JP3061809B2 - 微生物のリボフラビン生産株、選択方法及び発酵方法 - Google Patents
微生物のリボフラビン生産株、選択方法及び発酵方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は、1985年12月20日に出願された、共有で譲渡
された米国特許出願第811,234号の一部継続出願であ
る。
された米国特許出願第811,234号の一部継続出願であ
る。
発明の分野 本発明は、多量のリボフラビンを生産する能力を有す
る微生物、特に増大量のリボフラビンを生産する酵母カ
ンジダ フラレリ（Candida flareri）の株及びそれら
の微生物の発酵方法に関する。更に、本発明はリボフラ
ンビオーバープロデューサー（overproducer）を選択す
る方法に関する。
る微生物、特に増大量のリボフラビンを生産する酵母カ
ンジダ フラレリ（Candida flareri）の株及びそれら
の微生物の発酵方法に関する。更に、本発明はリボフラ
ンビオーバープロデューサー（overproducer）を選択す
る方法に関する。
発明の背景 リボフラビンは、生物の代謝要求を大巾に越える量
で、多種の微生物により合成される。アシュブャ ゴシ
ピイ（Ashbya gossypii）及びエレモセシウム アシュ
ビイ（Eremothecium ashybii）の如き子嚢菌類は、発酵
によるリボフラビンの生産に関して知られている。典型
的に、これらの生産により生産されたリボフラビンは、
飼料添加剤として使用される。
で、多種の微生物により合成される。アシュブャ ゴシ
ピイ（Ashbya gossypii）及びエレモセシウム アシュ
ビイ（Eremothecium ashybii）の如き子嚢菌類は、発酵
によるリボフラビンの生産に関して知られている。典型
的に、これらの生産により生産されたリボフラビンは、
飼料添加剤として使用される。
また、その他の微生物によるリボフラビン生産が知ら
れている。例えば、クロストリジウム属及びバシラス属
に属するバクテリア、並びにカンジダ、サッカロミセ
ス、ハンセニューラ、及びピチア（Pichia）を含む種々
の属の酵母がリボフラビン生産に関して知られる。更に
詳細には、例えば、マツバヤシらの米国特許第3,433,70
7号（1969年）は、ピチア酵母の三つの種によるリボフ
ラビンの生産を記載している。12日間で10.5mg/〜51m
g/のリボフラビンの収量が報告された。パールマン
（Perlman）著、代謝の一次産物（Primary Products of
Metabolism）、2Econ、Microbiology、312頁（1978
年）に記載されているように、6.42g/のアシュブャ
ゴシピイによるリボフラビン過剰生産（overproductio
n）が、スゼクゼスニアク（Szczesniak）ら（1973年）
により報告された。
れている。例えば、クロストリジウム属及びバシラス属
に属するバクテリア、並びにカンジダ、サッカロミセ
ス、ハンセニューラ、及びピチア（Pichia）を含む種々
の属の酵母がリボフラビン生産に関して知られる。更に
詳細には、例えば、マツバヤシらの米国特許第3,433,70
7号（1969年）は、ピチア酵母の三つの種によるリボフ
ラビンの生産を記載している。12日間で10.5mg/〜51m
g/のリボフラビンの収量が報告された。パールマン
（Perlman）著、代謝の一次産物（Primary Products of
Metabolism）、2Econ、Microbiology、312頁（1978
年）に記載されているように、6.42g/のアシュブャ
ゴシピイによるリボフラビン過剰生産（overproductio
n）が、スゼクゼスニアク（Szczesniak）ら（1973年）
により報告された。
共有で譲渡された米国特許出願第811,234号（1985年1
2月20日出願）は、増大されたリボフラビン生産を有す
るカンジタ フラレリの株の発生を報告する。米国特許
出願第811,234号に記載されたカンジダ フラレリの株
は、発酵６日間で１当り5gのリボフラビンを生産し
た。
2月20日出願）は、増大されたリボフラビン生産を有す
るカンジタ フラレリの株の発生を報告する。米国特許
出願第811,234号に記載されたカンジダ フラレリの株
は、発酵６日間で１当り5gのリボフラビンを生産し
た。
リボフラビン生産酵母の代謝要求の研究は、鉄の濃度
に対するリボフラビン生産感受性を報告した。例えば、
ストラウベ（Straube）ら著、カンジダ ギリエルモン
ジイの増殖及びリボフラビン過剰生産に及ぼす鉄濃度及
び温度の影響（The Influence of Iron Concentration
and Temperature on Growth and Riboflavin Overprodu
ction of Candida Guilliermondii）、Biotechnology a
nd Bioengineering Symposium No.4,225〜231頁（1973
年）は、10-5Mの鉄濃度がリボフラビンの生産を殆ど完
全に抑制すること、及びリボフラビン生産が鉄濃度にほ
ぼ反比例することを報告する。また、ストラウベらは、
コバルトの存在が鉄のリボフラビン生産抑制効果を反転
し得ることを見い出した。10-4Mのコバルト濃度及び10
-5Mの鉄濃度で、コバルトが存在せず鉄が10-7Mに制限さ
れた場合と同じ量のリボフラビンが生産された。
に対するリボフラビン生産感受性を報告した。例えば、
ストラウベ（Straube）ら著、カンジダ ギリエルモン
ジイの増殖及びリボフラビン過剰生産に及ぼす鉄濃度及
び温度の影響（The Influence of Iron Concentration
and Temperature on Growth and Riboflavin Overprodu
ction of Candida Guilliermondii）、Biotechnology a
nd Bioengineering Symposium No.4,225〜231頁（1973
年）は、10-5Mの鉄濃度がリボフラビンの生産を殆ど完
全に抑制すること、及びリボフラビン生産が鉄濃度にほ
ぼ反比例することを報告する。また、ストラウベらは、
コバルトの存在が鉄のリボフラビン生産抑制効果を反転
し得ることを見い出した。10-4Mのコバルト濃度及び10
-5Mの鉄濃度で、コバルトが存在せず鉄が10-7Mに制限さ
れた場合と同じ量のリボフラビンが生産された。
その他の文献は、リボフラビン生産微生物の鉄感受性
を記載しており、特に鉄感受性が発酵培地へのコバル
ト、亜鉛またはキレート化剤の添加により部分的に解決
し得ることを記載している。
を記載しており、特に鉄感受性が発酵培地へのコバル
ト、亜鉛またはキレート化剤の添加により部分的に解決
し得ることを記載している。
チョプデ（Chopde）ら著、サイトファーガ フチンソ
ニイによるリボフラビン合成を影響する因子（Factors
Influencing Riboflavin Synthesis by Cytophaga Hutc
hinsonii）、Indian J.of Microbiology、20巻、２号
（1980年）、シリー（Schlee）ら著、リボフラビン生成
の生理学及び生化学（Physiology and Biochemistry of
Riboflavin Formation）、Die Pharmazie、12号（1984
年）を参照のこと。
ニイによるリボフラビン合成を影響する因子（Factors
Influencing Riboflavin Synthesis by Cytophaga Hutc
hinsonii）、Indian J.of Microbiology、20巻、２号
（1980年）、シリー（Schlee）ら著、リボフラビン生成
の生理学及び生化学（Physiology and Biochemistry of
Riboflavin Formation）、Die Pharmazie、12号（1984
年）を参照のこと。
鉄はリボフラビン生産を抑制するが、増大された量の
鉄は細胞増殖を刺激することがまた報告された。従っ
て、フラビノゲネシス（flavinogenesis）の鉄の抑制に
対して減少された感受性を有する酵母は、多量のリボフ
ラビンを生産すべきである。何となれば、一層高い細胞
密度が鉄濃度を増加することにより得ることができるか
らである。
鉄は細胞増殖を刺激することがまた報告された。従っ
て、フラビノゲネシス（flavinogenesis）の鉄の抑制に
対して減少された感受性を有する酵母は、多量のリボフ
ラビンを生産すべきである。何となれば、一層高い細胞
密度が鉄濃度を増加することにより得ることができるか
らである。
鉄の存在に対してリボフラビン生産の減少された感受
性を有するリボフラビン生産微生物の株が報告された。
ソ連特許第330189号（アブストラクト）、西ドイツ特許
第108767号（アブストラクト）を参照のこと。
性を有するリボフラビン生産微生物の株が報告された。
ソ連特許第330189号（アブストラクト）、西ドイツ特許
第108767号（アブストラクト）を参照のこと。
従って、リボフラビン生産の改良されたレベルを有す
る微生物に対する要望がある。リボフラビン生産の鉄の
抑制に対して抵抗性を有するフラビノゲニック（flavin
ogenic）微生物の株に対して、更に要望がある。更に、
リボフラビン過剰生産微生物を選択するための改良方法
に対する要望がある。また、増大された細胞増殖及びフ
ラビノゲネシスを支持する発酵培地に対する要望があ
る。本発明の微生物は、フラビノゲニック微生物の野生
型株を大巾に越え、しかも既知の発生された株の収量よ
り非常に改良される量でリボフラビンを生産する。
る微生物に対する要望がある。リボフラビン生産の鉄の
抑制に対して抵抗性を有するフラビノゲニック（flavin
ogenic）微生物の株に対して、更に要望がある。更に、
リボフラビン過剰生産微生物を選択するための改良方法
に対する要望がある。また、増大された細胞増殖及びフ
ラビノゲネシスを支持する発酵培地に対する要望があ
る。本発明の微生物は、フラビノゲニック微生物の野生
型株を大巾に越え、しかも既知の発生された株の収量よ
り非常に改良される量でリボフラビンを生産する。
発明の要約 本発明は、６日間で１当り10gのリボフラビンを生
産し得る酵母カンジダ フラレリの株に関する。200時
間で１当り20g以上のリボフラビン収量が得られた。
夫々、ATCC登録番号第20849号及び同第20850号で同定さ
れたカンジダ フラレリ株Ａ及びＢは、本発明の最もフ
ラビノゲニックな株である。別の態様に於いて、本発明
は、フラビノゲネシスの鉄の抑制に対して減少された感
受性を有するカンジダ フラレリの株を伴なう。このよ
うな株は、発酵培地中で増大された鉄濃度で細胞当りの
増大されたリボフラビン生産の特性を有する。また、カ
ンジダ フラレリの発生された株は、枯渇培地（deplet
ed media）による、及びデオキシグルコースによる、増
殖の抑制に対する抵抗性に関して選択された。
産し得る酵母カンジダ フラレリの株に関する。200時
間で１当り20g以上のリボフラビン収量が得られた。
夫々、ATCC登録番号第20849号及び同第20850号で同定さ
れたカンジダ フラレリ株Ａ及びＢは、本発明の最もフ
ラビノゲニックな株である。別の態様に於いて、本発明
は、フラビノゲネシスの鉄の抑制に対して減少された感
受性を有するカンジダ フラレリの株を伴なう。このよ
うな株は、発酵培地中で増大された鉄濃度で細胞当りの
増大されたリボフラビン生産の特性を有する。また、カ
ンジダ フラレリの発生された株は、枯渇培地（deplet
ed media）による、及びデオキシグルコースによる、増
殖の抑制に対する抵抗性に関して選択された。
別の態様に於いて、本発明は、枯渇培地による増殖の
抑制に対して抵抗性である改良された微生物を選択する
方法を伴なう。このような微生物は、一層高い細胞密度
に増殖して一層多量の代謝産物を生産する能力を有す
る。この方法は、まず、細胞増殖が停止するまで微生物
の集団を増殖することにより枯渇培地をつくることを伴
なう。ついで、微生物が培地から除去されて枯渇培地を
形成する。ついで、枯渇培地を含む選択培地が形成され
る。ついで、微生物の第二集団が、突然変異誘発を受
け、選択培地に導入される。枯渇培地で増殖する能力を
有する突然変異集団の株が選択される。微生物の第二集
団は、枯渇培地を形成した第一集団と同じ種のものであ
ることが好ましく、同じ株のものであることが更に好ま
しい。
抑制に対して抵抗性である改良された微生物を選択する
方法を伴なう。このような微生物は、一層高い細胞密度
に増殖して一層多量の代謝産物を生産する能力を有す
る。この方法は、まず、細胞増殖が停止するまで微生物
の集団を増殖することにより枯渇培地をつくることを伴
なう。ついで、微生物が培地から除去されて枯渇培地を
形成する。ついで、枯渇培地を含む選択培地が形成され
る。ついで、微生物の第二集団が、突然変異誘発を受
け、選択培地に導入される。枯渇培地で増殖する能力を
有する突然変異集団の株が選択される。微生物の第二集
団は、枯渇培地を形成した第一集団と同じ種のものであ
ることが好ましく、同じ株のものであることが更に好ま
しい。
更に別の態様に於いて、本発明は、多量のリボフラビ
ンを生産する微生物を選択する方法を伴なう。この方法
は微生物の出発集団を突然変異させることを伴なう。つ
いで、突然変異集団が、おそらくプリン代謝を抑制する
抗生物質ツベルシジン（tubercidin）を含む栄養培地で
培養される。ツベルシジンは、突然変異集団中の微生物
の幾つかによるコロニー形成を抑制するのに有効な濃度
で栄養培地中に存在する。ついで、ツベルシジン培地で
コロニーを形成する能力を有する微生物が選択される。
ついで、このような微生物は、リボフラビン過剰生産に
関して試験し得る。この選択方法は、リボフラビンオー
バープロデューサーを選択することがわかった。
ンを生産する微生物を選択する方法を伴なう。この方法
は微生物の出発集団を突然変異させることを伴なう。つ
いで、突然変異集団が、おそらくプリン代謝を抑制する
抗生物質ツベルシジン（tubercidin）を含む栄養培地で
培養される。ツベルシジンは、突然変異集団中の微生物
の幾つかによるコロニー形成を抑制するのに有効な濃度
で栄養培地中に存在する。ついで、ツベルシジン培地で
コロニーを形成する能力を有する微生物が選択される。
ついで、このような微生物は、リボフラビン過剰生産に
関して試験し得る。この選択方法は、リボフラビンオー
バープロデューサーを選択することがわかった。
本発明の別の態様は、本発明の微生物の株を発酵培地
中で培養することによりリボフラビンを生産する方法を
含む。増大されたリボフラビン生産が、約5.4μＭ〜約1
5μＭの培地中の鉄濃度により達成し得る。また、発酵
培地は約7g/までの濃度のグリシンを含む。発酵は、
培地中の栄養素濃度及びその他の発酵条件を維持して細
胞増殖及びリボフラビン生産を支持することにより行な
われる。細胞増殖が横ばいになった後、リボフラビンが
発酵培地から回収される。
中で培養することによりリボフラビンを生産する方法を
含む。増大されたリボフラビン生産が、約5.4μＭ〜約1
5μＭの培地中の鉄濃度により達成し得る。また、発酵
培地は約7g/までの濃度のグリシンを含む。発酵は、
培地中の栄養素濃度及びその他の発酵条件を維持して細
胞増殖及びリボフラビン生産を支持することにより行な
われる。細胞増殖が横ばいになった後、リボフラビンが
発酵培地から回収される。
詳細な説明 改良された量のリボフラビンを生産する、種カンジダ
フラレリのリボフラビン生産酵母の株が、発生され
た。144時間で培地１当り10g以上のリボフラビンの収
量が日常的に得られ、200時間で１当り20g以上のリボ
フラビンの収量が得られた。本発明の株は野生型のカン
ジダ フラレリより30〜40倍もフラビノゲニックであ
り、最高の既知のリボフラビンプロデューサーより3.5
倍もフラビノゲニックである。
フラレリのリボフラビン生産酵母の株が、発生され
た。144時間で培地１当り10g以上のリボフラビンの収
量が日常的に得られ、200時間で１当り20g以上のリボ
フラビンの収量が得られた。本発明の株は野生型のカン
ジダ フラレリより30〜40倍もフラビノゲニックであ
り、最高の既知のリボフラビンプロデューサーより3.5
倍もフラビノゲニックである。
特に、株Ａ、ATCC登録番号20849は、200時間の発酵実
験で20g以上のリボフラビンを生産し得る。2mlのロール
管リボフラビン分析で測定して株Ａよりもフラビノゲニ
ックである種々の株が株Ａから発生された。この分析
（実施例の部分で詳細に記載される）は、リボフラビン
収量を最大にすることに関して設計されるものではない
が、同一条件下の微生物の株の間のフラビノゲネシスの
比較に使用される。株Ｂ、ATCC登録番号20850、は株Ａ
から発生され、ロール管分析で株Ａよりも50％多くフラ
ビノゲニックである。
験で20g以上のリボフラビンを生産し得る。2mlのロール
管リボフラビン分析で測定して株Ａよりもフラビノゲニ
ックである種々の株が株Ａから発生された。この分析
（実施例の部分で詳細に記載される）は、リボフラビン
収量を最大にすることに関して設計されるものではない
が、同一条件下の微生物の株の間のフラビノゲネシスの
比較に使用される。株Ｂ、ATCC登録番号20850、は株Ａ
から発生され、ロール管分析で株Ａよりも50％多くフラ
ビノゲニックである。
本発明のカンジダ フラレリの株は、リボフラビン合
成の鉄の抑制に対して減少された感受性を有する。上記
の如く、鉄は多くの微生物、特に酵母カンジダの種に於
けるリボフラビン合成のインヒビターであることが報告
された。発酵培地中の増大された鉄は、本発明のカンジ
ダ フラレリ株の細胞増殖を増大するだけではなく、細
胞重量当りのリボフラビン生産をも増大することがわか
った。リボフラビンは高い鉄濃度から増大された細胞増
殖により増加すると予想されるが、観察されるリボフラ
ビン増加は、増大された細胞増殖単独から予想される増
加よりも大きい。従って、本発明の鉄に対し抵抗性があ
る株に於けるフラビノゲネシスは、鉄の抑制に対し非感
受性であるだけではなく、細胞基準で一層高い鉄濃度に
より刺激される。
成の鉄の抑制に対して減少された感受性を有する。上記
の如く、鉄は多くの微生物、特に酵母カンジダの種に於
けるリボフラビン合成のインヒビターであることが報告
された。発酵培地中の増大された鉄は、本発明のカンジ
ダ フラレリ株の細胞増殖を増大するだけではなく、細
胞重量当りのリボフラビン生産をも増大することがわか
った。リボフラビンは高い鉄濃度から増大された細胞増
殖により増加すると予想されるが、観察されるリボフラ
ビン増加は、増大された細胞増殖単独から予想される増
加よりも大きい。従って、本発明の鉄に対し抵抗性があ
る株に於けるフラビノゲネシスは、鉄の抑制に対し非感
受性であるだけではなく、細胞基準で一層高い鉄濃度に
より刺激される。
本発明に於いて、カンジダ フラレリの鉄に対し抵抗
性の株に関するリボフラビン生産の刺激は、約3.6マイ
クロモル（μＭ）の鉄濃度で検出された。しかしなが
ら、約16.1μＭの濃度より高いと、鉄は、これらの株で
さえも、そのリボフラビン合成を抑制する傾向がある。
発酵中、約5.40μＭ〜約15μＭ、更に好ましくは約6.12
μＭ〜約12μＭ、最も好ましくは約9.8μＭ〜約10.8μ
Ｍの鉄のモル濃度を有することが好ましい。
性の株に関するリボフラビン生産の刺激は、約3.6マイ
クロモル（μＭ）の鉄濃度で検出された。しかしなが
ら、約16.1μＭの濃度より高いと、鉄は、これらの株で
さえも、そのリボフラビン合成を抑制する傾向がある。
発酵中、約5.40μＭ〜約15μＭ、更に好ましくは約6.12
μＭ〜約12μＭ、最も好ましくは約9.8μＭ〜約10.8μ
Ｍの鉄のモル濃度を有することが好ましい。
株Ａ及びその子孫のその他の重要な代謝特性は、培養
菌が終端細胞密度まで増殖された発酵培地中の増殖及び
リボフラビン生産の抑制に対する抵抗性である。このよ
うな培地は“枯渇培地”と称される。このような抵抗性
は、一層高い細胞密度を得ることにより一層高いリボフ
ラビン収量の生産を可能にする。また、これらの株は、
細胞基準でリボフラビンの増大された収量を生産するこ
とがわかった。
菌が終端細胞密度まで増殖された発酵培地中の増殖及び
リボフラビン生産の抑制に対する抵抗性である。このよ
うな培地は“枯渇培地”と称される。このような抵抗性
は、一層高い細胞密度を得ることにより一層高いリボフ
ラビン収量の生産を可能にする。また、これらの株は、
細胞基準でリボフラビンの増大された収量を生産するこ
とがわかった。
本発明の説明は、本明細書に於いて酵母カンジダ フ
ラレリに関してなされる。カンジダ フラレリは、また
トルロプシス カンジダとして知られる。しかしなが
ら、本発明の方法及びプロセスは、カンジダ属のその他
の種並びにその他のリボフラビン過剰生産性の酵母及び
微生物に同様に適用し得る。従って、カンジダ フラレ
リへの特別な言及は、本発明の範囲を、この特別な種に
限定することを意図するものではない。
ラレリに関してなされる。カンジダ フラレリは、また
トルロプシス カンジダとして知られる。しかしなが
ら、本発明の方法及びプロセスは、カンジダ属のその他
の種並びにその他のリボフラビン過剰生産性の酵母及び
微生物に同様に適用し得る。従って、カンジダ フラレ
リへの特別な言及は、本発明の範囲を、この特別な種に
限定することを意図するものではない。
本発明に従って、微生物の改良されたリボフラビン生
産株は、微生物の培養菌を突然変異させ、ついでリボフ
ラビン生産に関して改良された特性を有する株を選択す
る方法により選択される。典型的には、突然変異微生物
が、或種の抑制化合物を含む固体培地で培養される。イ
ンヒビターの存在下で形成するコロニーが培養され、リ
ボフラビン生産に関して試験される。ついで、多いリボ
フラビン生産を有する微生物の株が選択される。
産株は、微生物の培養菌を突然変異させ、ついでリボフ
ラビン生産に関して改良された特性を有する株を選択す
る方法により選択される。典型的には、突然変異微生物
が、或種の抑制化合物を含む固体培地で培養される。イ
ンヒビターの存在下で形成するコロニーが培養され、リ
ボフラビン生産に関して試験される。ついで、多いリボ
フラビン生産を有する微生物の株が選択される。
微生物の培養菌の突然変異誘発は、当業界で既知の種
々の手段のいずれかで行なうことができ、化学的もしく
は物理的な突然変異誘発のいずれも含み得る。例えば、
本発明に適する化学的突然変異原は、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアナジン、ジエポキシブタ
ン、エチルメタンスルホネート、カラシ化合物（mustar
dcompounds）、ヒドラジン、及び亜硝酸を含むが、これ
らに限定されない。物理的突然変異原は、紫外線及びγ
線を含むが、これらに限定されない。出発培養菌が、特
別な大きさの生存集団を残すのに充分な強さで突然変異
誘発剤に暴露される。その大きさは突然変異源の間で変
化し、突然変異源が所定の死滅率で生存集団中に誘発す
る突然変異の量に依存する。例えば、NTGに関して所望
の死滅率は出発集団の約10％〜50％を残すべきである。
亜硝酸突然変異誘発は出発集団の約0.01％〜0.1％を残
すべきであり、紫外線突然変異誘発は約1.0％を残すべ
きである。このようにして処理された細胞が回収され、
洗浄され、生理食塩水の如き非増殖支持性培地中で懸濁
される。ついで、このような細胞が、一つ以上の選択方
法にかけ得る。
々の手段のいずれかで行なうことができ、化学的もしく
は物理的な突然変異誘発のいずれも含み得る。例えば、
本発明に適する化学的突然変異原は、Ｎ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアナジン、ジエポキシブタ
ン、エチルメタンスルホネート、カラシ化合物（mustar
dcompounds）、ヒドラジン、及び亜硝酸を含むが、これ
らに限定されない。物理的突然変異原は、紫外線及びγ
線を含むが、これらに限定されない。出発培養菌が、特
別な大きさの生存集団を残すのに充分な強さで突然変異
誘発剤に暴露される。その大きさは突然変異源の間で変
化し、突然変異源が所定の死滅率で生存集団中に誘発す
る突然変異の量に依存する。例えば、NTGに関して所望
の死滅率は出発集団の約10％〜50％を残すべきである。
亜硝酸突然変異誘発は出発集団の約0.01％〜0.1％を残
すべきであり、紫外線突然変異誘発は約1.0％を残すべ
きである。このようにして処理された細胞が回収され、
洗浄され、生理食塩水の如き非増殖支持性培地中で懸濁
される。ついで、このような細胞が、一つ以上の選択方
法にかけ得る。
カンジダ フラレリのリボフラビン過剰生産株の幾つ
かの中間株が、下記の選択方法を用いて株Ａ及びＢの発
生に於いて選択された。株Ｃ、ATCC登録番号20755号、
は野生型カンジダ フラレリから幾つかの選択方法によ
り発生され、米国特許第811,234号に記載されている。
株Ｃは、Ａ及びＢを含む下記の株の先祖（predecesso
r）である。株Ｃは、2mlロール管分析で７日間で1.1g/
のリボフラビンを生産し得る。出発集団として株Ｃを
用いて、グルコース類似体選択方法がリボフラビンオー
バープロデューサーを選択するのに行なわれた。
かの中間株が、下記の選択方法を用いて株Ａ及びＢの発
生に於いて選択された。株Ｃ、ATCC登録番号20755号、
は野生型カンジダ フラレリから幾つかの選択方法によ
り発生され、米国特許第811,234号に記載されている。
株Ｃは、Ａ及びＢを含む下記の株の先祖（predecesso
r）である。株Ｃは、2mlロール管分析で７日間で1.1g/
のリボフラビンを生産し得る。出発集団として株Ｃを
用いて、グルコース類似体選択方法がリボフラビンオー
バープロデューサーを選択するのに行なわれた。
本発明に従って、リボフラビンオーバープロデューサ
ーは、グルコースの類似体に対して抵抗性である微生物
を選択することにより選択し得る。微生物のこのような
株は、グルコースを蓄積する点、グルコースをリボフラ
ビンに変換する点、またはグルコース抑制を解決する点
で、一層有効であるようである。従って、リボフラビン
生産微生物の出発培養菌が、上記のように突然変異され
る。ついで、突然変異集団が抑制濃度のグルコース類似
体またはそれらの混合物を含む培地に塗布される。塗布
された突然変異細胞からの生存コロニーが、グルコース
類似体による抑制に対する抵抗性に関して選択される。
ついで、これらのコロニーが、リボフラビン生産に関し
て試験される。
ーは、グルコースの類似体に対して抵抗性である微生物
を選択することにより選択し得る。微生物のこのような
株は、グルコースを蓄積する点、グルコースをリボフラ
ビンに変換する点、またはグルコース抑制を解決する点
で、一層有効であるようである。従って、リボフラビン
生産微生物の出発培養菌が、上記のように突然変異され
る。ついで、突然変異集団が抑制濃度のグルコース類似
体またはそれらの混合物を含む培地に塗布される。塗布
された突然変異細胞からの生存コロニーが、グルコース
類似体による抑制に対する抵抗性に関して選択される。
ついで、これらのコロニーが、リボフラビン生産に関し
て試験される。
グルコース類似体の濃度は、類似体の抑制効果及び類
似体によるリボフラビン生産の抑制に対する培養菌の出
発感受性を含む、幾つかの因子に依存性である。典型的
には、最小阻止濃度実験が行なわれて、類似体が未突然
変異出発集団中の増殖を抑制する最小濃度を測定する。
この最小濃度は、一般に選択方法に使用される濃度であ
るが、抵抗性の突然変異体の増殖さえもが抑制される濃
度までの一層高い濃度が使用し得ることが、認識される
べきである。２−デオキシグルコースがグルコース類似
体である場合には、約700μg/ml〜約1500μg/ml、更に
好ましくは約700μg/ml〜約1000μg/ml、最も好ましく
は約700μg/ml〜約800μg/mlの濃度が望ましい。
似体によるリボフラビン生産の抑制に対する培養菌の出
発感受性を含む、幾つかの因子に依存性である。典型的
には、最小阻止濃度実験が行なわれて、類似体が未突然
変異出発集団中の増殖を抑制する最小濃度を測定する。
この最小濃度は、一般に選択方法に使用される濃度であ
るが、抵抗性の突然変異体の増殖さえもが抑制される濃
度までの一層高い濃度が使用し得ることが、認識される
べきである。２−デオキシグルコースがグルコース類似
体である場合には、約700μg/ml〜約1500μg/ml、更に
好ましくは約700μg/ml〜約1000μg/ml、最も好ましく
は約700μg/ml〜約800μg/mlの濃度が望ましい。
株Ｄは、株Ｃが突然変異され選択される出発集団であ
る、グルコース類似体選択方法により選択された。株Ｄ
は、2mlのロール管分析で７日間で1.58g/のリボフラ
ビンを生産し得る。この株は、リボフラビンオーバープ
ロデューサーを選択するための鉄感受性選択方法の出発
集団として使用された。
る、グルコース類似体選択方法により選択された。株Ｄ
は、2mlのロール管分析で７日間で1.58g/のリボフラ
ビンを生産し得る。この株は、リボフラビンオーバープ
ロデューサーを選択するための鉄感受性選択方法の出発
集団として使用された。
上記の如く、リボフラビン生産は少量の鉄により抑制
されることが報告されていた。今般、鉄の抑制に対して
減少された感受性を有する微生物のリボフラビン生産株
を発生することが望ましいことが認識された。何となれ
ば、その株は増大された細胞増殖を支持し得る高い鉄濃
度を有する培地中で培養し得るからである。
されることが報告されていた。今般、鉄の抑制に対して
減少された感受性を有する微生物のリボフラビン生産株
を発生することが望ましいことが認識された。何となれ
ば、その株は増大された細胞増殖を支持し得る高い鉄濃
度を有する培地中で培養し得るからである。
鉄に対して減少された感受性を有するリボフラビンプ
ロデューサーを選択するために、微生物の培養菌が上記
の方法で突然変異される。得られた培養菌が、高い鉄濃
度の存在下で炭素元素、窒素元素、及び無機元素の同化
し得る源を含む、固体培地に広げられる。例えば、好適
な培地は、2.23％のグリシンで補充されたYMG培地（表
１を参照のこと）である。突然変異細胞は、リボフラビ
ン生産に適した温度で、この培地で増殖される。リボフ
ラビン生産の鉄の抑制に対して増殖された抵抗性のない
突然変異体は、リボフラビンが過剰生産されないので、
白色もしくはクリーム色のコロニーを形成する。しかし
ながら、鉄によるリボフラビン生産の抑制に対して増大
された抵抗性をもつ突然変異体コロニーは、リボフラビ
ンの存在により黄色である。このような黄色コロニー
が、高いリボフラビンオーバープロデューサーに関して
試験し得る。
ロデューサーを選択するために、微生物の培養菌が上記
の方法で突然変異される。得られた培養菌が、高い鉄濃
度の存在下で炭素元素、窒素元素、及び無機元素の同化
し得る源を含む、固体培地に広げられる。例えば、好適
な培地は、2.23％のグリシンで補充されたYMG培地（表
１を参照のこと）である。突然変異細胞は、リボフラビ
ン生産に適した温度で、この培地で増殖される。リボフ
ラビン生産の鉄の抑制に対して増殖された抵抗性のない
突然変異体は、リボフラビンが過剰生産されないので、
白色もしくはクリーム色のコロニーを形成する。しかし
ながら、鉄によるリボフラビン生産の抑制に対して増大
された抵抗性をもつ突然変異体コロニーは、リボフラビ
ンの存在により黄色である。このような黄色コロニー
が、高いリボフラビンオーバープロデューサーに関して
試験し得る。
選択方法中の鉄濃度は、その他の因子の中で、出発集
団の鉄感受性に依存する。例えば、鉄感受性プロセスが
野生型カンジダ フラレリの出発集団に対して行なわれ
た場合には、選択のための鉄濃度は、出発集団がリボフ
ラビン生産の鉄の抑制に対して減少された感受性に関し
て既に選択されたカンジダ フラレリの株であった場合
よりも低いであろう。グルコース類似体選択に関して上
記されたように、鉄濃度は典型的には最小阻止濃度実験
により選択される。本発明によれば、約５μＭ〜約50μ
Ｍ、更に好ましくは約10μＭ〜約30μＭ、最も好ましく
は約16μＭ〜約20μＭの鉄のモル濃度が、減少された鉄
感受性を選択するのに有効である。
団の鉄感受性に依存する。例えば、鉄感受性プロセスが
野生型カンジダ フラレリの出発集団に対して行なわれ
た場合には、選択のための鉄濃度は、出発集団がリボフ
ラビン生産の鉄の抑制に対して減少された感受性に関し
て既に選択されたカンジダ フラレリの株であった場合
よりも低いであろう。グルコース類似体選択に関して上
記されたように、鉄濃度は典型的には最小阻止濃度実験
により選択される。本発明によれば、約５μＭ〜約50μ
Ｍ、更に好ましくは約10μＭ〜約30μＭ、最も好ましく
は約16μＭ〜約20μＭの鉄のモル濃度が、減少された鉄
感受性を選択するのに有効である。
株Ｅは、出発集団として株Ｄを用いる鉄感受性プロセ
スにより選択された。株Ｅは、2mlのロール管分析で７
日間で1.70g/のリボフラビンを生産し得る。この株
は、リボフラビンオーバープロデューサーを選択するた
めの枯渇培地選択法の出発集団として使用された。
スにより選択された。株Ｅは、2mlのロール管分析で７
日間で1.70g/のリボフラビンを生産し得る。この株
は、リボフラビンオーバープロデューサーを選択するた
めの枯渇培地選択法の出発集団として使用された。
リボフラビンオーバープロデューサーは、枯渇培地で
の増殖抑制に対する抵抗性により選択し得る。実験室酵
母培養菌の如き密閉生物系に於いて、細胞増殖及び生物
生産物の生産は、過剰の栄養素の存在下であっても、最
終的に停止することが知られている。カンジダ フラレ
リの細胞増殖及びリボフラビン生産の停止の理由は知ら
れていないが、三つの理由がこの現象の少なくとも一部
の原因となるものと思われる。殆どの微生物は、所定の
濃度より低い微量の栄養素を使用する点で、不充分であ
ると考えられる。従って、このような微量の栄養素が所
定の濃度まで枯渇される際に、増殖が抑制される。第二
の可能な理由は、増殖相及びリボフラビン生産相の間
に、なお一層の増殖及びリボフラビン生産に対し阻害性
である物質が副生物として生産されることである。第三
の可能な理由は、高濃度の供給された培地成分または未
使用培地成分が増殖を抑制し得ることである。この選択
方法は、枯渇培地で増殖しリボフラビンを生産し得る微
生物の選択に関する。このような微生物は、低水準で微
量栄養素を利用する点で一層有効であり、且つ／または
増殖相及びリボフラビン生産相の間に生産された阻害化
合物または抑制化合物に対して抵抗性であると考えられ
る。所定の出発培地及び発酵条件に関して、細胞増殖及
びリボフラビン生産が一層長い期間にわたって続いて一
層多い収量のリボフラビン生産を生じるので、このよう
な選択微生物が有益である。
の増殖抑制に対する抵抗性により選択し得る。実験室酵
母培養菌の如き密閉生物系に於いて、細胞増殖及び生物
生産物の生産は、過剰の栄養素の存在下であっても、最
終的に停止することが知られている。カンジダ フラレ
リの細胞増殖及びリボフラビン生産の停止の理由は知ら
れていないが、三つの理由がこの現象の少なくとも一部
の原因となるものと思われる。殆どの微生物は、所定の
濃度より低い微量の栄養素を使用する点で、不充分であ
ると考えられる。従って、このような微量の栄養素が所
定の濃度まで枯渇される際に、増殖が抑制される。第二
の可能な理由は、増殖相及びリボフラビン生産相の間
に、なお一層の増殖及びリボフラビン生産に対し阻害性
である物質が副生物として生産されることである。第三
の可能な理由は、高濃度の供給された培地成分または未
使用培地成分が増殖を抑制し得ることである。この選択
方法は、枯渇培地で増殖しリボフラビンを生産し得る微
生物の選択に関する。このような微生物は、低水準で微
量栄養素を利用する点で一層有効であり、且つ／または
増殖相及びリボフラビン生産相の間に生産された阻害化
合物または抑制化合物に対して抵抗性であると考えられ
る。所定の出発培地及び発酵条件に関して、細胞増殖及
びリボフラビン生産が一層長い期間にわたって続いて一
層多い収量のリボフラビン生産を生じるので、このよう
な選択微生物が有益である。
枯渇培地選択法によれば、枯渇培地は、微生物の初期
培養菌を、細胞増殖が停止するか、または横ばいになる
まで、好ましくは最後の静止相まで、増殖することによ
り調製される。枯渇培地は、選択工程で選択しようとす
る微生物の同じ種、好ましくは同じ株を培養することに
より調製されることが好ましい。微生物は微量の栄養素
を枯渇し阻害化合物を生産するが、選択される突然変異
集団が初期集団を増殖停止させた枯渇培地からの同じ環
境ストレスを受ける場合に、選択が最も効果的である。
初期集団が突然変異集団と異なる場合には、初期集団中
の増殖は、微量ミネラルの枯渇、または突然変異集団に
ストレスを与えないことがある阻害化合物もしくは抑制
化合物の生産により制限され得る。
培養菌を、細胞増殖が停止するか、または横ばいになる
まで、好ましくは最後の静止相まで、増殖することによ
り調製される。枯渇培地は、選択工程で選択しようとす
る微生物の同じ種、好ましくは同じ株を培養することに
より調製されることが好ましい。微生物は微量の栄養素
を枯渇し阻害化合物を生産するが、選択される突然変異
集団が初期集団を増殖停止させた枯渇培地からの同じ環
境ストレスを受ける場合に、選択が最も効果的である。
初期集団が突然変異集団と異なる場合には、初期集団中
の増殖は、微量ミネラルの枯渇、または突然変異集団に
ストレスを与えないことがある阻害化合物もしくは抑制
化合物の生産により制限され得る。
初期培養中の増殖及び生産物の生産が停止した後、細
胞が培養物から除去されて枯渇培地を形成する。分離
は、当業者に既知の種々の手段により行ない得る。例え
ば、細胞は遠心分離により培地から除去し得る。また、
細胞は限外濾過により除去し得る。
胞が培養物から除去されて枯渇培地を形成する。分離
は、当業者に既知の種々の手段により行ない得る。例え
ば、細胞は遠心分離により培地から除去し得る。また、
細胞は限外濾過により除去し得る。
選択培地は、上記の枯渇培地を使用して調製される。
炭素、窒素及び無機栄養素の源が枯渇培地に添加されて
枯渇培地に抵抗性の株の選択のための選択培地を形成し
得る。枯渇培地に添加される栄養素の量及び型は変化し
得る。例えば、蔗糖及びグリシンの如き、炭素及び窒素
源が、枯渇培地に添加し得る。また、枯渇培地は4B培地
（表２を参照のこと）の如き栄養培地と種々の割合で混
合されてもよい。枯渇培地と栄養培地の相対割合は、最
小阻止濃度実験を行ない、未突然変異集団中の増殖を抑
制する最少量の枯渇培地を使用することにより決定し得
る。
炭素、窒素及び無機栄養素の源が枯渇培地に添加されて
枯渇培地に抵抗性の株の選択のための選択培地を形成し
得る。枯渇培地に添加される栄養素の量及び型は変化し
得る。例えば、蔗糖及びグリシンの如き、炭素及び窒素
源が、枯渇培地に添加し得る。また、枯渇培地は4B培地
（表２を参照のこと）の如き栄養培地と種々の割合で混
合されてもよい。枯渇培地と栄養培地の相対割合は、最
小阻止濃度実験を行ない、未突然変異集団中の増殖を抑
制する最少量の枯渇培地を使用することにより決定し得
る。
選択方法は、リボフラビン生産微生物の出発集団を上
記のようにして突然変異誘発にかけて突然変異集団を形
成することにより行なわれる。突然変異集団は枯渇培地
選択培地に導入される。典型的には、枯渇培地による抑
制に対して増大された抵抗性をもたない微生物は、選択
培地で生存しない。枯渇培地選択培地で形成するコロニ
ーが、枯渇培地に対して増大された抵抗性を有すること
に関して選択される。ついで選択されたコロニーがリボ
フラビン生産に関して試験される。
記のようにして突然変異誘発にかけて突然変異集団を形
成することにより行なわれる。突然変異集団は枯渇培地
選択培地に導入される。典型的には、枯渇培地による抑
制に対して増大された抵抗性をもたない微生物は、選択
培地で生存しない。枯渇培地選択培地で形成するコロニ
ーが、枯渇培地に対して増大された抵抗性を有すること
に関して選択される。ついで選択されたコロニーがリボ
フラビン生産に関して試験される。
株Ａは、出発集団として株Ｅを用いる枯渇培地選択方
法により選択された。細胞が初期培養物から遠心分離に
より除去されて枯渇培地を形成した。枯渇培地は滅菌さ
れて、残存細胞が0.5ミクロンの膜フィルターを用いる
濾過により除去された。選択培地は、蔗糖及びグリシン
を上澄液を添加することにより形成された。株Ａは、ロ
ール管分析で2.5g/のリボフラビンを生成し得る。株
Ａを出発集団として付加的な枯渇培地選択法が行なわれ
た。
法により選択された。細胞が初期培養物から遠心分離に
より除去されて枯渇培地を形成した。枯渇培地は滅菌さ
れて、残存細胞が0.5ミクロンの膜フィルターを用いる
濾過により除去された。選択培地は、蔗糖及びグリシン
を上澄液を添加することにより形成された。株Ａは、ロ
ール管分析で2.5g/のリボフラビンを生成し得る。株
Ａを出発集団として付加的な枯渇培地選択法が行なわれ
た。
この第二の枯渇培地選択法は、2mlのロール管分析で
７日間で3.4g/のリボフラビンを生産し得る株Ｆを生
産した。この選択方法に於いて、細胞は、0.5ミクロン
の膜フィルターによる濾過により枯渇培地から除去さ
れ、選択培地は50％の枯渇培地及び50％の4B培地により
形成された。株Ｆは、選択剤としてツベルシジンを用い
る選択方法の出発集団として使用された。
７日間で3.4g/のリボフラビンを生産し得る株Ｆを生
産した。この選択方法に於いて、細胞は、0.5ミクロン
の膜フィルターによる濾過により枯渇培地から除去さ
れ、選択培地は50％の枯渇培地及び50％の4B培地により
形成された。株Ｆは、選択剤としてツベルシジンを用い
る選択方法の出発集団として使用された。
リボフラビンオーバープロデューサーの別の選択方法
は、プリン類似体、特にツベルシジンによる増殖の抑制
に対して抵抗性である微生物を選択する。このような化
合物はおそらくプリン代謝を抑制し、そしてプリンはリ
ボフラビンの前駆体であるので、このような化合物はリ
ボフラビンの生産を妨害する。多くの既知のプリン類似
体がプリン代謝の研究のために使用されていたが、既知
の文献はリボフラビンオーバープロデューサーの選択の
ためのプリン類似体の成功した使用を報告していなかっ
た。更に、既知の文献は、プリン代謝の研究のため、ま
たはリボフラビンオーバープロデューサーの選択のため
のツベルシジンの使用を報告していない。
は、プリン類似体、特にツベルシジンによる増殖の抑制
に対して抵抗性である微生物を選択する。このような化
合物はおそらくプリン代謝を抑制し、そしてプリンはリ
ボフラビンの前駆体であるので、このような化合物はリ
ボフラビンの生産を妨害する。多くの既知のプリン類似
体がプリン代謝の研究のために使用されていたが、既知
の文献はリボフラビンオーバープロデューサーの選択の
ためのプリン類似体の成功した使用を報告していなかっ
た。更に、既知の文献は、プリン代謝の研究のため、ま
たはリボフラビンオーバープロデューサーの選択のため
のツベルシジンの使用を報告していない。
ツベルシジンの存在下で増殖し、リボフラビンを生産
するリボフラビン生産微生物の株は、リボフラビンを生
産する改良された能力をもち得ることがわかった。この
ようなツベルシジン抵抗性株は、増加された量のプリン
をつくる能力、またはプリンを一層効率よくつくる能力
を有する。この選択方法によれば、リボフラビン生産微
生物の培養菌が上記のように突然変異される。生存集団
が、ツベルシジンの存在下で炭素、窒素、及び無機元素
の同化できる源を含む培地に塗布される。塗布された集
団から、生存コロニーが選択される。ついで、これらの
コロニーがリボフラビン生産に関して試験される。
するリボフラビン生産微生物の株は、リボフラビンを生
産する改良された能力をもち得ることがわかった。この
ようなツベルシジン抵抗性株は、増加された量のプリン
をつくる能力、またはプリンを一層効率よくつくる能力
を有する。この選択方法によれば、リボフラビン生産微
生物の培養菌が上記のように突然変異される。生存集団
が、ツベルシジンの存在下で炭素、窒素、及び無機元素
の同化できる源を含む培地に塗布される。塗布された集
団から、生存コロニーが選択される。ついで、これらの
コロニーがリボフラビン生産に関して試験される。
本発明の選択方法に使用されるツベルシジンの濃度
は、抑制に対する出発集団の感受性を含む種々の因子に
依存する。上記の如く、好適な濃度は、未突然変異集団
中の増殖を抑制するツベルシジンの最低濃度が測定され
る最小阻止濃度実験を行なうことにより決定し得る。抵
抗性の突然変異体の増殖さえも抑制する濃度までの一層
高いツベルシジンの濃度が使用し得ることが、認識され
るべきである。ツベルシジンの濃度は変化し得るが、選
択方法に於ける濃度は典型的には約85μg/mlのツベルシ
ジン〜約200μg/mlのツベルシジン、更に好ましくは約8
5μg/mlのツベルシジン〜約150μg/mlのツベルシジン、
最も好ましくは約85μg/ml〜約115μg/mlのツベルシジ
ンである。
は、抑制に対する出発集団の感受性を含む種々の因子に
依存する。上記の如く、好適な濃度は、未突然変異集団
中の増殖を抑制するツベルシジンの最低濃度が測定され
る最小阻止濃度実験を行なうことにより決定し得る。抵
抗性の突然変異体の増殖さえも抑制する濃度までの一層
高いツベルシジンの濃度が使用し得ることが、認識され
るべきである。ツベルシジンの濃度は変化し得るが、選
択方法に於ける濃度は典型的には約85μg/mlのツベルシ
ジン〜約200μg/mlのツベルシジン、更に好ましくは約8
5μg/mlのツベルシジン〜約150μg/mlのツベルシジン、
最も好ましくは約85μg/ml〜約115μg/mlのツベルシジ
ンである。
株Ｂは、出発集団として株Ｆを用いるツベルシジン選
択方法により選択された。株Ｂは、2mlのロール管分析
で７日間で3.8g/のリボフラビンを生産し得る。ま
た、株Ｇは、出発集団として株Ａを用いるツベルシジン
選択方法により選択された。株Ｇのリボフラビン生産能
力は、2mlのロール管分析で７日間で2.9g/である。株
Ｇは紫外線感受性選択方法の出発集団として使用され
た。
択方法により選択された。株Ｂは、2mlのロール管分析
で７日間で3.8g/のリボフラビンを生産し得る。ま
た、株Ｇは、出発集団として株Ａを用いるツベルシジン
選択方法により選択された。株Ｇのリボフラビン生産能
力は、2mlのロール管分析で７日間で2.9g/である。株
Ｇは紫外線感受性選択方法の出発集団として使用され
た。
上記の種々の選択方法は、リボフラビン生産微生物の
突然変異集団を、或る方法でリボフラビン生産を抑制す
る培地に導入することにより、リボフラビンのオーバー
プロデューサーを選択する。リボフラビンの速い生産速
度を有する微生物を選択することに加えて、安定なリボ
フラビン生産速度を有するリボフラビンオーバープロデ
ューサーを得ることが望ましい。本発明のカンジダ フ
ラレリの特異的な株は、米国特許出願第811,234号に記
載されるように株Ｃの発生の前に行なわれた細胞−細胞
融合操作の生産物から誘導された。細胞融合生産物は染
色体の多重コピーを有し、それらの部分はそれらの重剰
性のために遺伝子の再構成により経時的に失なわれるよ
うである。リボフラビン過剰生産に選択された細胞融合
生産物は、リボフラビン生産のための遺伝子の多重コピ
ーをもっようである。このような生物が遺伝的に不安定
である場合には、過剰生産能力は容易に失なわれ得る。
その故、染色体再構成に関して減少された能力を有する
リボフラビンのオーバープロデューサーを選択すること
が望ましい。
突然変異集団を、或る方法でリボフラビン生産を抑制す
る培地に導入することにより、リボフラビンのオーバー
プロデューサーを選択する。リボフラビンの速い生産速
度を有する微生物を選択することに加えて、安定なリボ
フラビン生産速度を有するリボフラビンオーバープロデ
ューサーを得ることが望ましい。本発明のカンジダ フ
ラレリの特異的な株は、米国特許出願第811,234号に記
載されるように株Ｃの発生の前に行なわれた細胞−細胞
融合操作の生産物から誘導された。細胞融合生産物は染
色体の多重コピーを有し、それらの部分はそれらの重剰
性のために遺伝子の再構成により経時的に失なわれるよ
うである。リボフラビン過剰生産に選択された細胞融合
生産物は、リボフラビン生産のための遺伝子の多重コピ
ーをもっようである。このような生物が遺伝的に不安定
である場合には、過剰生産能力は容易に失なわれ得る。
その故、染色体再構成に関して減少された能力を有する
リボフラビンのオーバープロデューサーを選択すること
が望ましい。
バクテリア及びサッカロミセス セレビジアエ（Sacc
haromyces cerevisiae）に於いて、DNAを再構成する能
力を欠如している突然変異体が得られた。クラーク（Cl
ark）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53巻、451頁（196
5年）、マツザ（Mazza）ら著、Microbiologica、１巻、
111巻（1978年）、ハイネス（Haynes）ら著、酵母サッ
カロミセスの分子生物学（The Molecular Biology of t
he Yeast Saccharomyces）、Cold Spring Harbor La
boratory、371頁（1981年）を参照のこと。これらの突
然変異体の幾つかの型は、紫外線の如き突然変異原に対
する増大された感受性に関して選択することにより得る
ことができる。リボフラビン過剰生産微生物の株、特に
紫外線に対する感受性に関して選択される細胞融合生産
物は、リボフラビン生産に関して増大された安定性の程
度をもつと考えられる。
haromyces cerevisiae）に於いて、DNAを再構成する能
力を欠如している突然変異体が得られた。クラーク（Cl
ark）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53巻、451頁（196
5年）、マツザ（Mazza）ら著、Microbiologica、１巻、
111巻（1978年）、ハイネス（Haynes）ら著、酵母サッ
カロミセスの分子生物学（The Molecular Biology of t
he Yeast Saccharomyces）、Cold Spring Harbor La
boratory、371頁（1981年）を参照のこと。これらの突
然変異体の幾つかの型は、紫外線の如き突然変異原に対
する増大された感受性に関して選択することにより得る
ことができる。リボフラビン過剰生産微生物の株、特に
紫外線に対する感受性に関して選択される細胞融合生産
物は、リボフラビン生産に関して増大された安定性の程
度をもつと考えられる。
紫外線感受性選択方法は、上記のように微生物の出発
集団を突然変異誘発にかけることにより行なわれる。細
胞懸濁物は、プレート当り約100〜約400のコロニー、更
に好ましくはプレート当り約150〜200のコロニーを生じ
るように希釈して培地、例えばYMG培地に塗布される。
コロニーが目視できるようになった後、コロニーパター
ンが新しい寒天プレートに２回複製される。直径約0.5m
m−直径約1.0mmの直径を有するコロニーが目視できる。
最初の複製が、非突然変異細胞に対して準致死（sub−l
ethal）である強さの紫外線に、上部に外被なしに、露
出される。紫外線の適当なレベルは、未突然変異細胞の
コロニーを種々の線量の紫外線に露出し、ついで細胞を
死滅しないレベルを測定することにより決定し得る。カ
ンジダ フラレリの未突然変異培養菌に関して、紫外線
の準致死レベルは約５ジュール／平方メーター（J/m2）
〜約20J/m2、更に好ましくは約10J/m2〜約15J/m2であ
る。照射複製及び未照射複製は、培養されてコロニー形
成を与える。照射プレートは暗所に保たれて可視光が紫
外線の効果を逆転することを防止する必要がある。可視
光は、照射によりひき起された遺伝子損傷を修復すると
いう確立された効果を有する。コロニーが目視できるよ
うになった後、照射複製が照射プレート上に不在である
未照射複製上に存在するコロニーに関して未照射プレー
トと比較される。このようにして、紫外線に対して増大
された感受性を有するコロニーが同定される。
集団を突然変異誘発にかけることにより行なわれる。細
胞懸濁物は、プレート当り約100〜約400のコロニー、更
に好ましくはプレート当り約150〜200のコロニーを生じ
るように希釈して培地、例えばYMG培地に塗布される。
コロニーが目視できるようになった後、コロニーパター
ンが新しい寒天プレートに２回複製される。直径約0.5m
m−直径約1.0mmの直径を有するコロニーが目視できる。
最初の複製が、非突然変異細胞に対して準致死（sub−l
ethal）である強さの紫外線に、上部に外被なしに、露
出される。紫外線の適当なレベルは、未突然変異細胞の
コロニーを種々の線量の紫外線に露出し、ついで細胞を
死滅しないレベルを測定することにより決定し得る。カ
ンジダ フラレリの未突然変異培養菌に関して、紫外線
の準致死レベルは約５ジュール／平方メーター（J/m2）
〜約20J/m2、更に好ましくは約10J/m2〜約15J/m2であ
る。照射複製及び未照射複製は、培養されてコロニー形
成を与える。照射プレートは暗所に保たれて可視光が紫
外線の効果を逆転することを防止する必要がある。可視
光は、照射によりひき起された遺伝子損傷を修復すると
いう確立された効果を有する。コロニーが目視できるよ
うになった後、照射複製が照射プレート上に不在である
未照射複製上に存在するコロニーに関して未照射プレー
トと比較される。このようにして、紫外線に対して増大
された感受性を有するコロニーが同定される。
株Ｈは、出発集団として株Ｇを用いる紫外線感受性選
択方法により選択された。株Ｈは2mlのロール管分析で
７日間で3.1g/のリボフラビン生産能力を有する。
択方法により選択された。株Ｈは2mlのロール管分析で
７日間で3.1g/のリボフラビン生産能力を有する。
リボフラビンは、上記の方法により選択された株Ａ及
びＢ並びにその他の微生物の発酵により生産し得る。特
別な株の培養菌が一層低いリボフラビン生産株の微生物
による汚染を実質的に含まない場合には、一層多いリボ
フラビン収量がその培養菌で得ることができること当業
者に明らかである。このような生物学的に純粋な培養菌
は、所望の株の一種の微生物から培養菌を生成すること
により生産し得る。
びＢ並びにその他の微生物の発酵により生産し得る。特
別な株の培養菌が一層低いリボフラビン生産株の微生物
による汚染を実質的に含まない場合には、一層多いリボ
フラビン収量がその培養菌で得ることができること当業
者に明らかである。このような生物学的に純粋な培養菌
は、所望の株の一種の微生物から培養菌を生成すること
により生産し得る。
上記の方法により選択された株Ａ及びＢ並びに微生物
によるリボフラビン生産は、異なる発酵培地及び発酵操
作が使用される時に、変化し得る。多くの発酵操作が当
業者に知られているが、一貫して速い増殖速度及びリボ
フラビン生産を生じる発酵培地及び発酵方法が開発され
た。株Ａ及びＢによるリボフラビンの生産に好ましい発
酵培地が表３に示される。
によるリボフラビン生産は、異なる発酵培地及び発酵操
作が使用される時に、変化し得る。多くの発酵操作が当
業者に知られているが、一貫して速い増殖速度及びリボ
フラビン生産を生じる発酵培地及び発酵方法が開発され
た。株Ａ及びＢによるリボフラビンの生産に好ましい発
酵培地が表３に示される。
グルコース以外の全部ての培地成分は容器中に滅菌濾
過される。グルコース（630g/）は、121℃、1.1kg/cm
2（15psi）で30分間オートクレーブで処理される。14
の発酵槽中の初期発酵槽容量は10.5である。培地のpH
は植菌の前に6.9〜7.0に調節される。
過される。グルコース（630g/）は、121℃、1.1kg/cm
2（15psi）で30分間オートクレーブで処理される。14
の発酵槽中の初期発酵槽容量は10.5である。培地のpH
は植菌の前に6.9〜7.0に調節される。
一般に、培地は、炭素、窒素、ホスフェート、スルフ
ェート、マグネシウム、カリウム、鉄及びその他の微量
金属の源を含む。表３中に示された濃度は成分の初期濃
度を表わし、発酵中に維持する必要がある最小濃度を表
わすものではない。幾つかの成分は、全発酵中に持続す
るのに充分多い量で初期に与えられなくてもよいことが
認められるべきである。このような成分に関して、発酵
培地は監視される必要があり、最小濃度が保たれる必要
がある。
ェート、マグネシウム、カリウム、鉄及びその他の微量
金属の源を含む。表３中に示された濃度は成分の初期濃
度を表わし、発酵中に維持する必要がある最小濃度を表
わすものではない。幾つかの成分は、全発酵中に持続す
るのに充分多い量で初期に与えられなくてもよいことが
認められるべきである。このような成分に関して、発酵
培地は監視される必要があり、最小濃度が保たれる必要
がある。
グルコースが本発明の発酵培地中の好ましい炭素源と
して示されるが、その他の炭素源が同様に良好に作用し
得る。例えば、蔗糖及びフラクトースが培地に好適であ
る。更に、或種のアルコールの如き、その他の非砂糖炭
素源が好適である。発酵培地中のグルコースの初期濃度
は、約45g/〜約60g/、更に好ましくは約50g/〜約
60g/、最も好ましくは約55g/〜約60g/であるべき
である。
して示されるが、その他の炭素源が同様に良好に作用し
得る。例えば、蔗糖及びフラクトースが培地に好適であ
る。更に、或種のアルコールの如き、その他の非砂糖炭
素源が好適である。発酵培地中のグルコースの初期濃度
は、約45g/〜約60g/、更に好ましくは約50g/〜約
60g/、最も好ましくは約55g/〜約60g/であるべき
である。
また、発酵培地はグリシンを含む。グリシンは効率の
よいリボフラビン生産のための発酵培地の重要な成分で
ある。グリシンはリボフラビン生産に必須であるが、過
剰量のグリシンはカンジダ フラレリの増殖を抑制す
る。約7g/より大きい濃度では、細胞増殖が停止す
る。約0.5g/程度の非常に低いグリシンの濃度では、
グリシンは発酵培地から迅速に枯渇される。許容し得る
初期のグリシン濃度は、約2g/〜約6g/、更に好まし
くは約4g/〜約6g/、最も好ましくは約4g/〜約5g/
である。
よいリボフラビン生産のための発酵培地の重要な成分で
ある。グリシンはリボフラビン生産に必須であるが、過
剰量のグリシンはカンジダ フラレリの増殖を抑制す
る。約7g/より大きい濃度では、細胞増殖が停止す
る。約0.5g/程度の非常に低いグリシンの濃度では、
グリシンは発酵培地から迅速に枯渇される。許容し得る
初期のグリシン濃度は、約2g/〜約6g/、更に好まし
くは約4g/〜約6g/、最も好ましくは約4g/〜約5g/
である。
窒素は、尿素の添加により、増殖を支持するために発
酵培地に与えられる。発酵培地中の尿素の初期濃度は、
約2g/〜約9g/、更に好ましくは約3g/〜約7g/、
最も好ましくは約3g/〜約5g/であるべきである。そ
の他の窒素源が本発明の発酵培地中に使用するのに好適
である。このようなその他の源の最適濃度は、その他の
可変因子を一定に保ちながら窒素源の種々の濃度で試験
発酵を行ない、最高のリボフラビン生産を測定すること
により決定し得る。
酵培地に与えられる。発酵培地中の尿素の初期濃度は、
約2g/〜約9g/、更に好ましくは約3g/〜約7g/、
最も好ましくは約3g/〜約5g/であるべきである。そ
の他の窒素源が本発明の発酵培地中に使用するのに好適
である。このようなその他の源の最適濃度は、その他の
可変因子を一定に保ちながら窒素源の種々の濃度で試験
発酵を行ない、最高のリボフラビン生産を測定すること
により決定し得る。
ホスフェートは、−塩基性リン酸カリウム（KH2PO4）
の添加により発酵培地に与えられる。KH2PO4は約0.5〜
約2.0g/、更に好ましくは約0.75g/〜約1.5g/、最
も好ましくは約0.85g/〜約1.15g/の濃度で発酵培地
に最初に与えられる。ホスフェートの他に、KH2PO4はカ
リウムを発酵培地に与える。カリウムは増殖に必要とさ
れるが、充分なホスフェートを与える濃度では、添加さ
れるカリウムは培養の栄養必要量をはるかに越える。ホ
スフェートはリン酸ナトリウムの如きその他の形態で添
加し得るが、リン酸カリウムが好ましい。カリウム栄養
必要量が満足されるからである。
の添加により発酵培地に与えられる。KH2PO4は約0.5〜
約2.0g/、更に好ましくは約0.75g/〜約1.5g/、最
も好ましくは約0.85g/〜約1.15g/の濃度で発酵培地
に最初に与えられる。ホスフェートの他に、KH2PO4はカ
リウムを発酵培地に与える。カリウムは増殖に必要とさ
れるが、充分なホスフェートを与える濃度では、添加さ
れるカリウムは培養の栄養必要量をはるかに越える。ホ
スフェートはリン酸ナトリウムの如きその他の形態で添
加し得るが、リン酸カリウムが好ましい。カリウム栄養
必要量が満足されるからである。
また、発酵培地はスルフェート源として硫酸マグネシ
ウム（MgSO4）を含む。初期の発酵培地は、この化合物
を約0.5g/〜約1.0g/、更に好ましくは約0.6g/〜
約0.8g/、最も好ましくは約0.65g/〜約0.75g/の
濃度で含む。発酵培養菌は栄養マグネシウム必要量を有
するが、これらの濃度では、与えられるマグネシウムは
必要量をはるかに越える。また、スルフェートは硫酸マ
グネシウム以外の化合物で添加し得る。
ウム（MgSO4）を含む。初期の発酵培地は、この化合物
を約0.5g/〜約1.0g/、更に好ましくは約0.6g/〜
約0.8g/、最も好ましくは約0.65g/〜約0.75g/の
濃度で含む。発酵培養菌は栄養マグネシウム必要量を有
するが、これらの濃度では、与えられるマグネシウムは
必要量をはるかに越える。また、スルフェートは硫酸マ
グネシウム以外の化合物で添加し得る。
また、発酵培地は、コバルト、銅、ホウ素、モリブデ
ン、マンガン、亜鉛及び鉄を含む微量ミネラルの幾つか
の源を含む。発酵培地は、これらの元素の夫々に関し栄
養必要量を有するが、微量ミネラル含有化合物の初期濃
度で、これらの必要量は容易に満たされ、発酵プロセス
中に更に添加を必要としない。微量ミネラルの多くは硫
酸塩として与えられるが、これらの化合物により添加さ
れるスルフェートの量は発酵の全スルフェート必要量に
関して重要ではない。
ン、マンガン、亜鉛及び鉄を含む微量ミネラルの幾つか
の源を含む。発酵培地は、これらの元素の夫々に関し栄
養必要量を有するが、微量ミネラル含有化合物の初期濃
度で、これらの必要量は容易に満たされ、発酵プロセス
中に更に添加を必要としない。微量ミネラルの多くは硫
酸塩として与えられるが、これらの化合物により添加さ
れるスルフェートの量は発酵の全スルフェート必要量に
関して重要ではない。
コバルトは、７水和硫酸コバルト（CoSO4・7H2O）の
形態で発酵培地に与えられる。この化合物の初期濃度
は、約10mg/〜約13mg/、更に好ましくは約11mg/
〜約12mg/、最も好ましくは約11.5mg/〜約12mg/
である。また、コバルトは、鉄と競合してリボフラビン
合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少するという有益な効果
を有する。
形態で発酵培地に与えられる。この化合物の初期濃度
は、約10mg/〜約13mg/、更に好ましくは約11mg/
〜約12mg/、最も好ましくは約11.5mg/〜約12mg/
である。また、コバルトは、鉄と競合してリボフラビン
合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少するという有益な効果
を有する。
銅は、５水和硫酸銅（CuSO4・5H2O）の形態で発酵培
地に添加される。この化合物は、約0.015mg/〜約0.02
5mg/、更に好ましくは約0.017〜約0.023mg/、最も
好ましくは約0.018mg/〜約0.022mg/の濃度で発酵培
地に最初に与えられる。また、銅は鉄と競合してリボフ
ラビン合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少するという効果
を有する。
地に添加される。この化合物は、約0.015mg/〜約0.02
5mg/、更に好ましくは約0.017〜約0.023mg/、最も
好ましくは約0.018mg/〜約0.022mg/の濃度で発酵培
地に最初に与えられる。また、銅は鉄と競合してリボフ
ラビン合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少するという効果
を有する。
亜鉛は、７水和硫酸亜鉛（ZnSO4・7H2O）の形態で発
酵培地に添加される。この化合物は、約15mg/〜約20m
g/、更に好ましくは約16mg/〜約19mg/、最も好ま
しくは約16mg/〜約18mg/の濃度で発酵培地に最初に
与えられる。また、亜鉛は鉄の競合体であり、リボフラ
ビン合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少する。
酵培地に添加される。この化合物は、約15mg/〜約20m
g/、更に好ましくは約16mg/〜約19mg/、最も好ま
しくは約16mg/〜約18mg/の濃度で発酵培地に最初に
与えられる。また、亜鉛は鉄の競合体であり、リボフラ
ビン合成に及ぼす鉄の抑制効果を減少する。
また、発酵培地は、鉄の源、即ち７水和硫酸鉄（FeSO
4・7H2O）を含み、発酵の栄養鉄要求量を満足する。発
酵培地中のこの化合物の初期濃度は、約1.5mg/〜約4.
0mg/、更に好ましくは約1.7mg/〜約3.0mg/、最も
好ましくは約1.9mg/〜約2.3mg/である。
4・7H2O）を含み、発酵の栄養鉄要求量を満足する。発
酵培地中のこの化合物の初期濃度は、約1.5mg/〜約4.
0mg/、更に好ましくは約1.7mg/〜約3.0mg/、最も
好ましくは約1.9mg/〜約2.3mg/である。
ホウ素は、ホウ酸（H3BO3）の形態で発酵培地に与え
られる。ホウ酸は、約0.015mg/〜約0.025mg/、更に
好ましくは約0.017mg/〜約0.023mg/、最も好ましく
は約0.019mg/〜約0.021mg/の濃度で初期の発酵培地
に与えられる。ホウ素は、細胞に生物学的に利用可能で
ある形態で、且つ無毒性形態であることを条件として、
ホウ素はその他の形態で発酵培地に与えられてもよい。
られる。ホウ酸は、約0.015mg/〜約0.025mg/、更に
好ましくは約0.017mg/〜約0.023mg/、最も好ましく
は約0.019mg/〜約0.021mg/の濃度で初期の発酵培地
に与えられる。ホウ素は、細胞に生物学的に利用可能で
ある形態で、且つ無毒性形態であることを条件として、
ホウ素はその他の形態で発酵培地に与えられてもよい。
モリブデンは、モリブデン酸アンモニウム（VI）
（（NH4）6Mo7O24）の形態で培地に与えられる。この化
合物は、約0.12mg/〜約0.16mg/、更に好ましくは約
0.13mg/〜約0.15mg/、最も好ましくは約0.135mg/
〜約0.145mg/の濃度で与えられる。
（（NH4）6Mo7O24）の形態で培地に与えられる。この化
合物は、約0.12mg/〜約0.16mg/、更に好ましくは約
0.13mg/〜約0.15mg/、最も好ましくは約0.135mg/
〜約0.145mg/の濃度で与えられる。
マンガンは、硫酸マンガン（MnSO4）の形態で発酵培
地に与えられる。この化合物は、約0.015mg/〜約0.02
5mg/、更に好ましくは約0.017〜約0.023mg/、最も
好ましくは約0.019mg/〜約0.021mg/の濃度で与えら
れる。
地に与えられる。この化合物は、約0.015mg/〜約0.02
5mg/、更に好ましくは約0.017〜約0.023mg/、最も
好ましくは約0.019mg/〜約0.021mg/の濃度で与えら
れる。
また、発酵培地は、ビオチン、即ち一般に酵母により
必要とされるビタミンを含む。このビタミンは、約0.00
5mg/以上、更に好ましくは約0.009mg/以上、最も好
ましくは約0.0118mg/以上の濃度で与えられる。
必要とされるビタミンを含む。このビタミンは、約0.00
5mg/以上、更に好ましくは約0.009mg/以上、最も好
ましくは約0.0118mg/以上の濃度で与えられる。
上記の如く、発酵中に、培地の成分の幾つかが枯渇さ
れる。増殖が、添加を必要とする前の期間にわたって支
持されるように、比較的に高い濃度のこのような成分で
発酵を開始することが好ましい。これらの成分の好まし
い範囲は、レベルが発酵により枯渇されるので、添加す
ることにより発酵中に維持される。発酵培地中の成分の
レベルは、例えば、発酵培地を周期的に採取し、濃度に
ついて分析することにより監視し得る。また、標準発酵
操作が一旦開発されると、発酵中の特別の時間での既知
のレベルに相応する時間間隔で、添加が行ない得る。当
業者に認められるように、培地中の細胞密度が増加する
につれて、栄養素の消費速度が発酵中に増加する。
れる。増殖が、添加を必要とする前の期間にわたって支
持されるように、比較的に高い濃度のこのような成分で
発酵を開始することが好ましい。これらの成分の好まし
い範囲は、レベルが発酵により枯渇されるので、添加す
ることにより発酵中に維持される。発酵培地中の成分の
レベルは、例えば、発酵培地を周期的に採取し、濃度に
ついて分析することにより監視し得る。また、標準発酵
操作が一旦開発されると、発酵中の特別の時間での既知
のレベルに相応する時間間隔で、添加が行ない得る。当
業者に認められるように、培地中の細胞密度が増加する
につれて、栄養素の消費速度が発酵中に増加する。
発酵培地中のグルコース、グリシン、尿素及びホスフ
ェートの濃度が、発酵中に監視される。培地中のグルコ
ース濃度が監視され、約20g/〜約60g/、更に好まし
くは約20g/〜約40g/、最も好ましくは約30g/に維
持される。グルコースのこれらの濃度は、約600g/の
濃度を有する濃厚グルコース供給材料の添加により、発
酵中に維持し得る。
ェートの濃度が、発酵中に監視される。培地中のグルコ
ース濃度が監視され、約20g/〜約60g/、更に好まし
くは約20g/〜約40g/、最も好ましくは約30g/に維
持される。グルコースのこれらの濃度は、約600g/の
濃度を有する濃厚グルコース供給材料の添加により、発
酵中に維持し得る。
また、発酵培地中のグリシンの濃度が監視され、約1g
/〜約7g/、更に好ましくは約2g/〜約5g/、最も
好ましくは約3g/に維持される。グリシン濃度は、約2
00g/の濃度を有する濃度グリシン供給材料の添加によ
り調節し得る。
/〜約7g/、更に好ましくは約2g/〜約5g/、最も
好ましくは約3g/に維持される。グリシン濃度は、約2
00g/の濃度を有する濃度グリシン供給材料の添加によ
り調節し得る。
また、発酵培地中の尿素の濃度が監視され、約1g/
〜約9g/、更に好ましくは約2g/〜約5g/、最も好
ましくは約3g/の濃度に維持される。発酵培地中の尿
素濃度は、約100g/の濃度を有する濃厚尿素供給材料
の添加によりこれらの範囲内に維持される。
〜約9g/、更に好ましくは約2g/〜約5g/、最も好
ましくは約3g/の濃度に維持される。発酵培地中の尿
素濃度は、約100g/の濃度を有する濃厚尿素供給材料
の添加によりこれらの範囲内に維持される。
発酵培地中のホスフェート（PO4）の濃度は、約0.03g
/〜約0.3g/、更に好ましくは約0.05g/〜約0.2g/
、最も好ましくは約0.1g/に維持される。これらの
濃度は、約15.75g/の濃度を有する濃厚リン酸カリウ
ム供給材料の添加により維持される。リン酸カリウムを
添加することによりホスフェートの濃度を維持すること
に加えて、スルフェート濃度がまたリン酸カリウム供給
材料中に硫酸マグネシウムを含むことにより、硫酸マグ
ネシウムを発酵培地に添加することにより維持される。
供給材料中の硫酸マグネシウムは約11.37g/の濃度を
有する。
/〜約0.3g/、更に好ましくは約0.05g/〜約0.2g/
、最も好ましくは約0.1g/に維持される。これらの
濃度は、約15.75g/の濃度を有する濃厚リン酸カリウ
ム供給材料の添加により維持される。リン酸カリウムを
添加することによりホスフェートの濃度を維持すること
に加えて、スルフェート濃度がまたリン酸カリウム供給
材料中に硫酸マグネシウムを含むことにより、硫酸マグ
ネシウムを発酵培地に添加することにより維持される。
供給材料中の硫酸マグネシウムは約11.37g/の濃度を
有する。
グルコース、グリシン、尿素、ホスフェート及びスル
フェートの供給材料が発酵培地に添加されて発酵培地中
のこれらの化合物の濃度を得、または維持することが認
識されるべきである。従って、上記で与えられた添加剤
供給材料の濃度は本発明に重要ではなく、また本発明を
限定するものではない。
フェートの供給材料が発酵培地に添加されて発酵培地中
のこれらの化合物の濃度を得、または維持することが認
識されるべきである。従って、上記で与えられた添加剤
供給材料の濃度は本発明に重要ではなく、また本発明を
限定するものではない。
本発明の発酵方法に於いて、発酵培地は上記のように
して調製される。この培地はリボフラビン生産微生物、
特にカンジダ フラレリの株の培養菌で植菌される。満
足な発酵を得るために、植菌は最小植菌密度を確立する
必要がある。発酵方法は、細胞増殖が進行するために初
期最小植菌密度を必要とすることが、良く認識される。
本発明の方法に於ける最小植菌密度は測定されなかった
が、初期植菌が620nmで約0.06の光学密度（1cmキュベッ
ト）を得る場合に、満足な発酵が得られ、得ることが、
測定された。一層高い初期密度を与える植菌が許容し得
るが、細胞増殖前の誘導時間を短縮する。約0.06未満の
初期植菌密度では、細胞増殖が開始する前の誘導時間が
一層長くなり、最終的に、増殖を支持しない最小植菌密
度に到達する。
して調製される。この培地はリボフラビン生産微生物、
特にカンジダ フラレリの株の培養菌で植菌される。満
足な発酵を得るために、植菌は最小植菌密度を確立する
必要がある。発酵方法は、細胞増殖が進行するために初
期最小植菌密度を必要とすることが、良く認識される。
本発明の方法に於ける最小植菌密度は測定されなかった
が、初期植菌が620nmで約0.06の光学密度（1cmキュベッ
ト）を得る場合に、満足な発酵が得られ、得ることが、
測定された。一層高い初期密度を与える植菌が許容し得
るが、細胞増殖前の誘導時間を短縮する。約0.06未満の
初期植菌密度では、細胞増殖が開始する前の誘導時間が
一層長くなり、最終的に、増殖を支持しない最小植菌密
度に到達する。
発酵培地が植菌された後、発酵が進行させられ、グル
コース、グリシン、尿素、ホスフェート及びスルフェー
トの濃度が監視され、上記の濃度に維持される、発酵
中、培地の温度は、約29℃〜約31℃、更に好ましくは約
29.5℃〜約30.5℃、最も好ましくは約29.9℃〜約30.1℃
に維持されるべきである。
コース、グリシン、尿素、ホスフェート及びスルフェー
トの濃度が監視され、上記の濃度に維持される、発酵
中、培地の温度は、約29℃〜約31℃、更に好ましくは約
29.5℃〜約30.5℃、最も好ましくは約29.9℃〜約30.1℃
に維持されるべきである。
発酵培地中の溶解酸素は、微生物による利用に充分な
酵素を与えるレベル以上に維持される必要がある。培地
の溶解酸素含量は、通気及び攪拌により調節し得る。培
地の溶解酸素含量は、飽和の約20％以上、更に好ましく
は飽和の約40％以上に保たれることが好ましい。
酵素を与えるレベル以上に維持される必要がある。培地
の溶解酸素含量は、通気及び攪拌により調節し得る。培
地の溶解酸素含量は、飽和の約20％以上、更に好ましく
は飽和の約40％以上に保たれることが好ましい。
培地のpHは、植菌の前に調節される。培地のpHは、KO
H、NaOHの如き、当業界で既知の種々の化合物の添加に
より調節し得る。この初期pHは約６〜約８、更に好まし
くは約6.5〜約7.5、最も好ましくは約6.9〜7.0であり得
る。発酵中、培地のpHは、細胞増殖及びリボフラビンの
大きな増加が起こるのとほぼ同じ時期に著しく低下する
ことが認められた。また、これらの変化はホスフェー
ト、グルコース、尿素、及びグリシンの添加に対する最
初の要求と一致する。典型的には、培地のこの酸性化
は、約35時間〜約55時間、更に典型的には約40時間〜約
50時間、最も典型的には約42時間〜約48時間で観察され
る。
H、NaOHの如き、当業界で既知の種々の化合物の添加に
より調節し得る。この初期pHは約６〜約８、更に好まし
くは約6.5〜約7.5、最も好ましくは約6.9〜7.0であり得
る。発酵中、培地のpHは、細胞増殖及びリボフラビンの
大きな増加が起こるのとほぼ同じ時期に著しく低下する
ことが認められた。また、これらの変化はホスフェー
ト、グルコース、尿素、及びグリシンの添加に対する最
初の要求と一致する。典型的には、培地のこの酸性化
は、約35時間〜約55時間、更に典型的には約40時間〜約
50時間、最も典型的には約42時間〜約48時間で観察され
る。
典型的には、培地のpHは3.5程度の低さ、更に典型的
には約3.9に低下する。発酵方法の残りの期間中に、pH
は典型的に約3.9〜約6.0、更に典型的に約3.9〜約5.5、
最も典型的に約3.9〜約5.1に留まる。ついで、培地のpH
は典型的に約5.0〜約7.0、更に典型的に約6.0〜約7.0に
上昇してもどる。このpHの上昇が起こる時に、細胞増殖
が一般に停止する。
には約3.9に低下する。発酵方法の残りの期間中に、pH
は典型的に約3.9〜約6.0、更に典型的に約3.9〜約5.5、
最も典型的に約3.9〜約5.1に留まる。ついで、培地のpH
は典型的に約5.0〜約7.0、更に典型的に約6.0〜約7.0に
上昇してもどる。このpHの上昇が起こる時に、細胞増殖
が一般に停止する。
以下の実験結果は、説明の目的で示されるのであり、
本発明の範囲を限定することを目的とするものではな
い。
本発明の範囲を限定することを目的とするものではな
い。
実施例 １ ロール管リボフラビン分析 株Ｂのコロニーを、補充特定培地（Supplemented Def
ined Medium）（表Ｉ−Ａを参照のこと）2.5mlを含む試
験管に植菌し、適度に撹拌して30℃で４日間増殖させ
た。2mlの補充特定培地を含む試験管に増殖培養菌0.02m
lを植菌し、適度に撹拌して30℃で７日間培養した。培
養菌を500のファクターにより希釈し、60℃〜70℃で40
分間加熱してリボフラビン結晶を溶解した。溶解された
溶液の445nmでの吸光度は0.245であった。この値を500
倍して希釈について修正し、31.3を掛けてリボフラビン
の濃度3.8×103mg/即ち3.8g/を得る。
ined Medium）（表Ｉ−Ａを参照のこと）2.5mlを含む試
験管に植菌し、適度に撹拌して30℃で４日間増殖させ
た。2mlの補充特定培地を含む試験管に増殖培養菌0.02m
lを植菌し、適度に撹拌して30℃で７日間培養した。培
養菌を500のファクターにより希釈し、60℃〜70℃で40
分間加熱してリボフラビン結晶を溶解した。溶解された
溶液の445nmでの吸光度は0.245であった。この値を500
倍して希釈について修正し、31.3を掛けてリボフラビン
の濃度3.8×103mg/即ち3.8g/を得る。
実施例 ２ 株選択 株Ｃを、NTG濃度0.10mg/mlで室温で60分間NTG突然変
異誘発にかけた。これらの突然変異細胞を回収し、洗浄
し、生理食塩水に懸濁した。突然変異細胞を、２−デオ
キシグルコース750μg/mlを含む補充特定培地に塗布し
た。10日後、抵抗性突然変異体の125のコロニーを同定
し、上記のロール管リボフラビン分析によりリボフラビ
ン生産に関して試験した。株Ｄは、1.58g//7日のリボ
フラビン生産能力を有する最も生産性のある突然変異体
であった。
異誘発にかけた。これらの突然変異細胞を回収し、洗浄
し、生理食塩水に懸濁した。突然変異細胞を、２−デオ
キシグルコース750μg/mlを含む補充特定培地に塗布し
た。10日後、抵抗性突然変異体の125のコロニーを同定
し、上記のロール管リボフラビン分析によりリボフラビ
ン生産に関して試験した。株Ｄは、1.58g//7日のリボ
フラビン生産能力を有する最も生産性のある突然変異体
であった。
上記のようにして、株Ｄを0.10mg/mlのNTG濃度で室温
で60分間NTG突然変異誘発にかけた。処理された細胞を
回収し、洗浄し、等容量の生理食塩水に懸濁した。この
培養菌を、リボフラビン合成に充分な基質を与えるため
の2.23％のグリシン及び５μg/mlの濃度のFeCl3・6H2O
を含む補充特定培地に塗布した。30℃で10日間培養した
後、抵抗性の突然変異体の25のコロニーを同定し、上記
のロール管リボフラビン分析によりリボフラビン合成に
関して試験した。突然変異体株Ｅは、1.70g//7日のリ
ボフラビン生産能力を有する最高のリボフラビン生産株
であった。
で60分間NTG突然変異誘発にかけた。処理された細胞を
回収し、洗浄し、等容量の生理食塩水に懸濁した。この
培養菌を、リボフラビン合成に充分な基質を与えるため
の2.23％のグリシン及び５μg/mlの濃度のFeCl3・6H2O
を含む補充特定培地に塗布した。30℃で10日間培養した
後、抵抗性の突然変異体の25のコロニーを同定し、上記
のロール管リボフラビン分析によりリボフラビン合成に
関して試験した。突然変異体株Ｅは、1.70g//7日のリ
ボフラビン生産能力を有する最高のリボフラビン生産株
であった。
株Ｅを、0.10mg/mlのNTG濃度で室温で保温60分でNTG
突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄
し、等容量の生理食塩水に懸濁した。株Ｅを補充特定培
地中で30℃の温度で３週間攪拌して増殖することによ
り、枯渇培地を調製した。細胞を、遠心分離及び0.5ミ
クロンの膜フィルターによる濾過により、この培養物か
ら除去した。蔗糖（６％）、グリシン（0.23％）、及び
寒天（２％）を上澄液に添加した。株Ｅの突然変異培養
菌を、この培地に塗布し、30℃で10日間培養した。黄色
を有する35のコロニーを同定し、ロール管リボフラビン
分析によりリボフラビン生産に関して試験した。株Ａ
は、この選択操作から誘導されたものであり、2.5g//
7日のリボフラビン生産能力を有する。
突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄
し、等容量の生理食塩水に懸濁した。株Ｅを補充特定培
地中で30℃の温度で３週間攪拌して増殖することによ
り、枯渇培地を調製した。細胞を、遠心分離及び0.5ミ
クロンの膜フィルターによる濾過により、この培養物か
ら除去した。蔗糖（６％）、グリシン（0.23％）、及び
寒天（２％）を上澄液に添加した。株Ｅの突然変異培養
菌を、この培地に塗布し、30℃で10日間培養した。黄色
を有する35のコロニーを同定し、ロール管リボフラビン
分析によりリボフラビン生産に関して試験した。株Ａ
は、この選択操作から誘導されたものであり、2.5g//
7日のリボフラビン生産能力を有する。
株Ａを、0.10mg/mlの濃度で室温で保温60分でNTG突然
変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄し、
等容量の生理食塩水に懸濁した。
変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄し、
等容量の生理食塩水に懸濁した。
未突然変異株Ａ細胞を、30℃の450の発酵槽中で、
表３に記載された培地中で10日間攪拌して増殖すること
により、枯渇培地を調製した。細胞を限外濾過により、
この培養物から除去した。固体の選択培地を、液体容量
の50％が細胞を含まない枯渇培地であり、液体容量の残
りの50％が水であるもので調製した。突然変異株Ａ細胞
を、この培地に塗布し、30℃で10日間培養した。抵抗性
の突然変異体の60のコロニーを同定し、リボフラビン生
産に関して試験した。株Ｆは、ロール管リボフラビン分
析で3.4g//7日のリボフラビン生産能力を有する、こ
の方法からの最高のリボフラビンプロデューサーであっ
た。
表３に記載された培地中で10日間攪拌して増殖すること
により、枯渇培地を調製した。細胞を限外濾過により、
この培養物から除去した。固体の選択培地を、液体容量
の50％が細胞を含まない枯渇培地であり、液体容量の残
りの50％が水であるもので調製した。突然変異株Ａ細胞
を、この培地に塗布し、30℃で10日間培養した。抵抗性
の突然変異体の60のコロニーを同定し、リボフラビン生
産に関して試験した。株Ｆは、ロール管リボフラビン分
析で3.4g//7日のリボフラビン生産能力を有する、こ
の方法からの最高のリボフラビンプロデューサーであっ
た。
株Ｆを、0.10mg/mlのNTG濃度で室温で保温60分間でNT
G突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗
浄し、生理食塩水に懸濁した。これらの細胞を、100μg
/mlのツベルシジンを含む補充特定培地での選択にかけ
た。30℃で10日間培養した後、生存株の25のコロニーを
同定し、リボフラビン生産に関して試験した。株Ｂは、
3.8g//7日のリボフラビン生産能力を有する最もフラ
ビノゲニックな株であった。
G突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗
浄し、生理食塩水に懸濁した。これらの細胞を、100μg
/mlのツベルシジンを含む補充特定培地での選択にかけ
た。30℃で10日間培養した後、生存株の25のコロニーを
同定し、リボフラビン生産に関して試験した。株Ｂは、
3.8g//7日のリボフラビン生産能力を有する最もフラ
ビノゲニックな株であった。
また、株Ａは、第二選択方法の出発集団であった。株
Ａの培養菌を、0.10mg/mlの濃度で室温で保温60分でNTG
突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄
し、生理食塩水に懸濁した。突然変異細胞を、100μg/m
lのツベルシジンを含む補充特定培地に塗布することに
より、この培養菌をツベルシジン選択にかけた。30℃で
10日間培養した後、20の生存コロニーを選択し、リボフ
ラビン生産に関して試験した。株Ｇは、2.9g//7日を
生産する最もフラビノゲニックな株であった。
Ａの培養菌を、0.10mg/mlの濃度で室温で保温60分でNTG
突然変異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄
し、生理食塩水に懸濁した。突然変異細胞を、100μg/m
lのツベルシジンを含む補充特定培地に塗布することに
より、この培養菌をツベルシジン選択にかけた。30℃で
10日間培養した後、20の生存コロニーを選択し、リボフ
ラビン生産に関して試験した。株Ｇは、2.9g//7日を
生産する最もフラビノゲニックな株であった。
株Ｇは、紫外線感受性選択方法の出発集団であった。
株Ｇを、0.10mg/mlの濃度で室温で保温60分でNTG突然変
異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄し、生
理食塩水に懸濁した。この細胞懸濁液を1:104に希釈
し、1000個の細胞/mlの細胞濃度を生じた。0.1mlの細胞
懸濁液をYMG培地に塗布し、30℃で３日間培養した。こ
の時点で、コロニーが目視でき、新しい寒天プレートに
２回複製された。最初の複製を、上部に外被なしに、17
J/m2の紫外線に露出した。照射したプレートを、未照射
複製プレートと共に暗所で30℃で４日間培養してコロニ
ーを形成させた。照射プレートと未照射プレートを比較
して、紫外線感受性突然変異体を示す非生存コロニーを
同定した。これらの突然変異体を未照射プレート上で同
定し、リボフラビン生産に関して分析した。この方法に
より、14のコロニーを同定し、最高の生産性突然変異体
は株Ｈであり、これは７日間で3.1g/のリボフラビン
を生産し得る。
株Ｇを、0.10mg/mlの濃度で室温で保温60分でNTG突然変
異誘発にかけた。処理された細胞を回収し、洗浄し、生
理食塩水に懸濁した。この細胞懸濁液を1:104に希釈
し、1000個の細胞/mlの細胞濃度を生じた。0.1mlの細胞
懸濁液をYMG培地に塗布し、30℃で３日間培養した。こ
の時点で、コロニーが目視でき、新しい寒天プレートに
２回複製された。最初の複製を、上部に外被なしに、17
J/m2の紫外線に露出した。照射したプレートを、未照射
複製プレートと共に暗所で30℃で４日間培養してコロニ
ーを形成させた。照射プレートと未照射プレートを比較
して、紫外線感受性突然変異体を示す非生存コロニーを
同定した。これらの突然変異体を未照射プレート上で同
定し、リボフラビン生産に関して分析した。この方法に
より、14のコロニーを同定し、最高の生産性突然変異体
は株Ｈであり、これは７日間で3.1g/のリボフラビン
を生産し得る。
実施例 ３ リボフラビン生産試験番号１を、14の発酵槽中で行
なった。この試験の発酵培地の組成を表３に示す。グル
コース以外の全ての培地成分を、培地の残りに導入する
前に、発酵タンク中に滅菌濾過した。グルコースを121
℃、1.1kg/cm2（15psi）で30分間オートクレーブで処理
した。培地のpHを、植菌の前に6.9〜7.0に調節した。発
酵タンクを、620nmで0.06の初期光学密度（1cmのキュベ
ット）を与える株Ａの培養菌で植菌した。
なった。この試験の発酵培地の組成を表３に示す。グル
コース以外の全ての培地成分を、培地の残りに導入する
前に、発酵タンク中に滅菌濾過した。グルコースを121
℃、1.1kg/cm2（15psi）で30分間オートクレーブで処理
した。培地のpHを、植菌の前に6.9〜7.0に調節した。発
酵タンクを、620nmで0.06の初期光学密度（1cmのキュベ
ット）を与える株Ａの培養菌で植菌した。
試験番号１を240時間行なった。この期間中、620nmに
於ける光学密度、リボフラビン、pH、温度、グリシン、
尿素、ホスフェート及びグルコースを監視した。この発
酵の結果を表III−Ａ及びIII−Ｂに示す。最終リボフラ
ビン濃度15.93g/を240時間で得た。
於ける光学密度、リボフラビン、pH、温度、グリシン、
尿素、ホスフェート及びグルコースを監視した。この発
酵の結果を表III−Ａ及びIII−Ｂに示す。最終リボフラ
ビン濃度15.93g/を240時間で得た。
実施例 ４ リボフラビン生産試験番号２を450の発酵タンク中
で行ない、200時間実験した。発酵培地及び植菌を、実
施例３と同じ方法で調製した。この試験の結果を表IV−
Ａに示す。試験番号２で200時間の終了時に、最終リボ
フラビン濃度21.0g/を得た。
で行ない、200時間実験した。発酵培地及び植菌を、実
施例３と同じ方法で調製した。この試験の結果を表IV−
Ａに示す。試験番号２で200時間の終了時に、最終リボ
フラビン濃度21.0g/を得た。
実施例 ５ リボフラビン生産試験番号３を450の発酵タンク中
で行ない、200時間実験した。発酵培地及び植菌を、実
施例３と同じ方法で調製した。この試験の結果を表Ｖ−
Ａに示す。この試験で200時間の終了時に、最終リボフ
ラビン濃度16.0g/を得た。
で行ない、200時間実験した。発酵培地及び植菌を、実
施例３と同じ方法で調製した。この試験の結果を表Ｖ−
Ａに示す。この試験で200時間の終了時に、最終リボフ
ラビン濃度16.0g/を得た。
実施例 ６ FeSO4・7H2O濃度を0mg/、1mg/、2mg/、及び3mg
/の濃度に変化させた以外は、全ての条件を一定に保
って、一連の試験を行なった。表３に示した発酵培地を
用いて、150のパイロット規模のタンク中で発酵を行
なった。更に、下記の組成物を発酵培地に添加した。
/の濃度に変化させた以外は、全ての条件を一定に保
って、一連の試験を行なった。表３に示した発酵培地を
用いて、150のパイロット規模のタンク中で発酵を行
なった。更に、下記の組成物を発酵培地に添加した。
組 成 物 濃度（g/） 酵母抽出物 1.04 モルト抽出物 1.04 ペプトン 1.73 株Ａを発酵試験に使用した。発酵中に、細胞増殖及び
リボフラビン生産を監視した。表VI−Ａは四つの発酵中
の細胞増殖の結果を示す。表VI−Ｂは四つの発酵のリボ
フラビン生産の結果を示す。表VI−Ｃは四つの発酵の夫
々に関してリボフラビン生産対細胞増殖の最終の比を示
す。表VI−Ｃに見られるように、一層高いFeSO4・7H2O
濃度で、細胞重量当り生産されるリボフラビンの量は増
加する。この比の実質的な増加は1mg/及び2mg/で得
られるが、2mg/と3mg/との間の増加は最小である。
リボフラビン生産を監視した。表VI−Ａは四つの発酵中
の細胞増殖の結果を示す。表VI−Ｂは四つの発酵のリボ
フラビン生産の結果を示す。表VI−Ｃは四つの発酵の夫
々に関してリボフラビン生産対細胞増殖の最終の比を示
す。表VI−Ｃに見られるように、一層高いFeSO4・7H2O
濃度で、細胞重量当り生産されるリボフラビンの量は増
加する。この比の実質的な増加は1mg/及び2mg/で得
られるが、2mg/と3mg/との間の増加は最小である。
実施例 ７ 株Ａに関して枯渇培地の効果を測定するために、一連
の試験を行なった。表３に示された発酵培地を用いて、
発酵を14の発酵槽中で90時間行なった。試験の夫々に
関して、枯渇培地を、発酵培地を構成する液体の異なる
部分で使用した以外は、全ての条件は同じであった。第
一の試験は枯渇培地をもたず、第二の試験は20％を有
し、第三の試験は40％を有し、第四の試験は50％を有
し、第五の試験は80％を有した。発酵試験中、種々の時
間間隔で試験の夫々に関するリボフラビン生産を表VII
−Ａに示す。
の試験を行なった。表３に示された発酵培地を用いて、
発酵を14の発酵槽中で90時間行なった。試験の夫々に
関して、枯渇培地を、発酵培地を構成する液体の異なる
部分で使用した以外は、全ての条件は同じであった。第
一の試験は枯渇培地をもたず、第二の試験は20％を有
し、第三の試験は40％を有し、第四の試験は50％を有
し、第五の試験は80％を有した。発酵試験中、種々の時
間間隔で試験の夫々に関するリボフラビン生産を表VII
−Ａに示す。
リボフラビン生産の初期の刺激が、20％の枯渇培地で
観察される。しかしながら、枯渇培地の増加濃度で、リ
ボフラビン生産は次第に抑制される。
観察される。しかしながら、枯渇培地の増加濃度で、リ
ボフラビン生産は次第に抑制される。
本発明の種々の態様が詳細に記載されたが、これらの
態様の変更及び適応が当業者に思いつくことが明らかで
ある。しかしながら、このような変更及び適応が請求の
範囲に示される本発明の範囲内にあることが、明らかに
理解されるべきである。
態様の変更及び適応が当業者に思いつくことが明らかで
ある。しかしながら、このような変更及び適応が請求の
範囲に示される本発明の範囲内にあることが、明らかに
理解されるべきである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 ウィーヴァー クレイグ エイ アメリカ合衆国 コロラド州 80026 ラファイエット ミロ サークル 1020 エイ (72)発明者 ヤルス マイケル ジェイ アメリカ合衆国 コロラド州 ボールダ ー シックスティーンス ストリート 2231 (72)発明者 バージンスキー リンダ エイ アメリカ合衆国 コロラド州 80301 ボールダー ウィリアムズ フォーク トレイル 204―5120 (72)発明者 ギュール デイル シー アメリカ合衆国 コロラド州 80501 ロングモント ナインス アベニュー 1513 (72)発明者 フォスター エドワード ダブリュー アメリカ合衆国 イリノイ州 60064 ノース シカゴ シェリダン ロード 1400 (56)参考文献 米国特許2411445（ＵＳ，Ａ) Ｐｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐ ｒａｒｍ．1978，30，ｐ．83−88 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/20 C12N 15/01 C12P 25/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】６日間で発酵培地１リットル当り少なくと
も約10gのリボフラビンを生産し得るカンジダ ファマ
タの株。 - 【請求項２】株がATCC登録番号20849及びその突然変異
体により同定される、請求の範囲１項記載のカンジダ
ファマタの株。 - 【請求項３】株がATCC登録番号20850及びその突然変異
体による同定される、請求の範囲１項記載のカンジダ
ファマタの株。 - 【請求項４】請求の範囲１項記載のカンジダ ファマタ
の株であって、（ａ）カンジダ ファマタの集団を細胞
増殖が停止するまで水性栄養培地中で増殖し、ついで
（ｂ）工程（ａ）のカンジダ ファマタの上記の集団を
上記の水性栄養培地から除去して選択剤を得ることを含
む方法により得られた該選択剤を含む選択培地で増殖す
ることができるカンジダ ファマタの株。 - 【請求項５】上記の株がデオキシグルコースによる増殖
の抑制に対して抵抗性である、請求の範囲１項記載のカ
ンジダ ファマタの株。 - 【請求項６】ａ）水性栄養培地中でカンジダ ファマタ
の集団を細胞増殖が停止するまで増殖し、 ｂ）上記の水性栄養培地からカンジダ ファマタを除去
して枯渇培地を形成し、 ｃ）上記の枯渇培地を、カンジダ ファマタの集団に関
して最小阻止濃度で含む選択培地を形成し、 ｄ）そのカンジダ ファマタの集団を突然変異し、 ｅ）その突然変異集団を上記の選択培地に導入し、 次いで ｆ）上記の突然変異集団から、枯渇培地による抑制に対
し抵抗性の株を選択し、その選択されたカンジダ ファ
マタの株が上記の選択培地で増殖する能力を有する ことを特徴とする、枯渇培地による抑制に対し抵抗性の
カンジダ ファマタの選択方法。 - 【請求項７】上記の選択培地が炭素、窒素、及び無機栄
養素の同化し得る源を更に含む請求の範囲６項記載の方
法。 - 【請求項８】上記の枯渇培地が上記の選択培地の少なく
とも約50％を構成する、請求の範囲６項記載の方法。 - 【請求項９】カンジダ ファマタを除去する上記の工程
が、遠心分離及び濾過からなる群から選ばれた工程を含
む、請求の範囲６項記載の方法。 - 【請求項１０】種カンジダ ファマタの酵母のリボフラ
ビン生産株を発酵培地中で培養することによるリボフラ
ビンの生産方法であって、 ａ）約5.4μＭ〜約15μＭの鉄濃度を与える鉄の源並び
に炭素、窒素、及び微量栄養素の同化し得る源を含む発
酵培地に酵母の株を植菌し、上記の酵母の株がATCC登録
番号20849及び20850により同定された株、ATCC登録番号
20849及び20850の突然変異体並びにこれらの混合物から
なる群から選ばれ、上記の突然変異体が６日間で発酵培
地１リットル当り少なくとも約10gのリボフラビンを生
産し、 ｂ）細胞増殖及びリボフラビン生産を支持するのに充分
な栄養素濃度を上記の発酵培地中に維持し、次いで ｃ）リボフラビンを上記の発酵培地から回収する ことを特徴とする、上記のリボフラビンの生産方法。 - 【請求項１１】上記の発酵培地が約1g/リットル〜約7g
〜リットルの濃度でグリシンを更に含む、請求の範囲10
項記載の方法。 - 【請求項１２】上記の維持工程が少なくとも約６日行な
われ、少なくとも約10g/リットルのリボフラビンが生産
される請求の範囲10項記載の方法。 - 【請求項１３】上記の発酵培地が ａ）約1g/リットル〜約7g/リットルの濃度のグリシン、 ｂ）ホスフェートの源、 ｃ）スルフェートの源、及び ｄ）コバルト、銅、ホウ素、モリブデン、マンガン、亜
鉛、カリウム、及びマグネシウムの源 を更に含む、請求の範囲10項記載の方法。 - 【請求項１４】炭素源がグルコースを含み、窒素源が尿
素を含み、ホスフェート源がKH2PO4を含み、マグネシウ
ム及びスルフェートの源がMgSO4を含み、コバルト源がC
oSO4を含み、銅源がCuSO4を含み、ホウ素源がH3BO3を含
み、モリブデン源が（NH4）6Mo7O24を含み、マンガン源
がMoSO4を含み、且つ亜鉛源がZnSO4を含む、請求の範囲
13項記載の方法。 - 【請求項１５】ａ）カンジダ ファマタの集団を、細胞
増殖が停止するまで、水性栄養培地中で増殖し、 ｂ）上記の水性栄養培地からカンジダ ファマタを除去
して枯渇培地を得、 ｃ）上記の枯渇培地を、リボフラビンを生産する能力を
有するカンジダ ファマタの株に関して最小阻止濃度で
含む選択培地を形成し、 ｄ）そのカンジダ ファマタの株の集団を突然変異して
第一突然変異集団を得、 ｅ）上記の第一突然変異集団を上記の選択培地に導入
し、 ｆ）上記の第一突然変異集団から、枯渇培地による抑制
に対し抵抗性である第一の選択株を選択し、 ｇ）上記の第一の選択株の集団を突然変異して第二突然
変異集団を得、 ｈ）上記の第一の選択株に関して最小阻止濃度でツベル
シジンを含む栄養培地で上記の第二突然変異集団を培養
し、次いで ｉ）上記の第二突然変異集団から、上記の栄養培地でコ
ロニーを形成する能力を有する第二の選択株を選択する ことを特徴とする、リボフラビン生産カンジダ ファマ
タの選択方法。 - 【請求項１６】上記の枯渇培地が上記の選択培地の少な
くとも約50％を構成する請求の範囲15項記載の方法。 - 【請求項１７】ツベルシジンが約100μg/mlより大きい
濃度で上記の栄養培地中に存在する、請求の範囲15項記
載の方法。
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