JPH05509221A - 微生物のリボフラビン生産株、選択方法及び発酵方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′ｌ　のリボフラビン　、゛　法、　び　法、　に　する量己 本出願は、１９８５年１２月２０日に出願された、共存で譲渡された米国特許出 願第８１１，２３４号の一部継続出願である。

主皿■分互 本発明は、多量のりボフラビンを生産する能力を有する微生物、特に増大量のり ボフラビンを生産する酵母カンジダ　フラレリ（Ｃａｎｄｒｄａ　ｆｌａｒｅｒ ｊ）の株及びそれらの微Ｉｉ物の発酵方法に関する。

更に、本発明はりボフラビンオーバープロデュー’ｔ−（ｏｖｅｒｐｒｏｄｕ− ｃｅｒ）を選択する方法に関する。

又凱■宜景 リボフラビンは、生物の代謝要求を大巾に越える量で、多種の微生物により合成 される。アシュブヤ　ゴシピイ　（Ａｓｈｂｙａ　ｇｏｓｓｙｐｉｉ）及びユレ モセンウム　アシュビイ　（Ｅｒｅ＋５ｏｔｈｅｃｉｕｓ　ａｓｈｙｂｉｉ）の 如き子嚢菌類は、発酵によるリボフラビンの生産に関して知られている。

典型的に、これらの生物により生産されたリボフラビンは、飼料添加剤として使 用される。

また、その他の微生物によるリボフラビン生産が知られている。

例えば、クロストリジウム属及びバシラス属に属するバクテリア、並びにカンジ ダ、サツカロミセス、ハンセニエーラ、及びピチア（Ｐｉｃｈｉａ）を含む種々 の属の酵母がリボフラビン生産に関して知られる。更に詳細には、例えば、マツ パヤシらの米国特許第３．４３３，７０７号（１９６９年）は、ピチア酵母の三 つの種によるリボフラビンの生産を記載している。１２日間で１０．５ｍｇ／ｌ 〜５１蒙ｇ／ｌのリボフラビンの収量が報告された。バールマン（Ｐｅｒｌｍａ ｎ）　著、代ｌ皇二太覆宜」肛叩肛した皿匹旦ｏｆ　Ｗ虹蛯虹坦峠、２　Ｅｃｏ ｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　３１２頁（１９７８年）に記載されているように 、６．４２ｇ／ｌのアシュブヤ　ゴシピイによるリボフラビン過剰生産（Ｏｙ６ ｒｐｒＯｄｕｃｔｉｏｎ）が、スゼクゼスニアク（Ｓｚｃｚｅｓｎｉａｋ）　ら （１９７３年）により報告された。

共有で譲渡された米国特許出願第８１１．２３４号（１９８５年１２月２０日出 １１）は、増大されたりポフラビン生産を存するカンジタフラレリの株の発生を 報告する。米国特許出願第８１１，２３４号に記載されたカンジダ　フラレリの 株は、発酵６日間で１ｊ当り５ｇのりポフラビンを生産した。

リボフラビン生産酵母の代謝要求の研究は、鉄の濃度に対するリボフラビン生産 怒受性を報告した０例えば、ストラウベ（Ｓｔｒａｕｂｅ）ら著、カンノ゛　ギ １エルモンジイの　びリボツービン゛に　ぼ　゛　び　の　ｅ　（Ｔｈｅ　Ｉｎ ｆｌｕｅＴＩｃｅ　ｏｆ　Ｉｒｏｎ　Ｃｏｎｃｅ−ｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　 Ｔｅａ　ｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　Ｒ４ｂｏｆｌａｖｉｎ 　０ｖｅｒ　ｒｏｄｕ−ｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｎｄｉｄａ　にｕｉ１目ｅｒｇ ｏｎｄｉｉ）、ＢＩｏｔｅｃｈｎｏＩｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｒｏｅｎｇ４−ｎｅｅ ｒｉｎｇ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｍ　４．　２２５〜２３１頁（１９７３年）は 、１０−’Ｍの鉄濃度がリボフラビンの生産を殆ど完全に抑制すること、及びリ ボフラビン生産が鉄濃度にほぼ反比例することを報告する。

また、ストラウベらは、コバルトの存在が鉄のリボフラビン生産抑制効果を反転 し得ることを見い出した。１０−’Ｍのコバルト濃度及び１０−’Ｍの鉄濃度で 、コバルトが存在せず鉄が１０−’Ｍに制限された場合と同し量のりポフラビン が生産された。

その他の文献は、リボフラビン生産微生物の鉄感受性を記載しており、特に鉄感 受性が発酵培地へのコバルト、亜鉛またはキレート化剤の添加により部分的に解 決し得ることを記載している。

チョプデ（Ｃｈｏｐｄｅ）　ら著、サイトファーガ　フチンソニイによるリボフ ラビン合成を影響する囚　（Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｉｎｆ１ｕｅｎｃ４ｎ　Ｉｌｉｂ ｏｆｌａｖｉｎＳ　ｎｔｈｅｓｉｓ　ｂ　Ｃｔｏ　ｈａ　ａ　１ｌｕｔｃｈｉｎ ｓｏｎｉｉ）、　Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ、ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ−１ｏｇｙ、２０ 巻、２号（１９８０年）、シリ−（Ｓｃｈｌｅｅ）ら著、ＩＪ　、ｊ９フラビン 　の　び　ヒ　（Ｐｈ　５ｉｏｌｏ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅ＊１ｓｔｒｏｆ　Ｒ ４ｂｏｆｌａｖｉｎ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｄｉｅ　Ｐｈａｒｗａｚｉｅ　、 　１２号（１９８４年）を参照のこと。

鉄はリボフラビン生産を抑制するが、増大された量の鉄は細胞増殖を刺激するこ とがまた報告された。従って、フラビノゲネシス（ｆｌａｖｉｎｏｇｅｎｅｓｉ ｓ）の鉄の抑制に対して減少された感受性を有する酵母は、多量のりポフラビン を生産すべきである。何となれば、一層高い細胞密度が鉄濃度を増加することに より得ることができるからである。

鉄の存在に対してリボフラビン生産の減少された感受性を有するリボフラビン生 産微生物の株が報告された。ソ連特許第３３０１８９号（アブストラクト）、西 ドイツ特許第１０８７６７号（アブストラクト）を参照のこと。

従って、リボフラビン生産の改良されたレベルを有する微生物に対する要望があ る。リボフラビン生産の鉄の抑制に対して抵抗性を有するフラビノゲニック（ｆ ｌａｖｉｎｏｇｅｎｉｃ）微生物の株に対して、更に要望がある。更に、リボフ ラビン過剰生産微生物を選択するための改良方法に対する要望がある。また、増 大された細胞増殖及びフラビノゲネシスを支持する発酵培地に対する要望がある 。本発明の微生物は、フラビノゲニック微生物の野生型株を大巾に越え、しかも 既知の発生された株の収量より非常に改良される量でリボフラビンを生産する。

３１食１カ 本発明は、６日間で１１当り１０ｇのリボフラビンを生産し得る酵母カンジダ　 フラレリの株に関する。２００時間で１１当り２０ｇ以上のリボフラビン収量が 得られた。夫々、ＡＴＣＣ登録番号第２０８４９号及び同第２０８５０号で同定 されたカンジダ　フラレリ株Ａ及びＢは、本発明の最もフラビノゲニノクな株で ある。別の態様に於いて、本発明は、フラビノゲネシスの鉄の抑制に対して減少 された感受性を有するカンジダ　フラレリの株を伴なう、このような株は、発酵 培地中で増大された鉄濃度で細胞当りの増大されたリボフラビン生産の特性を有 する。また、カンジダ　フラレリの発生された株は、枯渇培地（ｄｅｐｌｅｔｅ ｄ　ｍｅｄｉａ）による、及びデオキシグルコースによる、増殖の抑制に対する 抵抗性に関して選択された。

別の！ｒＥ、様に於いて、本発明は、枯渇培地による増殖の抑制に対して抵抗性 である改良された微生物を選択する方法を伴なう、このような微生物は、一層高 い細胞密度に増殖して一層多量の代謝産物を生産する能力を有する。この方法は 、まず、細胞増殖が停止するまで微生物の集団を増殖することにより枯渇培地を つくることを伴なう、ついで、微生物が培地から除去されて枯渇培地を形成する 。ついで、枯渇培地を含む選択培地が形成される。ついで、微生物の第二集団が 、突然変異誘発を受け、選択培地に導入される。枯渇培地で増殖する能力を有す る突然変異集団の株が選択される。微生物の第二集団は、枯渇培地を形成した第 一集団と同じ種のものであることが好ましく、同じ株のものであることが更に好 ましい。

更に別のＢ様に於いて、本発明は、多量のリボフラビンを生産する微生物を選択 する方法を伴なう、この方法は微生物の出発集団を突然変異させることを伴なう 、ついで、突然変異集団が、おそらくプリン代謝を抑制する抗生物質ツベルクリ ン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）を含ム栄養培地で培養される。ツベルクリンは、突 然変異集団中の微生物の幾つかによるコロニー形成を抑制するのに有効な濃度で 栄養培地中に存在する。ついで、ツベルクリン培地でコロニーを形成する能力を 有する微生物が選択される。ついで、このような微生物は、リボフラビン過剰生 産に関して試験し得る。この選択方法は、リボフラビンオーバープロデューサー を選択することがわかった。

本発明の別の態様は、本発明の微生物の株を発酵培地中で培養することによりリ ボフラビンを生産する方法を含む。増大されたりボフラビン生産が、約５．４μ Ｍ〜約１５μＭの培地中の鉄濃度により達成し得る。また、発酵培地は約１ｇ／ ｌまでの１度のグリシノを含む。発酵は、培地中の栄養素濃度及びその他の発酵 条件を維持して細胞増殖及びリボフラビン生産を支持することにより行なわれる 。

細胞増殖が横ばいになった後、リボフラビンが発酵培地から回収される。

罫１１「説ｊ 改良された量のリボフラビンを生産する、種カンジダ　フラレリのりボフラビン 生産酵母の株が、発生された。１４４時間で培地１１当り１０ｇ以上のりポフラ ビンの収量が日常的に得られ、２００時間で１β当り２０ｇ以上のりボフラビン の収量が得られた。本発明の株は野生型のカンジダ　フラレリより３０〜４０倍 もフラビノゲニフクであり、最高の既知のりポフラビンプロデューサーより３． ５倍もフラビノゲニックである。

特に、株Ａ、ＡＴＣＣ登録番号２０８４９は、２００時間の発酵実験で２０ｇ以 上のリボフラビンを生産し得る。２−のロール管すボフラビン分析で測定して株 Ａよりもフラビノゲニソクである種々の株が株Ａから発生された。この分析（実 施例の部分で詳細に記載される）は、リボフラビン収量を最大にすることに関し て設計されるものではないが、同一条件下の微生物の株の間のフラビノゲネシス の比較に使用される０株Ｂ、ＡＴＣＣ登録番号２０８５０　、は株Ａから発生さ れ、ロール管分析で株Ａよりも５０％多くフラビノゲニソクで一つ ある。

本発明のカンジダ　フラレリの株は、リボフラビン合成の鉄の抑制に対して減少 された感受性を有する。上記の如く、鉄は多くの微生物、特に酵母カンジダの種 に於けるリボフラビン合成のインヒビターであることが報告された。発酵培地中 の増大された鉄は、本発明のカンジダ　フラレリ株の細胞増殖を増大するだけで はなく、細胞重量当りのリボフラビン生産をも増大することがわかった。リボフ ラビンは高い鉄濃度から増大された細胞増殖により増加すると予想されるが、観 察されるリボフラビン増加は、増大された細胞増殖１　単独から予想される増加 よりも大きい。従って、本発明の鉄に対し抵抗性がある株に於けるフラビノゲネ シスは、鉄の抑制に対し非感受性であるだけではなく、細胞基準で一層高い鉄濃 度により刺激される。

本発明に於いて、カンジダ　フラレリの鉄に対し抵抗性の株に関するリボフラビ ン生産の刺激は、約３．６マイクロモル（μＭ）の鉄濃度で検出された。しかし ながら、約１６．１μＭの濃度より高いと、鉄は、これらの株でさえも、そのリ ボフラビン合成を抑制する傾向がある０発酵中、約５．４０ｇＭ〜約１５μＭ、 更に好ましくは約６．１２ｇＭ〜約１２μＭ、最も好ましくは約９．８μＭ〜約 １０．８μＭの鉄のモル濃度を有することが好ましい。

株Ａ及びその子孫のその他の重要な代謝特性は、培養菌が終端細胞密度まで増殖 された発酵培地中の増殖及びリボフラビン生産の抑制に対する抵抗性である。こ のような培地は“枯渇培地”と称される。このような抵抗性は、一層高い細胞密 度を得ることにより一層高いりボフラビン収量の生産を可能にする。また、これ らの株は、細胞基準でリボフラビンの増大された収量を生産することがわかった 。

本発明の説明は、本明細書に於いて酵母カンジダ　フラレリに間してなされる。

カンジダ　フラレリは、またトルロプシス　カンジダとして知られる。しかしな がら、本発明の方法及びプロセスは、カンジダ属のその他の種並びにその他のり ボフラビン過剰生産性の酵母及び微生物に同様に通用し得る。従って、カンジダ 　フラレリへの特別な言及は、本発明の範囲を、この特別な種に限定することを 意図するものではない。

本発明に従って、微生物の改良されたりポフラビン生産株は、微生物の培養菌を 突然変異させ、ついでリボフラビン生産に関して改良された特性を存する株を選 択する方法により選択される。典型的には、突然変異微生物が、或種の抑制化合 物を含む固体培地で培養される。インヒビターの存在下で形成するコロニーが培 養され、リボフラビン生産に関して試験される。ついで、多いリボフラビン生産 を有する微生物の株が選択される。

微生物の培養菌の突然変異誘発は、当業界で既知の種々の手段のいずれかで行な うことができ、化学的もしくは物理的な突然変異誘発のいずれも含み得る０例え ば、本発明に適する化学的突然変異原は、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニト ロソゲアナジン、ジェポキシブタン、エチルメタンスルホネート、カラシ化合物 （ｍｕｓｔａｒｄｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、ヒドラジン、及び亜硝酸を含むが、こ れらに限定されない、物理的突然変異原は、紫外線及びγ線を含むが、これらに 限定されない。出発培養菌が、特別な大きさの生存集団を残すのに充分な強さで 突然変異誘発剤に暴露される。その大きさは突然変異源の間で変化し、突然変異 源が所定の死滅率で生存集団中に誘発する突然変異の量に依存する６例えば、Ｎ ＴＧに関して所望の死滅率は出発集団の約１０％〜５０％を残すべきである。亜 硝酸突然変異誘発は出発集団の約０．０１％〜０．１％を残すべきであり、紫外 線突然変異誘発は約１．０％を残すべきである。このようにして処理された細胞 が回収され、洗浄され、生理食塩水の如き非増殖支持性培地中で懸濁される。つ いで、このような細胞が、一つ以上の選択方法にかけ得る。

カンジダ　フラレリのりポフラビン過剰生産株の幾つかの中間株が、下記の選択 方法を用いて株Ａ及びＢの発生に於いて選択され大。

株Ｃ，ＡＴＣＣ登録番号２０７５５号、は野生型カンジダ　フラレリから幾つか の選択方法により発生され、米国特許出願第８１］、、２３４号に記載されてい る０株Ｃは、Ａ及びＢを含む下記の株の先祖（ｐｒｅｄｅ−ｃｅｓｓｏｒ）であ る０株Ｃは、２−ロール管分析で７日間で１．１ｇ／ｌのリボフラビンを生産し 得る。出発集団として株Ｃを用いて、グルコース類似体選択方法がりポフラビン オーバープロデューサーヲ選択するのに行なわれた。

本発明に従って、リボフラビンオーバープロデューサーは、グルコースの類似体 に対して抵抗性である微生物を選択することにより選択し得る。微生物のこのよ うな株は、グルコースを蓄積する点、グルコースをリボフラビンに変換する点、 またはグルコース抑制を解決する点で、一層有効であるようである。従って、リ ボフラビン生産微生物の出発培養菌が、上記のように突然変異される。ついで、 突然変異集団が抑制濃度のグルコースＮ似体またはそれらの混合物を含む培地に 塗布される。塗布された突然変異細胞からの生存コロニーが、グルコース類似体 による抑制に対する抵抗性に関して選択される６ついで、これらのコロニーが、 リボフラビン生産に関して試験される。

グルコース類似体の濃度は、類似体の抑制効果及びＩｌＵ体によるリボフラビン 生産の抑制に対する培養菌の出発感受性を含む、幾つかの因子に依存性である。

典型的には、最小阻止濃度実験が行なゎれて、１１１（Ｕ体が未突然変異出発集 団中の増殖を抑制する最小１度を測定する。この最小１度は、一般に選択方法に 使用される１度であるが、抵抗性の突然変異体の増殖さえもが抑制される濃度ま での一層高い１度が使用し得ることが、認識されるべきである。２−デオキシグ ルコースがグルコース類似体である場合には、約７００μｇ／−〜約１５００μ ｇ／ｄ、更に好ましくは約７００μｇ／−〜約１０００μｇ／ａｄ、最も好まし くは約７ｏｏμｇ／Ｗ１〜約８００μｇ／Ｒ１の濃度が望ましい。

株りは、株Ｃが突然変異され選択される出発集団である、グルコース類似体選択 方法により選択された。株りは、２−のロール管分析で７日間で１．５８ｇ／β のリボフラビンを生産し得る。この株は、リボフラビンオーバープロデューサー を選択するための鉄感受性選択方法の出発集団として使用された。

上記の如く、リボフラビン生産は少量の鉄により抑制されることが報告されてい た。今般、鉄の抑制に対して減少された感受性を有する微生物のりボフラビン生 産株を発生することが望ましいことが認識された。何となれば、その株は増大さ れた細胞増殖を支持し得る高い鉄濃度を有する培地中で培養し得るからである。

鉄に対して減少された感受性を有するリボフラビンプロデューサーを選択するた めに、微生物の培養菌が上記の方法で突然変異される。得られた培ＩＩ菌が、高 い鉄濃度の存在下で炭素元素、窒素元素、及び無機元素の同化し得る源を含む、 固体培地に広げられる。例えば、好適な培地は、２．２３％のグリシンで補充さ れたＹＭＧ培地（表１を参照のこと）である。突然変異細胞は、リボフラビン生 産に通した温度で、この培地で増殖される。リボフラビン生産の鉄の抑制に対し て増大された抵抗性のない突然変異体は、リボフラビンが過剰生産されないので 、白色もしくはクリーム色のコロニーを形成する。しかしながら、鉄によるリボ フラビン生産の抑制に対して増大された抵抗性をもつ突然変異体コロニーは、リ ボフラビンの存在により黄色である。このような黄色コロニーが、高いリボフラ ビンオーバープロデューサーに関して試験し得る。

酵母抽出物　３ｇ／２ モルト抽出物　３　ｇ／１１ 選択方法中の鉄濃度は、その他の因子の中で、出発集団の鉄感受性に依存する。

例えば、鉄感受性プロセスが野生型カンジダ　フラレリの出発集団に対して行な われた場合には、選択のための鉄濃度は、出発集団がリボフラビン生産の鉄の抑 制に対して減少された感受性に関して既に選択されたカンジダ　フラジυの株で あった場合よりも低いであろう。グルコース類似体選択に関して上記されたよう に、鉄濃度は典型的には最小阻止濃度実験により選択される。本発明によれば、 約５μＭ〜約５０μＭ１更に好ましくは約１０μＭ〜約３０μＭ、最も好ましく は約１６μＭ〜約２０ｐＭの鉄のモル濃度が、減少された鉄感受性を選択するの に有効である。

株Ｅは、出発集団として株りを用いる鉄感受性プロセスにより選択された。株Ｅ は、２−のロール管分析で７日間で１．７０ｇ／ｆｆｉのりボフラビンを生産し 得る。この株は、リボフラビンオーバープロデューサーを選択するための枯渇培 地選択法の出発集団として使用された。

リボフラビンオーバープロデューサーは、枯渇培地での増殖抑制に対する抵抗性 により選択し得る。実験室酵母培養菌の如き密閉生物系に於いて、細胞増殖及び 生物生産物の生産は、過剰の栄養素の存在下であっても、最終的に停止すること が知られている。カンジダ　フラレリの細胞増殖及びリボフラビン生産の停止の 理由は知られていないが、三つの理由がこの現象の少な（とも一部の原因となる ものと思われる。殆どの微生物は、所定の濃度より低い微量の栄養素を使用する 点で、不充分であると考えられる。従って、このような微量の栄養素が所定の濃 度まで枯渇される際に、増殖が抑制される。第二の可能な理由は、増殖相及びリ ボフラビン生産相の間に、なお一層の増殖及びリボフラビン生産に対し阻害性で ある物質が副生物として生産されることである。第三の可能な理由は、高濃度の 供給された培地成分または未使用培地成分が増殖を抑制し得ることである。この 選択方法は、枯渇培地で増殖しリボフラビンを生産し得る微生物の選択に関する 。このような微生物は、低水準で微量栄養素を利用する点で一層有効であり、且 つ／または増殖相及びリボフラビン生産相の間に生産された阻害化合物または抑 制化合物に対して抵抗性であると考えられる。所定の出発培地及び発酵条件に関 して、細胞増殖及びリボフラビン生産が一層長い期間にわたって続いて一層多い 収量のりボフラビン生産を生しるので、このような選択微生物が有益である。

枯渇培地選択法によれば、枯渇培地は、微生物の初期培養菌を、細胞増殖が停止 するか、または横ばいになるまで、好ましくは最後の静止相まで、増殖すること により調製される。枯渇培地は、選択・　工程で選択しようとする微生物の同し 種、好ましくは同し株を培養することにより調製されることが好ましい。微生物 は微量の栄養素を枯渇し阻害化合物を生産するが、選択される突然変異集団が初 期特表平５−５０９２２１　（５） 集団を増殖停止させた枯渇培地からの同じ環境ストレスを受ける場合に、選択が 最も効果的である。初期集団が突然変異集団と異なる場合には、初期集団中の増 殖は、微量ミネラルの枯渇、または突然変異集団にストレスを与えないことがあ る阻害化合物もしくは抑刷化合物の生産により制限され得る。

初期培養中の増殖及び生産物の生産が停止した後、細胞が培養物から除去されて 枯渇培地を形成する０分離は、当業者に既知の種々の手段により行ない得る０例 えば、細胞は遠心分離により培地から除去し得る。また、細胞は限外濾過により 除去し得る。

選択培地は、上記の枯渇培地を使用して調製される。炭素、窒素及び無機栄養素 の源が枯渇培地に添加されて枯渇培地に抵抗性の株の選択のための選択培地を形 成し得る。枯渇培地に添加される栄養素の量及び型は変化し得る０例えば、蔗糖 及びグリシンの如き、炭素及び窒素源が、枯渇培地に添加し得る。また、枯渇培 地は４Ｂ培地（表２を参照のこと）の如き栄養培地と種々の割合で混合されても よい、枯渇培地と栄養培地の相対割合は、最小阻止濃度実験を行ない、未突然変 異集団中の増殖を抑刷する最少量の枯渇培地を使用することにより決定し得る。

表　２ に８２　ＰＯ−０，５ｇ／ｌ Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ，ＯＯ，２ｇ／ｌ 尿素　１．８４ｇ／Ａ’ 蔗糖　６Ｆｌ　ｇ／Ｉ Ｄ−ビオチン　１　μｇ／ＩＩ ８　３　Ｂ　０４　２０　μ　ｇ／ｌ Ｍｎ５Ｏ＜　２０　ｊｉｇ／　（Ｉ ＺｎＳｏ、　１　４　０　１−１ｇ／　１選択方法は、リボフラビン生産微生物 の出発集団を」１記のようにして突然変異誘発にかけて突然変異集団を形成する ことにより行なわれる。突然変異集団は枯渇培地選択培地に導入される。典型的 には、枯渇培地による抑ａ１すに対して増大された抵抗性をもたない微生物は、 選択培地で生存しない。枯渇培地選択培地で形成するコロニーが、枯渇培地に対 して増大された抵抗性を有することに関して選択される。ついで選択されたコロ ニーがリボフラビン生産に関して試験される。

株Ａは、出発集団さして株Ｅを用いる枯渇培地選択方法により選択された。細胞 が初期培養物から遠心分離により除去されて枯渇培地を形成した。枯渇培地は滅 菌されて、残存細胞が０．５ミクロンの膜フィルターを用いる濾過により除去さ れた。選択培地は、蔗糖及びグリシンを上澄液に添加することにより形成された 。株Ａ＋よ、ロール管分析で２．５ｇ／Ｉ！のリボフラビンを生成し得る。株Δ を出発集団として付加的な枯渇培地選択法が行なわれた。

この第二の枯渇培地選択法は、２−のロール管分析で７日間で３、４　ｇ　／　 ｌのリボフラビンを生産し得る株Ｆを生産した。この選択方法に於いて、細胞は 、０．５ミクロンの膜フィルターによる濾過により枯渇培地から除去され、選択 培地は５０％の枯渇培地及び５０％の４Ｂ培地により形成された。株Ｆは、選択 剤としてツベルクリンを用いる選択方法の出発集団として使用された。

リボフラビンオーバープロデューサーの別の選択方法は、プリン類似体、特にツ ベルクリンによる増殖の抑制に対して抵抗性である微生物を選択する。このよう な化合物はおそらくプリン代謝を抑制し、そしてプリンはりボフラビンの前駆体 であるので、このような化合物はりボフラビンの生産を妨害する。多くの既知の プリン類似体がプリン代謝の研究のために使用されていたが、既知の文献はりボ フラビンオーバープロデューサーの選択のためのプリン類似体の成功した使用を 報告していなかった。更に、既知の文献は、プリン代謝の研究のため、またはり ポフラビンオーバープロデューサーの選択のためのツベルクリンの使用を報告し ていない。

ツベルクリンの存在下で増殖し、リボフラビンを生産するりボフラビン生産微生 物の株は、リボフラビンを生産する改良された能力をもち得ることがわかった。

このようなツベルシジン抵抗性株は、増加された量のプリンをつくる能力、また はプリンを一層効率よくつくる能力を有する。この選択方法によれば、リボフラ ビン生産微生物の培養菌が上記のように突然変異される。生存集団が、ツベルク リンの存在下で炭素、窒素、及び無機元素の同化できる源を含む培地に塗布され る。塗布された集団から、生存コロニーが選択される。ついで、これらのコロニ ーがリボフラビン生産に関して試験される。

本発明の選択方法に使用されるツベルクリンの濃度は、抑制ｔ、一対する出発集 団の感受性を含む種々の因子に依存する。上記の如く、好適な濃度は６未突然変 異集団中の増殖を抑制するツベルノジンの最低１度が測定される最小阻止濃度実 験を行なうことにより決定し得る。抵抗性の突然変異体の増殖さえも抑制する濃 度までの一層高いツベルクリンの濃度が使用し得ることが、認識されるべきであ る。

ツベルクリンの濃度は変化し得るが、選択方法に於ける濃度は典型的には約８５ μｇ／−のツベルシジン〜約２００μｇ／−のツベルクリン、更に好ましくは約 ８５μｇ／−のツベルシジン〜約１５０μｇ／−のツベルクリン、最も好ましく は約８５μｇ／ｄ〜約１１５μｇ／−のツベルクリンである。

株Ｂは、出発集団として株Ｆを用いるツベルクリン選択方法により選択された。

株Ｂは、２−のロール管分析で７日間で３．８　ｇ　／　ｊ！のりボフラビンを 生産し得る。また、株Ｇは、出発集団として株Ａを用いるツベルクリン選択方法 により選択された０株Ｇのリボフラビン生産能力は、２−のロール管分析で７日 間で２．９ｇ／Ｊである。

株Ｇは紫外線感受性選択方法の出発集団として使用された。

上記の種々の選択方法は、リボフラビン生産微生物の突然変異集団を、成る方法 でリボフラビン生産を抑制する培地に導入することにより、リボフラビンのオー バープロデューサーを選択する。リボフラビンの速い生産速度を有する微生物を 選択することに加えて、安定なリボフラビン生産速度を有するリボフラビンオー バープロデューサーを得ることが望ましい０本発明のカンジダ　フラレリの特異 的な株は、米国特許出願第８１１．２３４号に記載されるように株Ｃの発生の前 に行なわれた細胞−細胞融合操作の生産物から誘導された。

細胞融合生産物は染色体の多重コピーを有し、それらの部分はそれらの貫刺性の ために遺伝子の再構成により経時的に失なわれるようである。リボフラビン過剰 生産に選択された細胞融合生産物は、“ノボフラビン生産のための遺伝子の多重 コピーをもつようである、このような生物が遺伝的に不安定である場合には、過 剰生産能力は容易に失なわれ得る。それ故、染色体再構成に関して減少された能 力を有するリボフラビンのオーバープロデューサーを選択することが望ましい。

バクテリア及びサツカロミセス　セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に於いて、ＤＮＡを再構成する能力を欠如している突然変 異体が得られた。クラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら著、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　５３巻、４５１頁（１９６５年）、マツプ（Ｍａｚｚａ）ら 著、旧ｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｉｃａ、１巻、１１１巻（１９７１１１年）、ハイネ ス（）ｌａｙｎｅｓ）ら著、サツカロミセスの　生　（Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒＢｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｗ　ｃｅｓ）　 、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙｓ　３７１頁（１ ９８１年）を参照のこと、これらの突然変異体の幾つかの型は、紫外線の如き突 然変異原に対する増大された感受性に関して選択することにより得ることができ る。リボフラビン過剰生産微生物の株、特に紫外線に対する感受性に関して選択 される細胞融合生産物は、リボフラビン生産に関して増大された安定性の程度を もつと考えられる。

紫外線感受性選択方法は、上記のように微生物の出発集団を突然変異誘発にかけ ることにより行なわれる。細胞懸濁物は、プレート当り約１００〜約４００のコ ロニー、更に好ましくはプレート当り約１５（１〜２００のコロニーを生じるよ うに希釈して培地、例えばＹＭＣ培地に塗布される。コロニーが目視できるよう になった後、コロニーパターンが新しい寒天プレートに２回復製される。直径約 ０．５鶴−直径約１．０ｆｉの直径を有するコロニーが目視できる。最初の復製 が、非突然変異細胞に対して準致死（ｓｕｂ−１ｅｔｈａｌ）である強さの紫外 線に、上部に外被なしに、露出される。紫外線の適当なレベルは、未突然変異細 胞のコロニーを種々の線量の紫外線に露出し、ついで細胞を死滅しないレベルを 測定することにより決定し得る。

カンジダ　フラレリの未突然変異培養菌に関して、紫外線の準欣死しヘルは約５ ジユール／平方メーター（Ｊ／ｒ／）〜約２０Ｊ／耐、更に好ましくは約１０Ｊ ／ｒｄ〜約１５Ｊ／ｒｄである。照射複製及び未照射複製は、培養されてコロニ ー形成を与える。照射プレートは暗所に保たれて可視光が紫外線の効果を逆転す ることを防止するｌ・要がある。可視光は、照射によりひき起された遺伝子損傷 を修復するという確立された効果を有する。コロニーが目視できるようになった 後、照射複製が照射プレート上に不在である未照射複製上に存在するコロニーに 関して未照射プレートと比較される。このようにして、紫外線に対して増大され た感受性を有するコロニーが同定される。

株Ｈは、出発集団として株Ｇを用いる紫外線感受性選択方法により選択された。

株Ｈは２−のロール管分析で７日間で３．１ｇ、＃のりポフラビン生産能力を有 する。

リボフラビンは、上記の方法により選択された株Ａ及びＢ並びにその他の微生物 の発酵により生産し得る。特別な株の培養菌が一層低いリボフラビン生産株の微 生物による汚染を実質的に含まない場合には、一層多いリボフラビン収量がその 培養菌で得ることができること当業者に明らかである。このような生物学的に純 粋な培養菌は、所望の株の一種の微生物から培養菌を生成することにより生産し 得る。

上記の方法により選択された株Ａ及びＢ並びに微生物によるリボフラビン生産は 、異なる発酵培地及び発酵操作が使用される時に、変化し得る。多くの発酵操作 が当業者に知られているが、−貫して速い増殖速度及びリボフラビン生産を生し る発酵培地及び発酵方法が開発された。株Ａ及びＢによるリボフラビンの生産に 好ましい発酵培地が表３に示される。

（ｇ／７り ＣｏＳ　Ｏ４・７　Ｈｚ　Ｏ１１，８ ＣｕＳＯａ　・５　Ｈｚ　ＯＯ，０２０ＨｓＢＯｘ　Ｏ，０２０ （Ｎ　Ｈａ　）Ｊｏｙ　Ｏｖａ　Ｏ；　１４０Ｍｎ５　Ｏｓ　０．０２０ ＺｎＳ　Ｏａ　・７　Ｈｚ○　１７．０ＦｅＳＯａ　’　７Ｈｚ　Ｏ２，０ ビオチン　（１，０１１８ グルコース以外の全ての培地成分は容器中に滅菌濾過される。グルコース（６３ ０ｇ／ｌ＞　は、１２１℃、１．１　ｋｇ／ａｊ　（１５ｐｓｉ　）で３０分間 オートクレーブで処理される。１４７！の発酵槽中の初期発酵槽容量は１０．５ １である。培地のｐＨは植菌の前に６．９〜７．０に調節される。

一般に、培地は、炭素、窒素、ホスフェート、スルフェート、マグネシウム、カ リウム、鉄及びその他の微量金属の源を含む６表３中に示された濃度は成分の初 期濃度を表わし、発酵中に維持する必要がある最小濃度を表わすものではない、 幾つかの成分は、全発酵中に持続するのに充分多い量で初期に与えられなくても よいことが認められるべきである。このような成分に関して、発酵培地は監視さ れる必要があり、最小濃度が保たれる必要がある。

グルコースが本発明の発酵培地中の好ましい炭素源として示されるが、その他の 炭素源が同様に良好に作用し得る０例えば、蔗糖及びフラクトースが培地に好適 である。更に、或種のアルコールの如き、その他の非砂糖炭素源が好適である０ 発酵培地中のグルコースの初期濃度は、約４５　ｇ　／　１〜約６０　ｇ　／　 １、更に好ましくは約５０ｇ／Ｉｌ〜約６０　ｇ＃、最も好ましくは約５５ｇ／ ｊ！〜約６０ｇ／Ｉｌであるべきである。

また、発酵培地はグリシンを含む、グリシンは効率のよいリボフラビン生産のた めの発酵培地の重要な成分である。グリシンはりボフラビン生産に必須であるが 、過剰量のグリシンはカンジダ　フラレリの増殖を抑制する。約７ｇ／ｆより大 きい濃度では、細胞増殖が停止する。約０．５ｇ／Ｉｌ程度の非常に低いグリシ ンの濃度では、グリシンは発酵培地から迅速に枯渇される。許容し得る初期のグ リシン濃度は、約２ｇ／ｌ〜約６　ｇ／ｊ！、更に好ましくは約４ｇ／ｊ！〜約 ６ｇ／ｊ！、最も好ましくは約４　ｇ／Ｉｌ〜約５　ｇ／ｌである。

窒素は、尿素の添加により、増殖を支持するために発酵培地に与えられる０発酵 培地中の尿素の初期濃度は、約２　ｇ／ｌ〜約９ｇ／ｌ、更に好ましくは約３ｇ ／ｌ〜約７ｇ／β、最も好ましくは約３ｇ／ｌ〜約５　ｇ／ｂであるべきである 。その他の窒素源が本発明の発酵培地中に使用するのに好適である。このような その他の源の最適濃度は、その他の可変因子を一定に保らながら窒素源の種々の 濃度で試験発酵を行ない、最高のリボフラビン生産を測定することにより決定し 得る。

ホスフェートは、−塩基性リン酸カリウム（Ｋｔｌ、ＰＯ，）の添加により発酵 培地に与えられる。ＫＨ，ＰＯ，は約０．５〜約２．０ｇ／ｌ、更に好ましくは 約０．７５ｇ／ｊ！〜約１．５ｇ／ｊ！、最も好ましくは約０．８５ｇ／ｌ〜約 １．１５ｇ／ｌの濃度で発酵培地に最初に与えられる。ホスフェートの他に、Ｋ Ｈ，ＰＯ，はカリウムを発酵培地に与える。カリウムは増殖に必要とされるが、 充分なホスフェートを与える濃度では、添加されるカリウムは培養の栄養必要量 をはるかに越える。ホスフェートはリン酸ナトリウムの如きその他の形態で添加 し得るが、リン酸カリウムが好ましい。カリウム栄養必要量が満足されるからで ある。

また、発酵培地はスルフェート源として硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）を含む 。初期の発酵培地は、この化合物を約０．５ｇ／ｌ〜約１．０ｇ／ｌ！、更に好 ましくは約０．６ｇ／ｉ！〜約０．８　ｇ　／　Ｉｌ、最も好ましくは約０．６ ５ｇ／ｌ〜約０．７５ｇ／ｌの濃度で含む。発酵培養菌は栄養マグネシウム必要 量を有するが、これらの濃度では、与えられるマグネシウムは必要量をはるかに 越える。また、スルフェートは硫酸マグネシウム以外の化合物で添加し得る。

また、発酵培地は、コバルト、銅、ホウ素、モリブデン、マンガン、亜鉛及び鉄 を含む微量ミネラルの幾つかの源を含む。発酵培地は、これらの元素の夫々に関 し栄養必要量を有するが、微量ミネラル含有化合物の初期濃度で、これらの必要 量は容易に満たされ、発酵プロセス中に更に添加を必要としない。微量ミネラル の多くは硫酸塩きして与えられるが、これらの化合物により添加されるスルフェ ートの量は発酵の全スルフェート必要量に関して重要ではない。

コバルトは、７永和硫酸コバル）　（ＣｕＳＯ，・７Ｈ，Ｏ）の形態で発酵培地 に与えられる。この化合物の初期濃度は、約１０ａ＋ｇ／ｆｆ〜約１：３ｍｇ／ Ａ、更に好ましくは約１１ｍｇ／ｆ〜約１２ｍｇ／ｌ、最も好ましくは約１１． ５１１１１（／　Ｒ〜約１２＋ｎｇ／ｌである。また、コバルトは、鉄と競合し てリボフラビン合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少するという有益な効果を有する 。

銅は、５水和硫酸銅（ＣｕＳＯ，・５ＨｚＯ）の形態で発酵培地に添加される。

この化合物は、約０．０１５ｍｇ／　１〜約０．０２５ａ＋ｇ／　１２、更に好 ましくは約０．（［７〜約０．０２３ｔｒｒｇ／Ｌ　ｍも好ましくは約０．０１ ８町／ｌ〜約０．０２２ｉ＋ｇ／　Ｒの濃度で発酵培地に最初に与えられる。ま た、銅は鉄と競合してリボフラビン合成に及ぼす鉄の抑ｍ１１効果を減少すると いう効果を有する。

亜鉛は、７永和硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ，・７Ｈ２０）の形態で発酵培地に添加され る。この化合物は、約１５＋ｎｇ／ｊ７〜約２０　ｍｇ／　１、更に好ましくは 約１６ｍｇ／ｆ〜約１９ｍｒ、／Ｌ最も好ましくは約ＩＧＩＩ１ｇ／ｌ〜約１８ 　ｌｏｇ／　ｉｔの濃度で発酵培地に最初に与えられる。また、亜鉛は鉄のＩＩ 　自体であり、リボフラビン合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少する。

また、発酵培地は、鉄の源、即ち７水和硫酸鉄（ＦｃＳＯ，・７＋１２０）を含 み、発酵の栄養鉄要求量を満足する。発酵培地中のこの化合物の初期１度は、約 １．５　ｍｇ／　ｌ〜〜約４０閂／ｌ、更に好ましくは約１、７　ｍｇ／　ｌ　 〜約３．０　ｍｇ／　Ａ’　％最も好ましくは約１．９　ｍｇ／　１２〜約２． ３ｍｒ、／Ｒである。

ホウ素は、ホウ酸（Ｎ（、ＢＯ，）の形態で発酵培地に与えられる。ホウ酸は、 約０．０１５ｍｇ／　１〜約０．０２５＋ｎｇ／　ｌ、更に好ましくは約０、０ １７ｍｇ／　１〜約０．０２３ｍｇ／　ｌ　、最も好まＬ＜ＬＬ約０．０１９ｏ ＋ｇ／ｌ〜約０．０２１ｍｇ／ｌの濃度で初期の発酵培地に与えられる。ホウ素 は、細胞に生物学的に利用可能である形態で、且つ無毒性形態であることを条件 として、ホウ素はその他の形態で発酵培地に与えられてもよい。

モリブデンは、モリブデン酸アンモニウム（Ｖｒ）（（Ｎ　Ｈ，）　ｂ　Ｍｏｔ 　Ｏ□４）の形態で培地に与えられる。この化合物は、約０．　Ｉ　２　ｖｇｇ ／　ｌ〜〜約０１６　ｍｇ／　ｌ、更に好ましくは約０．１３ｒａｇＺ１〜約０ ．１５　ｍｇ／　１、最も好ましくは約０．１３５ｍｇ／　ｊ！〜約０、１４５ ｍｇ／　ｉｔの濃度で与えられる。

マンガンは、硫酸マンガン（ＭｎＳＯａ）の形態で発酵培地に与えられる。この 化合物は、約０．０１５ｍｇ／　１〜約０．０２５ｍｇ／　１、更に好ましくは 約０．０１７〜約０．０２３−ｇ／ｌ、最も好ましくは約０、０１９１Ｉｇ／　 １〜約０．０２１ｍｇ／ｌの濃度で与えられる。

また、発酵培地は、ビオチン、即ち一般に酵母により必要とされるビタミンを含 む、このビタミンは、約０．００５ｍｇ／　１以上、更に好ましくは約０．００ ９ｍｇ／１以上、最も好ましくは約０．０１１８＋＋ｇ／１以上の濃度で与えら れる。

上記の如く、発酵中に、培地の成分の幾つかが枯渇される。増殖が、添加を必要 とする前の期間にわたって支持されるように、比較的に高い濃度のこのような成 分で発酵を開始することが好ましい。

これらの成分の好ましい範囲は、レベルが発酵により枯渇されるので、添加する ことにより発酵中に維持される０発酵培地中の成分のレベルは、例えば、発酵培 地を周期的に採取し、濃度について分析することにより監視し得る。また、標準 発酵操作が一旦開発されると、発酵中の特別の時間での既知のレベルに相応する 時間間隔で、添加が行ない得る。当業者に認められるように、培地中の細胞密度 が増加するにつれて、栄養素の消費速度が発酵中に増加する。

発酵培地中のグルコース、グリシン、尿素及びホスフェートの濃度が、発酵中に 監視される。培地中のグル：ｌ−ス七頃−が監視さ第１゜約１８／Ｅ〜約６０　 ｇ／　／！　更乙コ好まし４　＜ＤＪ、約２０Ｈ，／＃・−ｆ１４０ｇ／ρ、に 、も好ましくぽ４り１１３０ｇ、／Ａに維持ｉコーね５る。グルロ１＝−スの、 これらの澹度幌２、約６００　ｇ／βのａｊＸをイ）する淵ｉグル１．Ｊ−ス供 給材料の添加により一発酵中に維持し得る。

また、発酵培地中のグリシンの濃度が監視され、約１８／Ｅ〜約７　ｇ／Ｉｌ、 更に好ましくは約２ｇ／ｌ〜約５ｇ／ｆｆ、最も好ましくは約３ｇ／βに維持さ れる。グリソン濃度は、約２００　ｇ／１２の濃度を有する濃厚グリシン供給材 料の添加によりｆＪ節し得る。

また、発酵培地中の尿素の濃度が監視され、約１８／Ｅ〜約９ｇ／Ｅ、更に好ま しくは約２ｇ／！〜約５　ｇ　／　Ｒ、最も好ましくは約３ｇ／ｊ！の濃度に維 持される０発酵培地中の尿素濃度は、約１００ｇ／ｌの濃度を有する濃厚尿素供 給材料の添加によりこれらの範囲内に維持される。

発酵培地中のホスフェ−）（Ｐｏｄの濃度は、約０．０３ｇ／ｌ〜約０．３ｇ／ ／！、更に好ましくは約０．０５　ｇ　／　１〜約０．２　ｇ　／　ｅ、最も好 ましくは約０．１ｇ／ｊ！に維持される。これらの濃度は、約１５．７５ｇ／ｊ ！の濃度を有する濃厚リン酸カリウム供給材料の添加により維持される。リン酸 カリウムを添加することによりホスフェートの濃度を維持することに加えて、ス ルフェート濃度がまたリン酸カリウム供給材料中に硫酸マグネシウムを含むこと により、硫酸マグネシウムを発酵培地に添加することにより維持される。供給材 料中の硫酸マグネシウムは約１１．３７ｇ／７！の濃度を有する。

グルコース、グリシン、尿素、ホスフェート及びスルフェートの供給材料が発酵 培地に添加されて発酵培地中のこれらの化合物の濃度を得、または維持すること が認識されるべきである。従って、上記で与えられた添加剤供給材料の濃度は本 発明に重要ではなく、また未発明を限定窄るち・つでは７χい１、本発明の発酵 方法に於いて、発酵培地は１−記のようとこし１′期製、−゛すれる。この培地 はリボフラビン生産微生吻、特ムニカンジダ　）７１．・すの株の培養菌で植菌 されろ６満足な発酵・任得るために、稙−ｊ、ｒ最小植菌密度を確立する必要が ある。発酵方法は、細胞増殖が進１ｊするために初Ｂ最小植菌Ｗ！度を必要とす ることが、良く認識される。

本発明の方法に於ける最小植菌密度は測定されなかったが、初期植菌が６２０ｎ ｍで約０．０６の光学密度（１１キュベツト）を得る場合に、満足な発酵が得ら れ得ることが、測定された。一層高い初期密度を与える植菌が許容し得るが、細 胞増殖前の誘導時間を短縮する。約０．０６未満の初期植菌密度では、細胞増殖 が開始する前の誘導時間が一層長くなり、最終的に、増殖を支持しない最小植菌 密度に到達する。

発酵培地が植菌された後、発酵が進行させられ、グルコース、グリシン、尿素、 ホスフェート及びスルフェートの濃度が監視され、上記の濃度に維持される０発 酵中、培地の温度は、約り９℃〜約３１℃、更に好ましくは約２９．５℃〜約３ ０．５℃、最も好ましくは約２９．９℃〜約３０．１℃に維持されるべきである 。

発酵培地中の溶解酸素は、微生物による利用に充分な酸素を与えるレベル以上に 維持される必要がある。培地の溶解Ｍ素含量は、通気及び攪拌により調節し得る 。培地の溶解酸素含量は、飽和の約２０％以上、更に好ましくは飽和の約４０％ 以上に保たれることが好ましい。

培地のｐＨは、植菌の前に調節される。培地のｐｉｆは、ＫＯＨ。

ＮａＯＨの如き、当業界で既知の種々の化合物の添加により調節し得る。この初 期ｐＨは約６〜約８、更に好ましくは約６．５〜約７．５、最も好ましくは約６ ．９〜７．０であり得る９発酵中、培地のｐＨは、細胞増殖及びリボフラビンの 大きな増加が起こるのとほぼ同じ時期に著しく低下することが認められた。また 、これらの変化はホスフェート、グルコース、尿素、及びグリシンの添加に対す る最初の要求と一致する。典型的には、培地のこの酸性化は、約３５時間〜約５ ５時間、更に典型的には約４０時間〜約５０時間、最も典型的には約４２時間〜 約４８時間で観察される。

典型的には、培地のｐｉｆは３．５程度の低さ、更に典型的には約３．９に低下 する。発酵方法の残りの期間中に、ｐＨは典型的に約３．９〜約６．０、更に典 型的に約３．９〜約５．５、最も典型的に約３．９〜約５．１に留まる。ついで 、培地の１１１は典型的に約５．０〜約７．０、更に典型的に約６．０〜約７． ０に上昇してもどる。このρ１１の上昇が起こる時に、細胞増殖が一般に停止す る。

以下の実験結果は、説明の目的で示されるのであり、本発明の範囲を眼定するこ とを目的とするものではない。

実施例　１ ０一ル管リボフラビン分析 株Ｂのコｏ＝−を、補充特定培地（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ口ｅｒｉｎｅｄＭ ｅｄｉｕｆｆｌ）　（表１−八を参照のこと＞２．５献を含む試験管に植菌し、 適度に撹拌して３０℃で４日間増殖させた。２献の補充特定培地を含む試験管に 増殖培養菌０．０２＋ｎｆを植菌し、適度に撹拌して３０℃で７日間培養した。

培養菌を５００のファクターにより希釈し、６０℃〜７０℃で４０分間加熱して リボフラビン結晶を溶解した。

溶解された溶液の４４５ｎｍでの吸光度は０．２４５であった。この値を５００ 倍して希釈について修正し、３１．３を掛けてリボフラビンの濃度３．８Ｘ１０ ″ｍｇ／Ｉｌ即ち３．８　ｇ　／　ｊ２を得る。

表　１−Ａ 立　± ＦｅＣｊ！ｉ　・６Ｈｚ　ＯＯ，２μｇ／ｄＹＭＧ培地　１０　％ 蔗　ＩＩ　６　％ 去ＩＬｕ 巷−」（ユ沢 株Ｃを、ＮＴＧ濃度０．１０１１ｇ／−で室温で６０分間ＮＴＧ突然変異誘発に かけた。これらの突然変異細胞を回収し、洗浄し、生理食塩水に懸濁した。突然 変異細胞を、２−デオキシグルコース７５０μｇ／ｄを含む補充特定培地に塗布 した。１０日後、抵抗性突然変異体の１２５のコロニーを同定し、上記のロール 管すボフラビン分析によりリボフラビン生産に関して試験した０株りは、１．５ ８ｇ／Ｊ／７日のりポフラビンキ産能力を有する最も生産性のある突然変異体で あった。

上記のようにして、株りを０．１０＋ｇ／−のＮＴＧｔｌ１度で室温で６０分間 ＮＴＧ突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄し、等容量の生理 食塩水に懸濁した。この培養菌を、リボフラビン合成に充分な基質を与えるため の２．２３％のグリシン及び５μｇ／−の濃度のＰｅＣ１ｘ　・６Ｈ２０を含む 補充特定培地に塗布した。３０℃で１０日間培養した後、抵抗性の突然変異体の ２５のコロニーを同定し、上記のロール管すボフラビン分析によりリポフラｔ゛ ンイ・成Ｃ１’　ｌ’ｉ’ｉ　Ｌ　７　ｗ（験し１、・、り］゛然変胃体株１ミ は、１．７０　ｇ　／　１　、／　７ｉ、：、ｊ　（Ｊｊ　’、ｔ　、ｉ′；’ 　′−’ｊ、−７！Ｉ　ｎ、７ｍ力を会゛「る似＠　ノリｊ：　−，７テ）４− 　：べＳ７産株ｒ{ っ　人゛、　、 ４ｊＩ　Ｅ、　４　、、　Ｏ，１，Ｏｗ＋ｇ７’ｔｄ　（７）　Ｎ　”ｌ”　Ｇ 　’ｄ１ｇ　？Ｆ車室温保思、　６０３ｆ　”？Ｆ　ｈｉ　s　Ｇ ″ｆ、然変異語発ζこかけｉ７＝、処理さ指だ細胞を回収し　洗浄し、等容置の 生理食塩水に懸濁した。株Ｅ’Ｅ補充特定培地中で３０“Ｃの温度で３週間撹拌 して増殖することにより、枯渇培地を調製りまた。細胞を、遠心分離及び０．５ ５ミクロンの膜フィルターによる濾過により、この培養物から除去した。蔗糖（ ６％）、グリシン（０，２３％）、及び寒天（２％）を上澄液に添加した。株Ｅ の突然変異培養菌を、この培地に塗布し、３０℃で１０日間培養した。黄色を有 する３５のコロニーを同定し、ロール管すボフラビン分析によりリボフラビン生 産に関して試験した。株Ａは、この選択操作から誘導されたものであり、２．５ ｇ／／！／７日のりポフラビン生産能力を有する。

株Ａを、０．１０ｍｇ／−の濃度で室温で保温６０分でＮＴＧ突然変異誘発にか けた。処理された細胞を回収し、洗浄し、等容量の生理食塩水に懸濁した。

未突然変異株Ａ細胞を、３０℃の４５ｏ！の発酵槽中で、表３に記載された培地 中で１０日間撹拌して増殖することにより、枯渇培地を調製した。細胞を限外濾 過により、この培養物から除去した。

固体の選択培地を、液体容量の５０％が細胞を含まない枯渇培地であり、液体容 量の残りの５０％が水であるもので調製した。突然変異株Ａ細胞を、この培地に 塗布し、３０℃で１０日間培養した。抵抗性の突然変異体の６０のコロニーを同 定し、リボフラビン生産に関して試験した０株Ｆは、ロール管すボフラビン分析 で３．４ｇ／ｆ７７日のりポフラビン生産能力を有する、この方法からの最高の りポフラビンプロデューサーであった。

１１　Ｆ　’Ｇ　、　Ｏ，Ｉ　ＯＩｌ＋１ｇ、／　ｄ　のＮ　ＴＧ’ａ）Ｕ　（ Ｆ’１ｖＷｒｆ　イーＱ　６　０　分１１　Ｔ’Ｎ　Ｔ　ＩＪ突然変ｎ　誘Ｒｌ ：　カ弓１．：　ｏ　＄　ｆ牙ｉ　８１７．　Ｌｒ、　ｄｉ　Ｊ’（セ４１　＄ ）閉尺ｉ２、ンス：　Ｓ＋　{、。

生理食塩水に懸濁？−１た。、＝　、７ｔらの細胞（Ｉυ（（μｇ／’ｒａＲの ソベハ・／ジン挽−でλむ補充特・定培用・−２の選ｉ尺Ｉごか（，１ノー１． ；ダｏｔ：ｒｔｏ１＋　１１１１１．培養１．＝ｆ、・後、生存株の？５の：Ｊ 　Ｏゴ・−を同定し、リボフラビン生ｇｌ；：関し７で試験した。１株Ｂは、３ ．８　ｇ　／　ｌ　／　７日のリボフラビン牛産簡力を有する最もフラビノゲニ ックな株であった。

また、株Ａは、第二選択方法の出発集団であった。株への培養菌を、０．１０ｍ ｇ／ｍ１！の濃度で室温で保温６０分でＮ　Ｔ　Ｇ突然変異誘発にかけた。処理 された細胞を回収し、洗浄し、生理食塩水に懸濁した。突然変異細胞を、１００ μｇ／ｄのツベルシジンを含む補充特定培地に塗布することにより、この培１１ 菌をツベルシジン選択にかけた。３０℃で１０日間培養した後、２０の生存コロ ニーを選択し、リボフラビン生産に関して試験した。株Ｇは、２．９　ｇ　／　 Ａ’　／　７日を生産する最もフラビノゲニックな株であった。

株Ｇは、紫外線感受性選択方法の出発集団であった。株Ｇを、０、１０　ｍｇ、 ／　ｍの濃度で室温で保温６０分でＮＴＧ突然変異誘発にかけた。処理された細 胞を回収し、洗浄し、生理食塩水に！！濁した。

この細胞懸濁液を１：１０’に希釈し、１０００個の細胞／献の細胞濃度を生じ た。０．１　ｍｌの細胞懸濁液をＹＭＧ培地に塗布し、３０℃で３日間培養した 。この時点で、コロニーが目視でき、新しい寒天プレートに２回複製された。最 初の複製を、上部に外被なしに、１７Ｊ／ｍ″の紫外線に露出した。照射したプ レートを、未照射ｍ！！プレートと共に暗所で３０℃で４日間培養してコロニー を形成させた。照射プレートと未照射プレートを比較して、紫外線感受性突然変 異体を示す非生存コロニーを同定した。これらの突然変異体を未照射プレート上 で同定し、リボフラビン生産に関して分析した。この方法により、１４のコロニ ーを同定し、最高の生産性突然変異体は株Ｈであり、これは７日間で３．　Ｌ　 ｇ　／　１のリボフラビンを生産し得る。

実施例　３ リボフラビン生産試験番号１を、１４ｆの発酵槽中で行なった。

この試験の発酵培地の組成を表３に示す、グルコース以外の全ての培地成分を、 培地の残りに導入する前に、発酵タンク中に滅菌濾過した。グルコースを１２１ ℃、１．１睦／ａｄ　（１５ｐｓｉ　）で３０分間オートクレーブで処理した。

培地のｐ）Ｉを、植菌の前に６．９〜７．０に調節した。発酵タンクを、６２０ 　ｎｍで０．０６の初期光学密度（１１のキュベラ日を与える株Ａの培養菌で植 菌した。

試験番号１を２４０時間行なった。この期間中、６２０ｎｍに於ける光学密度、 リボフラビン、ｐＨ１温度、グリシン、尿素、ボスフェート及びグルコースを監 視した。この発酵の結果を表ｍ−Ａ及び＋１１−Ｂに示す。最終りポフラビン濃 度１５．９３ｇ／Ｉ！を２４０時間で得た。

表１［１−Ａ 時　間　光学密度　リボフラビン　温　度（ｈ）　（６２０ｎｓ＋）　（ｇ／　 ６）　ｐＨ（’Ｃ）０　０．０６　０．０００　６．９２　３０２６．５　１． ４１　０．０１８　６．０１　３０４５．５　２５．２５　０．４６５　３．９ ７　２９．７７５．５　１０５．０　３．２５　４．４　２９．７１０３．０　 １２９．０　６．４　４．７　２９．６１２７．０　１２１．０　８．０１　５ ．０６　２９．６１４３．５　１２２．０　９．１７　５．０２　２９．５１？ ４．５　１０９．０　１０．９４　４．７４　２９．７１９０．５　１４２．０ 　１２．９６　４．３５　２９．６２０４．０　１５２．０　１３．６２　４． ２５　２９．７２４０．０　１６９　１５．９３　３．９２　２９．４表ｍ−Ｂ 時　間　グリシン　尿　素　ホスフェート　り゛ルーコース（ｈ）　（ｇ／ｌ　 （ｇ＃り　（ｇ／ｌ）　（ｇ／１２）０　４．４３　４．５２　０．６５０　７ ４．８３２　４．４０　４．９９　０．５８７　８０．３４５．５　４．１３　 ３．８４　０．３５８　５７．２５６　３．０６　３．３０　０．０８７　２９ ．９７０　４．００　３．６２　０．２９８　３２．１８５　４．４４　３．４ ８　０．２７６　３１．２１０３　４．０９　２．９６　０．２６８　４０．３ １２７．５　４．００　３．７７　０．３３０　４１．９１４３．５　４．３２ 　１，３１　０．１８３　４６．７１６７．５　３．１５　５．１４　０．３３ ７　５０．９１９０．５　２．７０　５．９３　０．１２８　３３．４２１５． ５　２．４０　５，８６　０．１０１　３５．３２４０．０　２．０　６．５１ 　０．１７５　３４．３実施例　４ リボフラビン生産試験番号２を４５０１の発酵タンク中で行なｐｚ、２００時間 実験した０発酵培地及び植菌を、実施例３と同し方法で調製した。この試験の結 果を表ＩＶ−Ａに示す。試験番号２で２００時間の終了時に、最終りポフラビン 濃度２１．０ｇ／ｌを得た。

表ＩＶ−Ａ 時　間　光学密度　リボフラビン　温度　グリシン　尿　素　グルツース（ｈ） 　（６２０ｎｓ）　（ｇ／ｊ）　ｐＨ（’Ｃ）　（ｇ／Ｊ）　（ｇ／ｌ）　（ｇ ／ｆｆ１）０　０．０６　０．０　６．９５　３０　５．２　４．２　６８．８ ４０　２５．０　０．０　４．６０　３０　４．０　２．４　４７．８６０　５ ０．０　２．５　５．４０　３０　６．８　３．４　３２．２８０　１５０　６ ．０　５．２　３０　６．７　４．４　４３．０１００　１？５　９．０　５． ９　３０　７．５　６．５　４７．９１．４０　２２５　１５．０　５．０　３ ０　７．０　７．７　４４．５２００　２１０　２１．０　５．３　３０　７． ０　６．３　４７．２実施例　５ リボフラビン生産試験番号３を４５０１の発酵タンク中で行ない、２００時間実 験した０発酵培地及び植菌を、実施例３と同じ方法で調製した。この試験の結果 を表Ｖ−Ａに示す、この試験で２００時間の終了時に、最終りポフラビン濃度１ ６．０　ｇ　／　Ｉｔを得た。

表Ｖ−Ａ 時　間　光学密度　リボフラビン　温　度（ｈ）　（６２０ｎ＋ｓ）　（ｇ／　 １）　ｐ）Ｉ　（℃）２００　１８０　１６．０　４．４　３０表　Ｖ−Ａ　（ 続き） 時　間　グリシン　尿　素　ホスフェート　り゛ルーコース（ｈ　）　（ｇ／　 １　）　（ｇ／β）　（ｇ／　１　）　（ｇ／　（１）８０　４．５　２．８　 ０．０７０　３５．４２００　０．７　５．７　０．１００　４４．２実施例　 ６ ＦｅＳＯ４・７Ｈｚ　０４度をＯｍｇ／ｌ、１＋＋ｇ／ｌ、２ｖｒｇ／ｌ、及び ３＋＋ｇ／７！の濃度に変化させた以外は、全ての条件を一定に保って、一連の 試験を行なった０表３に示した発酵培地を用いて、１５０１のパイロ７）規模の タンク中で発酵を行なった。更に、下記の組成物を発酵培地に添加した。

一皿一底−１−−１１」工／Ａ） 酵母抽出物　１．０４ モルト抽出物　１．０４ ペプトン　１．７３ 株Ａを発酵試験に使用した０発酵中に、細胞増殖及びリボフラビン生産を監視し た。表Ｖｌ−Ａは四つの発酵中の細胞増殖の結果を示す。表ＶＴ−Ｂは四つの発 酵のりポフラビン生産の結果を示す。表■−Ｃは四つの発酵の夫々に関してリボ フラビン生産対細胞増殖の最終の比を示す０表■−Ｃに見られるように、一層高 いＦｅ５Ｏａ　・７Ｈ２Ｏ濃度で、細胞重量当り生産されるリボフラビンの量は 増加する。この比の実質的な増加は１ｍｇ／Ｉｌ及び２■ｇ／ｌで得られるが、 ２−ｇ／ｌと３ｗ５ｇ／ｉとの間の増加は最小である。

表ｔ−Ａ 極飽鉋案　細胞重重　細胞重置　細胞重置リボフラビン　リボフラビン　リボフ ラビン　ＩＪボフラビン１５４　３．１９　６．５２　９．３４　’　１０．２ ０表ＶＩ−Ｃ 株Ａの単位増殖当りに生産されるリポフラビン−−−−−−−−−−−−−−− −−−−０，２００，２８０，３５０，３６細胞重量　（ｇ＃り 実施例　７ 株Ａに関して枯渇培地の効果を測定ｒるために、一連の試験を行なった。表３に 示された発酵培地を用いて、発酵を１４７！の発酵福生で９０時間行なった４、 試験の夫々に関して、枯渇培地を、発酵培地を構成する液体の異なる部分で使用 した以外は、全ての条件は同じであった。第一の試験は枯渇培地をもたず、第二 の試験は２０％を有し、第三の試験は４０％を有し、第四の試禮は５０％を有し 、第五の試験は８０％を存した９発酵試験中、種々の時間間隔で試験の夫々に関 するリボフラビン生産を表■−Ａに示す。

表■−Ａ リボフラビン生産（ｇ　／　ｌ　）に及ぼす枯渇培地の効果Ｏ％　２０％　４０ ％　６０％　８０％時間　枯渇培地　枯渇培地　枯渇培地　枯渇培地　枯渇培地 ４２　０．５　１．１　０．６　０．３　０．０５Ｂ　１．３　２．４　１．４ 　０．６　０．４７４　３．１　４．５　２．６　１．２　０．７８９　４．９ 　６．１　４．６　２．６　１．９リボフラビン生産の初期の刺激が、２０％の 枯渇培地で観察される。しかしながら、枯渇培地の増加濃度で、リボフラビン生 産は次第に抑制される。

本発明の種々の態様が詳細に記載されたが、これらの態様の変更及び適応が当業 者に思いつくことが明らかである。しかしながら、このような変更及び適応が請 求の範囲に示される本発明の範囲内にあることが、明らかに理解されるべきであ る。

特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ■、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１８７６３、特許出願人 名　称　クアーズ　バイオチック　インコーホレーテッド５、補正書の提出年月 日　１９８８年１０月１３日浄冒ｒ［′１芥に夏史なし） ン゛の １．６日間で発酵培地１１当り少なくとも約１０ｇのりボフラビンを生産し得る カンジダ　ファマタの株。

２、株がＡＴＣＣ登録番号２０８４９及びその突然変異体により同定される、カ ンジダ　ファマタの株。

３、株がＡＴＣＣ登録番号２０８５０及びその突然変異体により同定される、カ ンジダ　ファマタの株。

５、上記の株が枯渇培地による増殖の抑制に対して抵抗性である、請求の範囲１ 項記載のカンジダ　ファマタの株。

６、上記の株がデオキソグルコースによる増殖の抑制に対して抵抗性である、請 求の範囲１項記載のカンジダ　ファマタの株。

７．８）水性栄養培地中で第一微生物の集団を細胞増殖が停止するま〜で増殖し 、 ｂ）　上記の第一微生物を上記の水性栄養培地から除去して枯渇培地を形成し、 Ｃ）　上記の枯渇培地を、未突然変異第二微生物の集団に関して最小阻止濃度で 含む選択培地を形成し、 ｄ）第二微生物の集団を突然変異し、 ｅ）第二微生物の上記の突然変異集団を上記の選択培地に導入し、次いで ｆ）第二微生物の上記の突然変異集団から、枯渇培地による抑制に対し抵抗性の 微生物の株を選択し、上記の選択された微生物の株が上記の選択培地で増殖する 能力を有することを特徴とする、枯渇培地による抑制に対し抵抗性の微生物の選 択方法。

８、　上記の選択培地が炭素、窒素、及び無機栄養素の同化し得る源を更に含む 請求の範囲７項記載の方法。

９、上記の枯渇培地が上記の選択培地の少なくとも約５０％を特徴する請求の範 囲７項記載の方法。

１０、上記の微生物を除去する上記の工程が、遠心分離及び濾過からなる群から 選ばれた工程を含む、請求の範囲７項記載の方法。

１１、上記の第二微生物が酵母のリボフラビン生産株である、請求の範囲７項記 載の方法。

１２、上記の第二微生物がカンジダ　ファクタの株である、請求の範囲７項記載 の方法。

１３、上記の第一微生物と上記の第二微生物が同じ種の微生物である、請求の範 囲７項記載の方法。

１７、請求の範囲７項記載の方法により選択された微生物。

１９、ＡＴＣＣ登録番号２０８４９及び２０８５０により同定された株、ＡＴＣ Ｃ登録番号２０８４９及び２０８’５０の突然変異体並びにこれらの混合物から なる群から選ばれた種カンジダ　ファクタの酵母のりボフラビン生産株を発酵培 地中で培養することによりリボフラビンの生産方法であって、 ａ）約５．４μＭ〜約１５μＭの鉄濃度を与える鉄の源並びに炭素、窒素、及び 微量栄養素の同化し得る源を含む発酵培地に上記の酵母の株を植菌し、 ｂ）細胞増殖及びリボフラビン生産を支持するのに充分な栄養素濃度を上記の発 酵培地中に維持し、ついでＣ）　リボフラビンを上記の発酵培地から回収するこ とを特徴とする、上記のりボフラビンの生産方法。

２０、上記の発酵培地が約１ｇ７１〜約Ｔｇ／ｌの濃度でグリシノを更に含む、 請求の範囲１９項記載の方法。

２１、上記の維持工程が少な（とも約６日行なわれ、少なくとも約１０ｇ／ｊの リボフラビンが生産される請求の範囲１９項記載の方法。

２４、上記の発酵培地が ａ）約１ｇ７１〜約７　ｇｅｌの濃度のグリシノ、ｂ）　ホスフェートの源、 Ｃ）　スルフェートの源、及び ｄ）　コバルト、銅、ホウ素、モリブデン、マンガン、亜鉛、カリウム、及びマ グネシウムの源 を更に含む、請求の範囲１９項記載の方法。

２５、炭素源がグルコースを含み、窒素源が尿素を含み、ホスフェート源がＫＨ ！　ｐｏ４を含み、マグネシウム及びスルフェートの源がＭｇＳＯ４を含み、コ バルト源がＣＯ３Ｏ４を含み、銅源がＣｕ　Ｓ　Ｏａを含み、ホウ素源がＨｚＢ Ｏｚを含み、モリブデン源が（Ｎ　Ｈａ　）　６　Ｍｏｗ　Ｏｚａを含み、マン ガン源がＭｎ５Ｏｎを含み、且つ亜鉛源がＺｎ　Ｓ　Ｏａを含む、請求の範囲２ ４項記載の方法。

２６ａ）微生物の第一種の集団を、細胞増殖が停止するまで、水性栄養培地中で 増殖し、 ｂ）上記の微生物の第一種を上記の水性栄養培地から除去して枯渇培地を得、 Ｃ）上記の枯渇培地を、リボフラビンを生産する能力を有する微生物の第二種に 関して最小阻止濃度で含む選択培地を形成し、ｄ）上記の微生物の第二種の集団 を突然変異して第一突然変異集団を得、 ｅ）上記の第一突然変異集団を上記の選択培地に導入し、ｆ）上記の第一突然変 異集団から、枯渇培地による抑制に対し抵抗性である微生物の第一の改良株を選 択し、ｇ）上記の微生物の第一の改良株の集団を突然変異して第二突然変異集団 を得、 ｈ）上記の微生物の第一の改良株に関して最小■止濃度でツベルクリンを含む栄 養培地で上記の第二突然変異集団を培養し、ついで ｉ）上記の第二突然変異集団から、上記の栄養培地でコロニーを形成する能力を 有する微生物の第二の改良株を選択することを特徴とする、改良されたリボフラ ビン生産微生物の選択方法。

２７、上記の枯渇培地が上記の選択培地の少なくとも約５０％を構成する請求の 範囲２６項記載の方法。

２８、微生物の上記の第一種と上記の第二種が同し種である、請求の範囲２６項 記載の方法。

２９、ツベルクリンが約１００μｇ／−より大きい濃度で上記の突然変異体培地 中に存在する、請求の範囲２６項記載の方法。

３０、上記の微生物の第二の株がカンジダ　ファクタの株である、請求の範囲２ ６項記載の方法。

特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１８７６３、特許出願人 名　称　クアーズ　バイオチック　インコーポレーテ・ンド６、添付書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１　通 ｆ％書□内容に変更なし） Ｕ−一の−」［−皿、 １．６日間で発酵培ｉ１ｉ！１ｆｆｉ当り少なくとも約１０ｇのりボフラビンを 生産し得るカンジダ　ファマタの株。

２、株がＡＴＣＣ登録番号２０８４９及びその突然変異体により同定される、カ ンジダ　ファマタの株。

３、株がＡＴＣＣ登録番号２０８５０及びその突然変異体により同定される、カ ンジダ　ファマタの株。

５、上記の株が選択培地で増殖でき、その選択培地がｉａｌカンジダファマタの 集団を細胞増殖が停止するまで水性栄養培地中で増殖し、ついで（ｂｌ工程（ａ ｌのカンジダ　ファマタの上記の集団を上記の水性栄養培地から除去して選択剤 を得ることを含む方法により得られた選択剤を含む、請求の範囲１項記載のカン ジダ　ファマタの株。

６、上記の株がデオキシグルコースによる増殖の抑制に対して抵抗性である、請 求の範囲１項記載のカンジダ　］１マタの株。

１３、上記の第一微生物と上記の第二微生物が同し種の微生物である、請求の範 囲ｊ項記載の方法。

１７、請求の範囲７項記載の方法により選択された微生物。

１９、種カンジダ　ファマタの酵母のりポフラビン生産株を発酵培地中で培養す ることによるリボフラビンの生産方法であって、ａ）約５．４μＭ〜約１５μＭ の鉄濃度を与える鉄の源並びに炭素、窒素、及び微量栄養素の同化し得る源を含 む発酵培地に酵母の株を植菌し、 上記の酵母の株がＡＴＣＣ登録番号２０８４９及び２０８５０により同定された 株、ＡＴＣＣ登録番号２０８４９及び２０８５０の突然変異体並びにこれらの混 合物からなる群から選ばれ、上記の突然変異体が６日間で発酵培地ｌＡ当り少な くとも約Ｌｏｇのリボフラビンを生産し、 ｂ）　細胞増殖及びリボフラビン生産を支持するのに充分な栄養素濃度を上記の 発酵培地中に維持し、次いてＣ）　リボフラビンを上記の発酵培地から回収する ことをｖｆ徴とする、上記のリボフラビンの生産方法。

２０、上記の発酵培地が約１ｇ／ｌ〜約７ｇ／ｌの濃度でグリシンを更に含む、 請求の範囲１９項記載の方法。

２１、上記の維持工程が少なくとも約６日行なわれ、少なくとも約１０ｇ＃のリ ボフラビンが生産される請求の範囲１９項記載の方法。

２４、上記の発酵培地が ａ）　約１ｇ／ｌ〜約７　ｇ／ｌの濃度のグリシン、ｂ）　ホスフェートの源、 Ｃ）　スルフェートの源、及び ｄ）　コバルト、銅、ホウ素、モリブデン、マンガン、亜鉛、カリウム、及びマ グネシウムの源 を更に含む、請求の範囲１９項記載の方法。

２５、炭素源がグルコースを含み、窒素源が尿素を含み、ホスフェート源がＫＨ ｚＰＯ４を含み、マグネシウム及びスルフェートの源がＭｇＳＯ４を含み、コバ ルト源がＣｏ５０ａを含み、銅源がＣｕ　Ｓ　Ｏａを含む、請求の範囲２４項記 載の方法。

２６ａ）微生物の第一種の集団を、細胞増殖が停止するまで、水性栄養培地中で 増殖し、 ｂ）上記の微生物の第一種を上記の水性栄養培地から除去して枯渇培地を得、 Ｃ）上記の枯渇培地を、リボフラビンを生産する能力を有する微生物の第二種に 関して最小阻止濃度で含む選択培地を形成し、ｄ）上記の微生物の第二種の集団 を突然変異して第一突然変異集団を得、 ｅ）上記の第一突然変異集団を上記の選択培地に導入し、「）上記の第一突然変 異集団から、枯渇培地による抑制に対し抵抗性である微生物の第一の選択株を選 択し、ｇ）上記の微生物の第一の選択株の集団を突然変異して第二突然変異集団 を得、 ｈ）上記の微生物の第一の選択株に関して最小阻止濃度でツベルクリンを含む栄 養培地で上記の第二突然変異集団を培養し、次いで １）上記の第二突然変異集団から、上記の栄養培地でコロニーを形成する能力を 有する微生物の第二の選択株を選択することを特徴と、する、リボフラビン生産 微生物の選択方法。

２７、上記の枯渇培地が上記の選択培地の少なくとも約５０％を特徴する請求の 範囲２６項記載の方法。

２８、微生物の上記の第一種と上記の第二種が同じ種である、請求の範囲２６項 記載の方法。

２９、ツベルクリンが約１００μｇ／ｒｎ１．より大きい濃度で上記の栄養培地 中に存在する、請求の＠囲２６項記載の方法。

３０、上記の微生物の第二の株がカンジダ　ファマタの株である、請求の範囲２ ６項記載の方法。

手続補正書（方式） ％式％ ３、補正をする者 事件との関係　比　願　人 名　称　クアーズ　バイオチック　インコーホレーテッド５、補正命令の日付　 自　発 平成　年　月　日

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．６日間で発酵培地１ｌ当り少なくとも１０ｇのリボフラビンを生産し得るカ ンジダフラレリの株。
2. ２．上記の株がＡＴＣＣ登録番号２０８４９及びその突然変異により同定される 、請求の範囲１項記載のカンジダフラレリの株。
3. ３．上記の株がＡＴＣＣ登録番号２０８５０及びその突然変異により同定される 、請求の範囲１項記載のカンジダフラレリの株。
4. ４．上記の株が、細胞重量当りのリボフラビン生産が約３．５マイクロモルより 多い濃度の鉄により増進されるという特性を有する、請求の範囲１項記載のカン ジダフラレリの株。
5. ５．上記の株が枯渇培地による増殖の抑制に対して抵抗性である、請求の範囲１ 項記載のカンジダフラレリの株。
6. ６．上記の株がデオキシグルコースによる増殖の抑制に対して抵抗性である、請 求の範囲１項記載のカンジダフラレリの株。
7. ７．ａ）水性栄養培地中で第一微生物の集団を細胞増殖が停止するまで増殖し、 ｂ）上記の第一微生物を上記の水性栄養培地から除去して枯渇培地を形成し、 ｃ）上記の枯渇培地を含む選択培地を形成し、ｄ）第二微生物の集団を突然変異 し、 ｅ）第二微生物の上記の突然変異集団を上記の選択培地に導入し、ついで ｆ）第二微生物の上記の突然変異集団から、上記の選択培地で増殖する能力を有 する改良微生物を選択することを特徴とする、改良微生物の選択方法。
8. ８．上記の選択培地が炭素、窒素、及び無機栄養素の同化し得る源を更に含む請 求の範囲７項記載の方法。
9. ９．上記の枯渇培地が上記の選択培地の少なくとも約５０％を構成する、請求の 範囲７項記載の方法。
10. １０．上記の微生物を除去する上記の工程が、遠心分離及び濾過からなる群から 選ばれた工程を含む、請求の範囲７項記載の方法。
11. １１．上記の第二微生物が酵母のリボフラビン生産株である、請求の範囲７項記 載の方法。
12. １２．上記の第二微生物がカンジダフラレリの株である、請求の範囲７項記載の 方法。
13. １３．上記の第一微生物と上記の第二微生物が同じ種の微生物である、請求の範 囲７項記載の方法。
14. １４．ａ）微生物の出発集団を突然変異し、ｂ）上記の突然変異集団中の少なく とも幾つかの微生物によるコロニー形成を抑制するために有効な濃度でツベルシ ジンを含む栄養培地で上記の突然変異集団を培養し、ついでｃ）上記の栄養培地 でコロニーを形成する能力を有する微生物を上記の突然変異集団から選択する ことを特徴とする、改良されたリボフラビン生産能力を有するリボフラビン生産 微生物の選択方法。
15. １５．ツベルシジンが約１００μｇ／ｍｌより大きい濃度で上記の培地中に存在 する、請求の範囲１４項記載の方法。
16. １６．上記の微生物がカンジダ属の酵母である、請求の範囲１４項記載の方法。
17. １７．請求の範囲７項記載の方法により選択された微生物。
18. １８．請求の範囲１４項記載の方法により選択された微生物。
19. １９．発酵培地中で請求の範囲１項記載の株のリボフラビン生産微生物を培養す ることによるリボフラビンの生産方法であって、ａ）約５．４μＭ〜約１５μＭ の鉄濃度を与える鉄の源並びに炭素、窒素、及び微量栄養素の同化し得る源を含 む発酵培地に上記の微生物を植菌し、 ｂ）細胞増殖及びリボフラビン生産を支持するのに充分な栄養素濃度を上記の発 酵培地中に維持し、次いでｃ）リボフラビンを上記の発酵培地から回収すること を特徴とする、上記のリボフラビンの生産方法。
20. ２０．上記の発酵培地が約１ｇ／ｌ〜約７ｇ／ｌの濃度でグリシンを更に含む、 請求の範囲１９項記載の方法。
21. ２１．上記の維持工程が少なくとも約６日間行なわれ、少なくとも約１０ｇ／ｌ のリボフラビンが生産される請求の範囲１９項記載の方法。
22. ２２．カンジダフラレリの上記の株がＡＴＣＣ登録番号２０８４９及びその突然 変異により同定される、請求の範囲１９項記載の方法。
23. ２３．カンジダフラレリの上記の株がＡＴＣＣ登録番号２０８５０及びその突然 変異により同定される請求の範囲１９項記載の方法。
24. ２４．上記の発酵培地が ａ）約１ｇ／ｌ〜約７ｇ／ｌの濃度のグリシン、ｂ）ホスフェートの源、 ｃ）スルフェートの源、及び ｄ）コバルト、銅、ホウ素、モリブデン、マンガン、亜鉛、カリウム、及びマグ ネシウムの源 を更に含む、請求の範囲１９項記載の方法。
25. ２５．炭素源がグルコースを含み、窒素源が尿素を含み、ホスフェート源がＫＨ ２ＰＯ４を含み、マグネシウム及びスルフェートの源がＭｇＳＯ４を含み、コバ ルト源がＣｏＳＯ４を含み、銅源がＣｕＳＯ４を含み、ホウ素源がＨ３ＢＯ３を 含み、モリブデン源が（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４を含み、マンガン源がＭｎＳＯ ４を含み、且つ亜鉛源がＺｎＳＯ４を含む、請求の範囲２４項記載の方法。