und der Riboflavinproduktionsphasen Substanzen als Nebenprodukte produziert werden, die das weitere Wachstum und die Riboflavinproduktion inhibieren. Ein dritter möglicher Grund ist der, daß hohe Konzentrationen zugeführter oder nicht genutzter Bestandteile des Mediums das Wachstum unterdrücken können. Das Selektionsverfahren ist auf die Selektion von Mikroorganismen gerichtet, die auf ausgelaugten Medien wachsen und Riboflavin produzieren können. Es wird angenommen, daß diese Mikroorganismen in geringen Mengen vorhandene Spurenelemente effektiver nutzen können und/oder daß sie gegen während der Wachstums- und Riboflavinproduktionsphasen produzierte, inhibierende oder reprimierende Verbindungen resistent sind. Die selektierten Organismen sind sehr wertvoll, da bei gegebenem Ausgangsmedium und Fermentationsbedingungen sowohl Zellwachstum als auch Riboflavinproduktion länger aufrechterhalten werden, um höhere Ausbeuten bei der Riboflavinproduktion zu ergeben.
- Gemäß dem Selektionsverfahren mittels eines ausgelaugten Mediums wird ein ausgelaugtes Medium gewonnen, indem eine anfängliche Mikroorganismenkultur herangezogen wird, bis das Zellwachstum zum Stillstand kommt oder sich verlangsamt, und stärker bevorzugt, bis in die späte stationäre Phase. Bevorzugterweise wird das ausgelaugte Medium durch Kultivierung derselben Spezies und vorzugsweise desselben Stammes gewonnen, der in dem Selektionsschritt selektiert werden soll.
- Während jeder Mikroorganismus Spurenelemente erschöpft und inhibitorische Verbindungen produziert, ist die Selektion jedoch am wirkungsvollsten, wenn die mutierte Population, die selektiert wird, dem selben vom ausgelaugten Medium verursachten Umweltstreß ausgesetzt wird, der die anfängliche Kultur dazu veranlaßte, nicht weiterzuwachsen. Falls sich die anfängliche Population von der mutierten unterscheidet, kann das Wachstum der anfänglichen Population durch Erschöpfung der Spurenelemente oder durch Produktion inhibierender oder reprimierender Verbindungen begrenzt werden, welche die mutierte Population keinem Streß aussetzen.
- Nachdem das Wachstum und die Metabolitproduktion der anfänglichen Kultur zum Stillstand gekommen sind, werden die Zellen zur Gewinnung des ausgelaugten Mediums aus der Kultur entnommen. Beispielsweise können die Zellen durch Zentrifugation aus dem Medium entfernt werden. Alternativ dazu können die Zellen durch Ultrafiltration entfernt werden.
- Unter Verwendung des oben beschriebenen, ausgelaugten Mediums wird ein Selektionsmedium hergestellt. Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Nährstoffe können dem ausgelaugten Medium zum Erhalt eines Selektionsmediums zur Selektion auf Stämme zugesetzt werden, die gegen ausgelaugte Medien resistent sind. Die Menge und Art der einem ausgelaugten Medium zuzusetzenden Nährstoffe kann variieren. Z.B. können dem ausgelaugten Medium eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle wie Saccharose und Glycin zugesetzt werden. Alternativ dazu kann das ausgelaugte Medium in wechselnden Anteilen mit einem Nährmedium wie einem 4B Medium (siehe Tab. 2) gemischt werden. Die relativen Anteile von ausgelaugtem Medium und Nährmedium können durch Ausführen eines Experimentes der minimalen inhibierenden Konzentration bestimmt und die geringste Menge an ausgelaugtem Medium, die gerade noch das Wachstum in einer nichtmutierten Population inhibiert, eingesetzt werden.
- KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g/l
- MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,2 g/l
- Harnstoff 1,84 g/l
- Saccharose 60 g/l
- D-Biotin 1 ug/l
- H&sub3;BO&sub4; 20 ug/l
- MnSO&sub4; 20 ug/l
- ZnSO&sub4; 140 ug/l
- CuSO&sub4; 20 ug/l
- Na&sub2;MoO&sub4; 20 ug/l.
- Das Selektionsverfahren wird durchgeführt, indem man eine Ausgangspopulation Riboflavin produzierender Mikroorganismen zum Erhalt einer mutierten Population einer Mutagenese, wie sie oben beschrieben ist, unterzieht. Die mutierte Population wird in das Selektionsmedium auf Basis des ausgelaugten Mediums eingebracht. Typischerweise sind Mikroorganismen, die keine Resistenz gegen die Inhibition durch ausgelaugte Medien haben, auf dem Selektionsmedium nicht lebensfähig. Kolonien, die sich auf dem Selektionsmedium auf Basis eines ausgelaugten Mediums bilden, werden aufgrund ihrer gesteigerten Resistenz gegen ausgelaugte Medien selektiert. Die selektierten Kolonien werden anschließend auf Riboflavinproduktion getestet.
- Stamm A wurde durch das Selektionsverfahren mittels ausgelaugten Mediums unter Verwendung von Stamm E als Ausgangspopulation selektiert. Die Zellen wurden zur Gewinnung des ausgelaugten Mediums durch Zentrifugation aus der anfänglichen Kultur entfernt. Das ausgelaugte Medium wurde sterilisiert und etwaige verbliebene Zellen durch Filtration mit einem 0,5 um-Membranfilter entfernt. Das Selektionsmedium wurde durch Zugabe von Saccharose und Glycin zum Überstand gebildet. Stamm A kann gemäß dem Rollröhrchentest 2,5 g/l Riboflavin produzieren. Ein zusätzliches Selektionsverfahren auf ausgelaugtem Medium wurde ausgeführt, wobei Stamm A als Ausgangspopulation eingesetzt wurde.
- Dieses zweite Selektionsverfahren auf ausgelaugtem Medium ergab Stamm F, der nach dem 2 ml-Rollröhrchentest 3,4 g/l Riboflavin in 7 Tagen produzieren kann. Bei diesem Selektionsverfahren wurden die Zellen mittels Filtration durch einen 0,5 um-Membranfilter aus dem ausgelaugten Medium entfernt und das Selektionsmedium aus 50% ausgelaugtem Medium und 50% 4B Medium gebildet. Stamm F wurde dann als Ausgangspopulation für ein Tubericidin als Selektionsmittel verwendendes Selektionsverfahren eingesetzt.
- Mit Hilfe eines anderen Selektionsverfahren auf Riboflavin überproduzierende Mutanten werden Mikroorganismen selektiert, welche gegen die Wachstumsinhibition durch Purinanaloga und insbesondere Tubericidin resistent sind. Diese Verbindungen inhibieren vermutlich den Purinstoffwechsel; und interferieren im Hinblick auf die Tatsache, daß Purine Vorläufer des Riboflavins sind, mit der Riboflavinproduktion. Viele bekannte Purinanaloga sind zur Untersuchung des Purinstoffwechsels eingesetzt worden, aber keine Literaturquelle hat bislang die erfolgreiche Verwendung von Purinanaloga bei der Selektion von Riboflavin-Überproduzenten beschrieben. Darüber hinaus ist bisher keine Publikation der Verwendung von Tubericidin zur Untersuchung des Purinstoffwechsels oder zur Selektion von Riboflavin-Überproduzenten bekannt.
- Es wurde ermittelt, daß Riboflavin produzierende Stämme, die in Anwesenheit von Tubericidin wachsen und Riboflavin produzieren, eine gesteigerte Fähigkeit zur Riboflavinproduktion aufweisen können. Diese tubericidinresistenten Stämme haben die Fähigkeit Purine vermehrt oder effizienter zu bilden. Gemäß diesem Selektionsverfahren wird eine Kultur Riboflavin produzierender Mikroorganismen, wie oben beschrieben, mutiert. Die überlebende Population wird auf einem Medium ausplatiert, welches assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Elemente zusammen mit Tubericidin enthält. Von der ausplatierten Population werden die lebensfähigen Kolonien selektiert. Diese Kolonien werden dann auf Riboflavinproduktion getestet.
- Die im Selektionsverfahren verwendete Tubericidinkonzentration hängt von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Sensibilität der Ausgangspopulation gegenüber der Inhibition, ab. Wie oben angesprochen, kann eine geeignete Konzentration durch Ausführung eines Experimentes der minimalen inhibierenden Konzentration bestimmt werden, wobei die niedrigste Tubericidinkonzentration, die das Wachstum einer nichtmutierten Population hemmt, bestimmt wird. Es ist zu bemerken, daß höhere Tubericidinkonzentrationen bis hinauf zu einer Konzentration, die sogar das Wachstum resistenter Mutanten inhibiert, eingesetzt werden können. Während die Tubericidinkonzentration variieren kann, liegt die Konzentration in dem Selektionsverfahren üblicherweise zwischen etwa 85 ug/ml und etwa 200 ug/ml, in bevorzugter Weise zwischen ungefähr 85 ug/ml und etwa 150 ug/ml und in am meisten bevorzugter Weise zwischen ungefähr 85 ug/ml und circa 115 ug/ml.
- Stamm B wurde in dem Tubericidin verwendenden Selektionsverfahren unter Einsatz von Stamm F als Ausgangspopulation selektiert. Stamm B kann gemäß dem 2 ml-Rollröhrchentest 3,8 g/l Riboflavin in 7 Tagen produzieren. Stamm G wurde ebenso durch das Tubericidinselektionsverfahren unter Verwendung von Stamm A als Ausgangspopulation selektiert. Die Kapazität zur Riboflavinproduktion von Stamm G beträgt 2,9 g/l gemäß dem 2 ml-Rolfröhrchentest. Stamm G wurde als Ausgangspopulation für ein Selektionsverfahren aufgrund Empfindlichkeit gegen UV-Licht verwendet.
- Die verschiedenen, oben beschriebenen Selektionsverfahren selektieren auf Riboflavin überproduzierende Mutanten durch Einbringen einer mutierten Population Riboflavin produzierender Mikroorganismen in ein Medium, welches die Riboflavinproduktion in gewisser Weise inhibiert. Zusätzlich zur Selektion von Mikroorganismen mit hohen Produktionsraten für Riboflavin ist es wünschenswert, eine Riboflavin überproduzierende Mutante mit stabilen Riboflavinproduktionsraten zu erhalten. Die erfindungsgemäßen, spezifischen Stämme von C.flareri sind von dem Ergebnis eines Zell-Zell-Fusionsverfahrens abgeleitet, welches vor der Entwicklung des Stammes C ausgeführt wurde und in der Serial Number 811 234 beschrieben ist. Zellfusionsprodukte besitzen viele Kopien der Chromosomen, von denen Teile mit der Zeit wahrscheinlich durch Genumbau aufgrund der Redundanz verloren gehen. Zellfusionsprodukte, welche im Hinblick auf Riboflavinüberproduktion selektiert wurden, haben wahrscheinlich vielfache Genkopien. Die Kapazität der Überproduktion kann leicht verloren gehen, wenn diese Organismen genetisch instabil sind. Es ist daher erwünscht, Riboflavin überproduzierende Mutanten mit verringerter Fähigkeit zum Chromosomenumbau zu selektieren.
- Bei Bakterien sowie Saccharomyces cervisiae sind Mutanten erhalten worden, denen die Fähigkeit zum DNA-Umbau fehlt, siehe Clark et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, S. 451 (1965); Mazza et al., Microbiologica, 1, S. 111 (1978); Haynes et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, 371 (1981). Einige Typen dieser Mutanten können durch Selektion auf erhöhte Sensibilität gegenüber Mutagenen wie UV-Licht erhalten werden. Von Stämmen Riboflavin überproduzierender Mikroorganismen und insbesondere von Zellfusionsprodukten, die auf ihre Empfindlichkeit gegen UV-Licht selektiert werden, wird angenommen, daß sie ein erhöhtes Maß an Stabilität der Riboflavinproduktion aufweisen.
- Das Selektionsverfahren auf Empfindlichkeit gegen UV-Licht wird ausgeführt, indem man eine Ausgangskultur von Mikroorganismen, wie oben beschrieben, der Mutagenese unterzieht. Die Zellsuspensionen werden auf ein Medium, z. B. YMG-Medium, in einer Verdünnung so ausplatiert, daß zwischen etwa 100 und etwa 400 Kolonien pro Platte und stärker bevorzugt zwischen etwa 150 und etwa 200 Kolonien pro Platte erhalten werden. Nach dem Sichtbarwerden der Kolonien, werden die Koloniemuster zweimal auf frische Agarplatten übertragen. Sichtbar sind Kolonien mit einem Durchmesser zwischen etwa 0,5 mm und 1,0 mm. Der erste Abklatsch wird offen UV-Licht in für nichtmutierte Zellen subletaler Intensität ausgesetzt. Eine geeignete Intensität an UV- Licht kann bestimmt werden, indem man Kolonien nichtmutierter Zellen verschiedenen Dosen UV-Licht aussetzt und die Intensität bestimmt, welche die Zellen nicht abtötet. Für eine nichtmutierte Kultur von C.flareri liegt eine subletale Dosis UV-Licht zwischen etwa 5 Joule pro Quadratmeter (J/m²) und etwa 20 J/m², und stärker bevorzugt zwischen etwa 10 J/m² und circa 15 J/m². Der bestrahlte und der nichtbestrahlte Abklatsch werden zur Koloniebildung inkubiert. Die bestrahlte Platte muß dabei im Dunkeln gehalten werden, damit das sichtbare Licht nicht den Effekt des UV-Lichtes rückgängig macht. Sichtbares Licht hat erwiesenermaßen die Wirkung, durch Bestrahlung verursachte genetische Schäden zu reparieren. Nachdem die Kolonien sichtbar geworden sind, wird der bestrahlte Abklatsch mit der unbestrahlten Platte auf die Anwesenheit von Kolonien hin verglichen, die auf der unbestrahlten Platte vorhanden sind, aber auf der bestrahlten Platte fehlen. Auf diese Weise werden Kolonien mit erhöhter Empfindlichkeit gegenüber UV-Licht ermittelt.
- Stamm H wurde über das Selektionsverfahren auf UV-Empfindlichkeit unter Verwendung von Stamm G als Ausgangspopulation selektiert. Stamm H hat im 2 ml-Rollröhrchentest eine Riboflavinproduktionskapazität von 3,1 g/l in 7 Tagen.
- Riboflavin kann durch Fermentation der Stämme A und B sowie anderer durch die obigen Verfahren selektierter Mikroorganismen hergestellt werden. Es liegt für den Fachmann auf der Hand, daß höhere Riboflavinausbeuten mit der Kultur eines bestimmten Stammes erzielt werden können, wenn diese Kultur im wesentlichen frei von Verunreinigungen mit Mikroorganismen anderer Stämme ist, die in geringeren Mengen Riboflavin produzieren. Solch biologisch reinen Kulturen können durch Heranziehen einer Kultur aus nur einem Mikroorganismus des erwünschten Stammes gebildet werden.
- Die Riboflavinproduktion der Stämme A und B sowie der über die obigen Verfahren selektierter Mikroorganismen kann schwanken, wenn verschiedene Fermentationsmedien und -verfahren eingesetzt werden. Während in der Fachwelt viele Fermentationsverfahren bekannt sind, wurden ein Fermentationsmedium und ein -verfahren entwikkelt, die konstant hohe Wachstumsraten und konstant hohe Riboflavinproduktion ergeben. Das für die Riboflavinproduktion durch die Stämme A und B bevorzugte Fermentationsmedium ist in Tabelle 3 aufgelistet.
- Glukose 60,0 (g/l)
- Glycin 4,60 (g/l)
- Harnstoff 3,68 (g/l)
- KH&sub2;PO&sub4; 1.00 (g/l)
- MgSO&sub4; 0.72 (g/l)
- CoSO&sub4;·7H&sub2;O 11.8 (mg/l)
- CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0.020 (mg/l)
- H&sub3;BO&sub3; 0.020 (mg/l)
- (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4; 0.140 (mg/l)
- MnSO&sub4; 0.020 (mg/l)
- ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 17.0 (mg/l)
- FeSO&sub4;·7H&sub2;O 2.0 (mg/l)
- Biotin 0,0118.
- Alle Bestandteile des Mediums außer der Glukose wurden in einen Behälter sterilfiltriert. Die Glukose (630 g/l) wird 30 Minuten bei 121ºC und 15 psi autoklaviert. Das Fermentorvolumen beträgt am Anfang in einem 14 l-Fermenter 10,5 Liter. Der pH des Mediums wird vor dem Beimpfen auf 6,9-7,0 eingestellt.
- Im allgemeinen schließt das Medium Kohlenstoff-, Stickstoff, Phosphat-, Sulfat-, Magnesium-, Kalium- und Eisenquellen sowie andere Spurenmetalle ein. Die in Tabelle 3 angegebenen Konzentrationen stellen die anfänglichen Konzentrationen der Komponenten dar und nicht die minimalen Konzentrationen, die während der Fermentation aufrechterhalten werden müssen. Es wäre noch anzumerken, daß einige Komponenten anfänglich nicht in ausreichend hohen Mengen bereitgestellt werden können, um im Verlauf der gesamten Fermentation zur Verfügung zu stehen. Auf diese Komponenten hin muß das Fermentationsmedium überwacht und deren Minimalkonzentration aufrechterhalten werden.
- Obwohl Glukose als bevorzugte Kohlenstoffquelle im vorliegenden Fermentationsmedium aufgeführt ist, können andere Kohlenstoffquellen denselben Zweck genauso gut erfüllen. Beispielsweise sind Saccharose und Fruktose für das Medium geeignet. Weiterhin sind andere Kohlenstoffquellen, die nicht in Form von Zucker vorliegen, wie einige Alkohole, geeignet. Die Anfangskonzentration von Glukose in dem Fermentationsmedium sollte zwischen etwa 45 g/l und etwa 60 g/l, in bevorzugterer Weise zwischen ungefähr 50 g/l und etwa 60 g/l und in am meisten bevorzugter Weise zwischen circa 55 g/l und etwa 60 g/l liegen.
- Das Fermentationsmedium enthält außerdem Glycin. Glycin ist eine für die Riboflavinproduktion kritische Komponente des Fermentationsmediums. Während Glycin für die Riboflavinproduktion essentiell ist, inhibiert ein Überschuß an Glycin das Wachstum von C.flareri. Bei Konzentrationen oberhalb von 7 g/l kommt das Zellwachstum zum Erliegen. Bei sehr geringen Glycinkonzentrationen in der Größenordnung von etwa 0,5 g/l ist das Glycin aus dem Medium sehr rasch aufgebraucht. Akzeptable anfängliche Glycinkonzentrationen liegen zwischen etwa 2 g/l und circa 6 g/l, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 4 g/l und etwa 6 g/l und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 4 g/l und etwa 5 g/l.
- Durch die Zugabe von Harnstoff wird dem Fermentationsmedium Stickstoff zur Unterstützung des Wachstums zugesetzt. Die Anfangskonzentration von Harnstoff im Fermentationsmedium sollte zwischen etwa 2 g/l und circa 9 g/l, in bevorzugterer Weise zwischen ungefähr 3 g/l und etwa 7 g/l und in am meisten bevorzugter Weise zwischen etwa 3 g/l und etwa 7 g/l liegen. Andere Stickstoffquellen sind für die Verwendung in dem vorliegenden Fermentationsmedium ebenfalls geeignet. Optimale Konzentrationen dieser anderen Quellen können bestimmt werden, indem man Testfermentationen bei verschiedenen Konzentrationen der Stickstoffquelle unter ansonsten gleichen Bedingungen ausführt und die höchste Riboflavinproduktion bestimmt.
- Phosphat wird dem Fermentationsmedium durch Zugabe von monobasischem Kaliumphosphat (KH&sub2;PO&sub4;) zur Verfügung gestellt. KH&sub2;PO&sub4; wird am Anfang in dem Fermentationsmedium in einer Konzentration von zwischen 0,5 g/l und etwa 2,0 g/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,75 g/l und circa 1 ,5 g/l und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 0,85 g/l und etwa 1,15 g/l bereitgestellt. Kalium wird für das Wachstum benötigt; aber bei den Konzentrationen, bei denen ausreichend Phosphat zugegeben wird, liegt das zugegebene Kalium weit oberhalb der Nährstoffanforderungen der Kultur. Obwohl das Phosphat in anderen Formen wie Natriumphosphat zugesetzt werden kann, wird Kaliumphosphat bevorzugt, da gleichzeitig der Nährstoffbedarf an Kalium erfüllt wird.
- Das Fermentationsmedium enthält auch Magnesiumsulfat (MgSO&sub4;) als Sulfatquelle. Das Fermentationsmedium enthält diese Komponente am Anfang in Konzentrationen zwischen etwa 0,5 g/l und circa 1 g/l, in bevorzugterer Weise zwischen ungefähr 0,6 g/l und etwa 0,8 g/l und in am meisten bevorzugter Weise zwischen etwa 0,65 g/l und ungefähr 0,75 g/l. Obwohl die Fermentationskultur einen Nährstoffbedarf an Magnesium hat, liegt es bei diesen Konzentrationen, in denen das Magnesium zur Verfügung gestellt wird, weit oberhalb des Bedarfs. Das Sulfat kann auch in anderen Formen als Magnesiumsulfat zugeführt werden.
- Das Fermentationsmedium enthält weiterhin eine Reihe Quellen für Spurenmineralien, welche Kobalt, Kupfer, Bor, Molybdän, Mangan, Zink und Eisen einschließen. Das Fermentationsmedium stellt Anforderungen in bezug auf jedes dieser Elemente; diese können durch die Anfangskonzentrationen der die Spurenmineralien enthaltenden Verbindungen leicht erfüllt werden und machen keine weiteren Zugaben während der Fermentation erforderlich. Obwohl viele der Spurenmineralien als Sulfate zur Verfügung gestellt werden, leistet die Menge Sulfat, die durch diese Verbindungen zugegeben wird, keinen signifikanten Beitrag zum Gesamtbedarf an Sulfat der Fermentation.
- Kobalt wird dem Fermentationsmedium in Form des Kobaltsulfatheptahydrates zur Verfügung gestellt (CoSO&sub4;·7H&sub2;O). Die Anfangskonzentration dieser Verbindung liegt zwischen etwa 10 mg/l und etwa 13 mg/l, stärker bevorzugt zwischen ungefähr 11 mg/l und circa 12 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 11,5 mg/l und etwa 12 mg/l. Kobalt hat außerdem den positiven Effekt, daß es mit Eisen konkurriert und jeden inhibitorischen Effekt des Eisens auf die Riboflavinsynthese verringert.
- Kupfer wird dem Fermentationsmedium in Form des Kupfersulfatpentahydrates zugesetzt (CuSO&sub4;·5H&sub2;O). Diese Verbindung wird dem Fermentationsmedium am Anfang in Konzentrationen zwischen etwa 0,015 mg/l und circa 0,025 mg/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,017 mg/l und etwa 0,023 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,018 mg/l und etwa 0,022 mg/l zugesetzt. Kupfer tritt ebenfalls mit Eisen in Wettbewerb, mit der Folge, daß der inhibierende Effekt des Eisens auf die Riboflavinsynthese zu verringert wird.
- Zink wird dem Fermentationsmedium in Form des Zinksulfatheptahydrates zugesetzt (ZnSO&sub4;·7H&sub2;O). Diese Verbindung wird dem Fermentationsmedium am Anfang in Konzentrationen zwischen etwa 15 mg/l und circa 20 mg/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 16 mg/l und etwa 19 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 16 mg/l und etwa 18 mg/l zugesetzt. Zink tritt ebenfalls mit Eisen in Wettbewerb, mit der Folge, daß der inhibierende Effekt des Eisens auf die Riboflavinsynthese zu verringert wird.
- Das Fermentationsmedium enthält außerdem eine Eisenquelle in Form des Eisensulfatheptahydrates (FeSO&sub4;·7H&sub2;O), um den Nährstoffbedarf an Eisen der Fermentation zu decken. Die Anfangskonzentration dieser Verbindung im Fermentationsmedium beträgt etwa 1,5 mg/l und etwa 4,0 mg/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 1,7 mg/l und etwa 3,0 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 1,9 mg/l und etwa 2,3 mg/l.
- Bor wird dem Fermentationsmedium in Form von Borsäure (H&sub3;BO&sub4;) zugesetzt. Borsäure wird dem Fermentationsmedium am Anfang in Konzentrationen zwischen etwa 0,015 mg/l und etwa 0,025 mg/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,017 mg/l und etwa 0,023 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,019 mg/l und etwa 0,021 mg/l zugefügt. Bor kann dem Fermentationsmedium auch in anderer Form zugesetzt werden, vorausgesetzt, daß das Bor in einer für die Zellen biologisch verfügbaren und nichttoxischen Form ist.
- Molybdän wird dem Medium in Form des Ammonium-(VI)-molybdats ((NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;) zugesetzt. Diese Verbindung wird in Konzentrationen zwischen etwa 0,12 mg/l und etwa 0,16 mg/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,13 mg/l und etwa 0,15 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,135 und etwa 0,145 mg/l zugesetzt.
- Mangan wird dem Fermentationsmedium in Form des Mangansulfates (MnSO&sub4;) zugesetzt. Die Verbindung wird in Konzentrationen zwischen etwa 0,015 mg/l und etwa 0,025 mg/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,017 mg/l und etwa 0,023 mg/l und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,019 mg/l und etwa 0,021 mg/l zugefügt.
- Das Fermentationsmedium enthält außerdem Biotin, ein von Hefen generell benötigtes Vitamin. Dieses Vitamin wird in Konzentrationen oberhalb von etwa 0,005 mg/l, in bevorzugterer Weise oberhalb von etwa 0,009 mg/l und am meisten bevorzugt oberhalb von etwa 0,0118 mg/l eingesetzt.
- Wie oben angesprochen, werden einige der Komponenten im Verlauf der Fermentation erschöpft. Bevorzugterweise wird die Fermentation mit relativ hohen Konzentrationen solcher Komponenten gestartet, damit das Wachstum für eine gewisse Zeit anhält, bevor etwaige Zugaben erforderlich werden. Die bevorzugten Konzentrationsbereiche dieser Komponenten werden im Verlauf der Fermentation durch Zugaben in dem Maße, wie die Stoffe erschöpft werden, aufrechterhalten. Der jeweilige Gehalt der Komponenten im Fermentationsmedium kann überwacht werden, beispielsweise, indem man dem Fermentationsmedium periodisch Proben entnimmt und auf die Komponenten hin analysiert. Alternativ können, sobald ein Standardfermentationsverfahren entwickelt ist, Zugaben in Zeitintervallen erfolgen, die den jeweiligen bekannten Gehalten im Verlauf der Fermentation entsprechen. Wie Fachleuten bekannt sein dürfte, steigt die Verbrauchsgeschwindigkeit der Nährstoffe im Verlauf der Fermentation mit steigender Zelldichte an.
- Die Konzentrationen von Glukose, Glycin, Harnstoff und Phosphat werden während der Fermentation überwacht. Die Glukosekonzentration wird kontrolliert und zwischen etwa 20 g/l und etwa 60 g/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 20 g/l und etwa 40 g/l und am meisten bevorzugt bei etwa 30 g/l aufrechterhalten. Diese Glukosekonzentrationen können in dem Fermentationsmedium durch Zuführen eines konzentrierten Glukosezustromes mit einer Konzentration von etwa 600 g/l beibehalten werden.
- Die Glycinkonzentration wird kontrolliert und zwischen etwa 1 g/l und etwa 7 g/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 2 g/l und etwa 5 g/l und am meisten bevorzugt bei etwa 3 g/l aufrechterhalten. Diese Glycinkonzentrationen können in dem Fermentationsmedium durch Zufürung eines konzentrierten Glycinzustromes mit einer Konzentration von etwa 200 g/l beibehalten werden.
- Die Harnstoffkonzentration wird ebenfalls kontrolliert und zwischen etwa 1 g/l und etwa 9 g/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 2 g/l und etwa 5 g/l und am meisten bevorzugt bei etwa 3 g/l aufrechterhalten. Diese Harnstoffkonzentrationen können in dem Fermentationsmedium durch Zuführung eines konzentrierten Harnstoffzustromes mit einer Konzentration von etwa 100 g/l beibehalten werden.
- Die Phosphatkonzentration (PO&sub4;) im Fermentationsmedium wird zwischen etwa 0,03 g/l und etwa 0,3 g/l, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,05 g/l und etwa 0,2 g/l und am meisten bevorzugt bei etwa 0,1 g/l aufrechterhalten. Diese Konzentrationen können in dem Fermentationsmedium durch Zuführung eines konzentrierten Kaliumphosphatzustromes mit einer Konzentration von etwa 15,57 g/l beibehalten werden. Zusätzlich zur Aufrechterhaltung der Phosphatkonzentration durch Phosphatzugabe, wird auch die Sulfatkonzentration durch Zugabe von Magnesiumsulfat zum Fermentationsmedium aufrechterhalten, wobei das Magnesiumsulfat in der Phosphatzugabe mitenthalten ist. Das Magnesiumsulfat hat in dem Zustrom eine Konzentration von etwa 11,37 g/l.
- Es ist anzumerken, daß Glukose-, Glycin-, Harnstoff-, Phosphat- und Sulfatzugaben zugefügt werden, um bestimmte Konzentrationen dieser Komponenten im Fermentationsmedium zu erreichen oder beizubehalten. Dementsprechend sind die Konzentrationen der oben bereitgestellten Zugabeströme für die Erfindung weder kritisch noch begrenzend.
- Bei dem erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren wird ein Fermentationsmedium, wie es oben beschrieben ist, hergestellt. Dieses Medium wird mit einer Kultur Riboflavin produzierender Mikroorganismen beimpft, insbesondere mit Stämmen von C.flareri. Um eine erfolgreiche Fermentation zu erreichen, muß die Beimpfung eine Mindestbeimpfungsdichte etablieren. Es ist wohlbekannt, daß Fermentationsverfahren zum Voranbringen des Zellwachstums am Anfang eine minimale Beimpfungsdichte benötigen. Obwohl die minimale Beimpfungsdichte für das vorliegende Verfahren noch nicht bestimmt worden ist, wurde ermittelt, daß eine erfolgreiche Fermentation erzielt werde kann, wenn die Beimpfung anfänglich eine optische Dichte von etwa 0,06 bei 620 nm (1 cm Küvetten) erreicht. Höhere anfängliche Dichten bereitstellende Beimpfungen sind akzeptabel und verkürzen die Verzögerungszeit vor dem Zellwachstum. Bei anfänglichen Beimpfungsdichten unterhalb von etwa 0,06 wird die Verzögerungszeit vor Beginn des Zellwachstums verlängert und eventuell sogar eine minimale Beimpfungsdichte erreicht, die das Zellwachstum nicht mehr ermöglicht.
- Nachdem das Fermentationsmedium beimpft worden ist, läßt man die Fermentation ablaufen; dabei überwacht man und hält man die Konzentrationen von Glukose, Glycin, Harnstoff Phosphat und Sulfat, wie oben diskutiert. Während der gesamten Fermentation sollte die Temperatur des Mediums zwischen etwa 29ºC und etwa 31ºC, in stärker bevorzugter Weise zwischen 29.5ºC und etwa 30,1ºC und in am meisten bevorzugter Weise zwischen etwa 29,9ºC und etwa 30,1ºC gehalten werden.
- Der in dem Fermentationsmedium gelöste Sauerstoff muß oberhalb eines bestimmten Niveaus gehalten werden, um für die Nutzung durch die Mikroorganismen ausreichend Sauerstoff zur Verfügung zu stellen. Der Gehalt des Mediums an gelöstem Sauerstoff kann durch Belüftung und Rühren geregelt werden. Der Gehalt des Mediums an gelöstem Sauerstoff wird vorzugsweise über etwa 20% Sättigung und in stärker bevorzugter Weise über etwa 40% Sättigung gehalten.
- Der pH der Mediums wird vor dem Beimpfen eingestellt. Der pH des Mediums kann durch Zugabe verschiedener, bekannter Verbindungen wie KOH oder NaOH eingestellt werden. Der Anfangs-pH-Wert kann zwischen etwa 6 und etwa 8, stärker bevorzugt zwischen etwa 6,5 und etwa 7,5 und am meisten bevorzugt zwischen etwa 6,9 und 7,0 liegen. Es ist anzumerken, daß im Verlauf der Fermentation ungefähr zur selben Zeit, zu der ein starker Anstieg des Zellwachstums und des Riboflavin auftreten, der pH des Mediums drastisch absinkt. Diese Veränderung tritt auch parallel mit der erstmaligen Notwendigkeit der Zugabe von Phosphat, Glukose, Harnstoff und Glycin auf. Typischerweise wird die Ansäuerung des Mediums zwischen etwa 35 Std. und etwa 55 Std., noch typischer zwischen 40 Std. und etwa 50 Std. und in ganz typischer Weise zwischen etwa 42 Std. und etwa 48 Std. beobachtet.
- Üblicherweise fällt der pH-Wert des Mediums auf so niedrige Werte wie etwa 3,5 und typischerweise bis auf etwa 3,9 ab. Während der weiteren Fermentation bleibt der pH typischerweise zwischen etwa 3,9 und etwa 6,0, noch typischer zwischen etwa 3,9 und 5,5 und am typischen zwischen 3,9 und 5,1. Der pH des Mediums steigt dann üblicherweise wieder auf Werte zwischen etwa 5,0 und etwa 7,0 und noch typischer zwischen etwa 6,0 und etwa 7,0 an. Wenn der pH-Anstieg beobachtet wird, kommt im allgemeinen das Zellwachstum zum Erliegen.
- Die folgenden experimentellen Ergebnisse dienen der Erläuterung und sollen die Erfindung nicht beschränken.
- Eine Kolonie des Stammes B wurde in ein 2,5 ml des "ergänzten, definierten Mediums" (siehe Tab. I-A) enthaltendes Teströhrchen eingeimpft und 4 Tage unter leichtem Schütteln bei 30ºC wachsen gelassen. Teströhrchen mit 2 ml des ergänzten, definierten Mediums wurden mit 0,02 ml der Zuchtkultur beimpft und 7 Tage unter leichtem Schütteln bei 30ºC wachsen gelassen. Die Kulturen wurden um den Faktor 500 verdünnt und zum Auflösen der Riboflavinkristalle für 40 Minuten auf 60 bis 70ºC erhitzt. Die Absorption der gelösten Lösung betrug bei 445 nm 0,245. Dieser Wert wurde zur Korrektur um die Verdünnung mit 500 und mit 31,3 multipliziert, um eine Riboflavinkonzentration von 3,8·10³ mg/l oder 3,8 g/l zu ergeben.
- 4B ---
- Glycin 0,23%
- CoCl&sub2; 1 ug/ml
- ZnCl&sub2; 10 ug/ml
- FeCl&sub3;·6H&sub2;O 0,2 ug/ml
- YMG-Medium 10%
- Saccharose 6%
- Stamm C wurde bei einer NTG-Konzentration von 0, 10 mg/ml bei Raumtemperatur 60 Minuten lang der NTG-Mutagenese unterzogen. Die mutierten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die mutierten Zellen wurden auf einem ergänzten, definierten Medium ausplatiert, welches 750 mg/ml 2-Desoxyglukose enthielt. Nach 10 Tagen wurden 125 Kolonien resistenter Mutanten ermittelt und nach dem oben beschriebenen Rolfröhrchentest auf Riboflavinproduktion getestet. Stamm D war die produktivste Mutante mit einer Kapazität der Riboflavinproduktion von 1,58 g/l in 7 Tagen.
- Stamm D wurde auf die oben beschriebene Weise der NTG-Mutation mit einer NTG- Konzentration von 0,10 mg/ml 60 Minuten bei Raumtemperatur unterworfen. Die behandelten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in gleichen Volumina physiologischer Kochsalziösung suspendiert. Diese Kultur wurde auf ergänztem, definiertem Medium ausplatiert, welches außerdem 2,23% Glycin zur Bereitstellung von ausreichend Substrat für die Riboflavinsynthese und FeCl&sub3;·6H&sub2;O in einer Konzentration von 5 ug/ml enthielt. Nach 10tägiger Inkubation bei 30ºC wurden 25 Kolonien resistenter Mutanten ermittelt und gemäß dem Rollröhrchentest auf ihre Riboflavinproduktion getestet. Der Mutantenstamm E war der am meisten Riboflavin produzierende Stamm und wies eine Kapazität für die Riboflavinproduktion von 1,70 g/l in 7 Tagen auf.
- Stamm E wurde mit einer NTG-Konzentration von 0, 10 mg/ml bei Raumtemperatur 60 Minuten lang der NTG-Mutagenese unterzogen. Die behandelten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in gleichen Volumina physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Durch Heranziehen von Stamm E in ergänztem, definiertem Medium unter Schütteln bei 30ºC über 3 Wochen wurde ein ausgelaugtes Medium hergestellt. Aus dieser Kultur wurden die Zellen mittels Zentrifugation und Filtration über einen 0,5 mm- Membranfilter entfernt. Dem Überstand wurden Saccharose (6 Prozent), Glycin (0,23 Prozent) und Agar (2 Prozent) zugesetzt. Die mutierte Kultur aus Stamm E wurde auf diesem Medium ausplatiert und bei 30ºC 10 Tage lang inkubiert. 35 Kolonien mit gelber Farbe wurden ermittelt und gemäß dem Rolfröhrchentest auf ihre Riboflavinproduktion getestet. Aus diesem Selektionsverfahren wurde Stamm A entwickelt; er hat eine Kapazität der Riboflavinproduktion von 2,5 g/l in 7 Tagen.
- Stamm A wurde mit einer Konzentration von 0,10 mg/ml bei Raumtemperatur mit 60- minütiger Inkubation der NTG-Mutagenese unterzogen. Die behandelten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in gleichen Volumina physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
- Durch Heranziehen nichtmutierter Stamm A-Zellen in dem in Tabelle 3 beschriebenen Medium für 10 Tage bei 30ºC unter Rühren in einem 450 L-Fermenter wurde ein ausgelaugtes Medium gewonnen. Aus dieser Kultur wurden die Zellen mittels Ultrafiltration entfernt. Ein festes Selektionsmedium wurde hergestellt, wobei 50% des flüssigen Volumens aus zellfreiem, ausgelaugten Medium und 50% aus Wasser bestanden. Die mutierten Stamm A-Zellen wurden auf diesem festen Medium ausplatiert und 10 Tage bei 30ºC inkubiert. Sechzig Kolonien resistenter Mutanten wurden ermittelt und auf ihre Riboflavinproduktion getestet. Stamm F war der aus diesem Verfahren hervorgehende Stamm mit der höchsten Riboflavinproduktion und wies eine eine Kapazität der Riboflavinproduktion von 3,4 g/l in 7 Tagen gemaß dem Rolfröhrchentest auf.
- Stamm F wurde der NTG-Mutagenese bei einer NTG-Konzentration von 0,10 mg/ml und einer 60-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur unterzogen. Die behandelten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in gleichen Volumina physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Zellen wurden einer Selektion auf einem 100 ug/ml Tubericidin enthaltenden, ergänzten, definierten Medium unterzogen. Nach 10-tägiger Inkubation bei 30ºC wurden 25 lebensfähige Stämme ermittelt und auf ihre Riboflavinproduktion getestet. Stamm B war der am stärksten flavinogene Stamm mit einer Kapazität der Riboflavinproduktion von 3,8 g/l in 7 Tagen.
- Stamm A war auch die Ausgangspopulation für ein zweites Selektionsverfahren. Eine Kultur von Stamm A wurde der NTG-Mutagenese bei einer NTG-Konzentration von 0,10 mg/ml mit 60-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur unterzogen. Die behandelten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in gleichen Volumina physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Die Kultur wurde der Tubercidinselektion auf einem 100 ug/ml Tubericidin enthaltenden, ergänzten, definierten Medium unterzogen. Nach 10 tägiger Inkubation bei 30ºC wurden 20 lebensfähige Stämme ermittelt und auf ihre Riboflavinproduktion hin getestet. Stamm G war der am stärksten flavinogene Stamm und produzierte 2,9 g/l in 7 Tagen.
- Stamm G war wiederum die Ausgangspopulation für ein Selektionsverfahren auf Empfindlichkeit gegen UV-Licht. Stamm G wurde der NTG-Mutagenese bei einer NTG- Konzentration von 0,10 mg/ml mit 60-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur unterzogen. Die behandelten Zellen wurden geerntet, gewaschen und in gleichen Volumina physiologischer Kochsalösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde um den Faktor 1 : 10&sup4; zum Erhalt einer Zellkonzentration von 1000 Zellen/ml verdünnt. 0,1 ml der Zellsuspension wurden auf YMG-Medium ausplatiert und 3 Tage bei 30ºC inkubiert.
- Zu diesem Zeitpunkt waren die Kolonien sichtbar und wurden zweimal auf frische Agarplatten repliziert. Der erste Abklatsch wurde offen einem UV-Licht von 17 J/m² ausgesetzt. Die bestrahlte Platte wurde im Dunkeln zusammen mit der nichtbestrahlten Platte 4 Tage bei 30ºC inkubiert, um die Koloniebildung zu gestatten. Die bestrahlte und die nichtbestrahlte Platte wurden miteinander verglichen, um nicht lebensfähige, UV-Licht sensitive Mutanten anzeigende Kolonien zu ermitteln. Diese Mutanten wurden auf der nichtbestrahlten Platte identifiziert und auf ihre Riboflavinproduktion getestet. Mit Hilfe dieses Verfahrens wurden 14 Kolonien ermittelt und die bestproduzierende Mutante war Stamm H, der in der Lage ist, 3,1 g/l Riboflavin in 7 Tagen zu produzieren.
- Der Testlauf Nr. 1 der Riboflavinproduktion wurde in einem 14 L-Fermenter durchgeführt. Die Zusammensetzung des Fermentationsmediums für diesen Testlauf ist in Tabelle in wiedergegeben. Alle Bestandteile des Mediums, mit Ausnahme der Glukose, wurden in den Fermentationstank vor Einleitung des restlichen Mediums sterilfiltriert. Die Glukose wurde 30 Minuten bei 121ºC unter 15 psi autoklaviert. Der pH-Wert des Mediums wurde vor dem Beimpfen auf 6,9-7,0 eingestellt. Der Fermentationstank wurde mit einer Kultur von Stamm A solchermaßen beimpft, daß anfangs eine optische Dichte von 0,06 bei 620 nm (1 cm Küvette) zur Verfügung gestellt wurde.
- Testlauf Nr. 1 wurde für 240 Stunden gefahren. Während dieser Zeit wurden die optische Dichte bei 620 nm, der Riboflavingehalt, pH, die Temperatur sowie der Glycin-, Harnstoff-, Phosphat- und Glukosegehalt beobachtet. Die Ergebnisse dieser Fermentation sind in den Tabellen in-A und in-B dargestellt. Nach 240 Stunden wurde eine Riboflavinendkonzentration von 15,93 g/l erhalten. Tabelle III-A Zeit (Std.) optische Dichte Riboflavin Temperatur Tabelle III-B Zeit (Std.) Glycin Harnst. Phosphat Glukose
- Der Testlauf Nr. 2 für die Riboflavinproduktion wurde in einem 450 L-Fermentationstank und über eine Laufzeit von 200 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium und die Beimpfung wurden wie in Beispiel 3 bewerkstelligt. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle IV-A angegeben. Nach Ablauf von 200 Stunden wurde in Testlauf Nr. 2 eine Riboflavinkonzentration von 21,0 g/l erhalten. Tabelle IV-A Zeit (Std.) opt. Dichte Riboflavin Temp. Glycin Harnst. Gluk.
- Der Testlauf Nr. 3 der Riboflavinproduktion wurde in einem 450 L-Fermentationstank über eine Laufzeit von 200 Stunden durchgeführt. Das Fermentationsmedium und die Beimpfung wurden wie in Beispiel 3 bewerkstelligt. Die Ergebnisse des Tests sind in Tabelle V-A angegeben. Nach Ablauf von 200 Stunden wurde in Testlauf Nr. 2 eine Riboflavinkonzentration von 16,0 g/l erhalten. Tabelle V-A Zeit (Std.) Opt. Dichte Riboflavin Temp. Tabelle V-A Zeit (Std.) Gycin Harnst. Phosphat Glukose
- Eine Reihe von Testläufen wurde ausgeführt, wobei alle Konzentrationen konstant gehalten wurden, mit der Ausnahme, daß die Konzentration an FeSO&sub4;·7H&sub2;O in Konzentrationen von 0 mg/l, 1 mg/l, 2 mg/l und 3 mg/l variiert wurde. Die Fermentationen wurden in Testversuchsbehältern von 150 Liter unter Verwendung des Fermentationsmediums aus Tabelle 3 durchgeführt. Außerdem wurden dem Fermentationsmedium die folgenden Zusammensetzungen zugesetzt:
- Hefeextrakt 1,04
- Malzextrakt 1,04
- Pepton 1,73.
- Für die Fermentationsläufe wurde Stamm A eingesetzt. Im Verlauf der Fermentation wurden das Zellwachstum und die Riboflavinproduktion überwacht. Tabelle VI-A stellt die Ergebnisse für das Zellwachstum während der vier Fermentationen zur Verfügung. Tabelle VI-B gibt die Riboflavinproduktionen der vier Fermentationen wieder. Tabelle VI-C stellt die Endverhältnisse der Riboflavinproduktion zum Zellwachstum für jede der vier Fermentationen dar. Wie aus Tabelle VI-C zu entnehmen ist, steigt bei höheren Konzentrationen an FeSO&sub4;·7H&sub2;O die pro Zelle produzierte Menge Riboflavin an. Während bei 1 mg/l und 2 mg/l ein wesentlicher Zuwachs in diesem Verhältnis erreicht wird, ist der Zuwachs zwischen 2 mg/l und 3 mg/l minimal. Tabelle VI-A Zeit (Std.) Zellgewicht in (g/l) bei (FeSO&sub4; · 7H&sub2;O) Tabelle VI-B Zeit (Std.) Riboflavin in (g/l) bei (FeSO&sub4; · 7H&sub2;O) Tabelle VI-C Von Stamm A produziertes Riboflavin pro Wachstumseinheit Riboflavin Zellgewicht
- Eine Reihe von Testläufen wurde durchgeführt, um die Auswirkungen des ausgelaugten Mediums auf Stamm A zu ermitteln. Die Fermentation wurde über 90 Stunden in einem 14 L-Fermenter unter Verwendung des in Tabelle 3 zur Verfügung gestellten Fermentationsmediums durchgeführt. Alle Bedingungen waren jeweils gleich, mit der Ausnahme, daß in jedem Testlauf für die das Fermentationsmedium konstituierende Flüssigkeit das ausgelaugte Medium in verschiedenen Anteilen verwendet wurde. Der erste Testlauf enthielt kein ausgelaugtes Medium, der zweite 20%, der dritte 40%, der vierte 50% und der fünfte 80%. Die Riboflavinproduktion ist für jeden Testlauf zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf des Fermentationsdurchganges in der untenstehenden Tabelle VII-A dargestellt. Tabelle VII-A Wirkung ausgelaugter Medien auf die Riboflavinproduktion Stunden Gehalt an ausgelaugtem Medium
- Eine anfängliche Stimulation der Riboflavinproduktion wird bei 20% ausgelaugtem Medium beobachtet. Bei ansteigender Konzentration an ausgelaugtem Medium wird die Riboflavinproduktion jedoch zunehmend inhibiert.
- Obwohl zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung im Detail beschrieben wurden, ist offensichtlich, daß in der Fachwelt Modifikationen und Anpassungen auftreten können. Man hat jedoch ausdrücklich diese Modifikationen und Adaptionen im Blickfeld der Erfindung zu verstehen, wie sie in den folgenden Ansprüchen dargestellt wird, liegen.
Claims (22)
1. Stamm von Candida famata, der in der Lage ist, innerhalb von 6 Tagen mindestens
10 Gramm Riboflavin pro Liter Fermentationsmedium zu produzieren.
2. Stamm von Candida famata, der durch die ATCC Eingangsnummer 20849
identifiziert ist, sowie dessen Mutanten.
3. Stamm von Candida famata, der durch die ATCC Eingangsnummer 20850
identifiziert ist, sowie dessen Mutanten.
4. Stamm von Candida famata gemäß Anspruch 1, der auf einem Selektionsmedium
wachsen kann, wobei das Selektionsmedium ein Selektionsmittel einschließt, welches
durch ein Verfahren gewonnen wird, das (a) das Heranziehen einer Population von
Candida famata in einem wäßrigen Nährmedium bis zum Stillstand des
Zellwachstums und (b) Entfernen der Population von Candida famata aus Stufe (a) zum Erhalt
des Selektionsmittels aus dem wäßrigen Nährmedium umfaßt.
5. Stamm von Candida famata gemäß Anspruch 1, der gegen die Wachstumsinhibition
durch Desoxyglukose resistent ist.
6. Verfahren zur Selektion eines Riboflavin produzierenden Hefestammes, der gegen
die Inhibition durch ausgelaugte Medien resistent ist, wobei das Verfahren
a) das Heranziehen einer Population erster Mikroorganismen in einem wäßrigen
Nährmedium bis zum Stillstand des Zellwachstums,
b) das Entfernen der ersten Mikroorganismen aus dem wäßrigen Nährmedium, um
ein ausgelaugtes Medium zu erhalten,
c) das Gewinnen eines Selektionsmediums, welches das ausgelaugte Medium in der
für einen nicht mutierten, Riboflavin produzierenden Hefestamm minimalen
Hemmkonzentration enthält,
d) das Mutieren einer Population dieser Hefe,
e) das Einbringen dieser mutierten Hefepopulation in das Selektionsmedium und
f) die Selektion eines gegen die Inhibition durch ausgelaugte Medien resistenten
Hefestammes aus der mutierten Hefepopulation, wobei der selektierte Hefestamm
auf dem Selektionsmedien wachsen kann
umfaßt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bei dem das Selektionsmedium zusätzlich
assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Nährstoffe enthält.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, bei dem das ausgelaugte Medium mindestens
etwa 50% des Selektionsmediums ausmacht.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6-8, bei dem der Schritt der Entfernung der
Mikroorganismen ein aus der aus Zentrifugation und Filtration bestehenden Gruppe
ausgewähltes Verfahren umfaßt.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6-9, bei dem die Hefe ein Candida famata
Stamm ist.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6-10, bei dem die ersten Mikroorganismen
und die Hefe derselben Spezies angehören.
12. Hefe, die nach einem der gemäß einem der Ansprüche 6-11 beanspruchten
Verfahren selektiert wurde.
13. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin durch Kultivierung eines Riboflavin
produzierenden Hefestammes der Spezies Candida famata in einem
Fermentationsmedium, wobei das Verfahren
a) das Beimpfen eines Fermentationsmediums mit Hefestämmen, welches eine
Eisenkonzentrationen zwischen circa 5,4 uM und etwa 15 uM ergebende Eisenquelle
und assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und Spurenelemente
enthält, wobei die Hefestämme aus der aus den durch die ATCC Eingangsnummern
20849 und 20850 identifizierten Stämmen, den Mutanten der ATCC
Eingangsnummern 20849 und 20850 und deren Gemischen bestehenden Gruppe
ausgewählt sind und innerhalb von 6 Tagen mindestens 10 Gramm Riboflavin pro
Liter Fermentationsmedium produzieren,
b) das Aufrechterhalten einer zur Unterstützung des Zellwachstums und der
Riboflavinpoduktion ausreichenden Nährstoffkonzentration in dem Fermentationsmedium
und
c) die Gewinnung des Riboflavins aus dem Fermentationsmedium
umfaßt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, bei dem das Fermentationsmedium zusätzlich
Glycin in einer Konzentration von etwa 1 g/l bis etwa 7 g/l enthält.
15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, bei dem die Stufe der Aufrechterhaltung
für mindestens sechs Tage durchgeführt wird und mindestens 10 Gramm Riboflavin
pro Liter produziert werden.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13-15, bei dem das Fermentationsmedium
außerdem
a) Glycin in einer Konzentration von etwa 1 g/l bis etwa 7 g/l,
b) eine Phosphatquelle,
c) eine Sulfatquelle und
d) Quellen für Kobalt, Kupfer, Bor, Molybdän, Mangan, Zink, Kalium und
Magnesium
enthält.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem als Kohlenstoffquelle Glukose, als
Stickstoffquelle Harnstoff, als Quellen für Phosphat und Kalium KH&sub2;PO&sub4;, für Magnesium
und Sulfat MgSO&sub4;, für Kobalt CoSO&sub4;, für Kupfer CuSO&sub4;, für Bor H&sub3;BO&sub3;, für
Molybdän (NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;, für Mangan MnSO&sub4; und für Zink ZnSO&sub4; verfügbar sind.
18. Verfahren zur Selektion eines verbesserten, Riboflavin produzierenden
Mikroorganismus, welches
a) das Heranziehen einer Population einer ersten Mikroorganismenspezies in einem
wäßrigen Nährmedium bis zum Stillstand des Zellwachstums,
b) das Entfernen der ersten Mikroorganismenspezies zum Erhalt eines ausgelaugten
Mediums aus dem wäßrigen Nährmedium,
c) das Gewinnenen eines Selektionsmediums, welches das ausgelaugte Medium in
der für eine zweite Mikroorganismenspezies, die Riboflavin produzieren kann,
minimalen Hemmkonzentration enthält,
d) das Mutieren einer Population der zweiten Mikroorganismenspezies, um eine erste
mutierte Population zu erhalten,
e) das Einbringen der ersten mutierten Population in das Selektionsmedium,
f) die Selektion eines ersten verbesserten Mikroorganismenstammes, der gegen die
Inhibition durch ausgelaugte Medien resistent ist,
g) die Mutation einer Population des ersten verbesserten Mikroorganismenstammes
zum Erhalt einer zweiten mutierten Population,
h) die Kultivierung der zweiten mutierten Population auf einem Nährmedium,
welches Tubercidin in einer für den ersten verbesserten Stamm minimalen
Hemmkonzentration enthält und
i) die Selektion eines zweiten verbesserten Mikroorganismenstammes aus der zweiten
mutierten Population, wobei der zweite verbesserte Mikroorganismenstamm
Kolonien auf dem Nährmedium bilden kann
umfaßt.
19. Verfahren gemaß Anspruch 18, bei dem das ausgelaugte Medium mindestens
ungefähr 50% des Selektionsmediums ausmacht.
20. Verfahren gemaß Anspruch 18 oder 19, bei dem die erste und die zweite
Mikroorganismenspezies dieselbe Spezies sind.
21. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18-20, bei dem das Tubercidin in dem
Nährmedium in einer Konzentration von mehr als etwa 100 ug/ml vorliegt.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18-21, bei dem der zweite
Mikroorganismenstamm ein Stamm von Candida famata ist.
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