CN101346470B - 制备长链二羧酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明特别发现了能够通过在含直链饱和烃(十三烷)作为底物的液体培养基中培养属于具有产生长链二羧酸能力的酸酒念珠菌(Candida vini)、虫媒念珠菌(Candida entamophila)、布兰克念珠菌(Candida blankii)和粉状毕赤酵母(Pichia farinose)的微生物而产生长链二羧酸的菌株。
Description
技术领域
本发明涉及一种有利的通过利用微生物由直链烃制备长链二羧酸的方法。
背景技术
已知数种酵母菌株在以链烷或脂肪酸作为碳源进行培养时分泌副产物α-，ω-二羧酸。特别是，属于念珠菌属的酵母，如白色念珠菌(C.albicans)、阴沟念珠菌(C.cloacae)、吉勒莫地念珠菌(C.guillermondii)、中间念珠菌(C.intermedia)、解脂念珠菌(C.lipolytica)、麦芽糖念珠菌(C.maltosa)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)和诞沫念珠菌(C.zeylenoides)，已知产生这种二羧酸(Isamu Shiio和Ryousuke Uchio，Agr.Biol.Chem.1971，35：2033-2042)。在热带念珠菌(C.tropicalis)中，ω-氧化途径的第一步是由细胞色素P450单加氧酶和NADPH-细胞色素还原酶组成的膜结合酶复合体(ω-羟化酶复合体)催化的。这一羟化酶复合体负责链烷和脂肪酸中末端甲基的初级氧化(Michele Gilewicz，Marcelle Zacek，Jean-Claude Bertrand和Edgard Azoulay，Can.J.Microbiol.，1979，25，201)。
已确定，烃底物在酵母微粒体中被酶促氧化。在被输送到细胞中后，例如正链烷被特定的细胞色素P450系统羟化为脂肪醇。两个由醇氧化酶和醛脱氢酶催化的进一步的氧化步骤生成相应的脂肪酸。该脂肪酸可以通过相同的途径进一步氧化为相应的二羧酸(ColinRatledge，J.Am.Oil Chem.Soc.，1984，61(2)，447-453)。酵母中的双末端氧化导致从脂族烃产生二羧酸(Shigeo Ogino，Keiji Yano，GakuzoTamura和Kei Arima，Agri.Biol.Chem.，1965，29(11)，109-1015)。
脂肪酸的ω-氧化通过ω-羟基脂肪酸和它的醛衍生物进行，得到相应的二羧酸，而不需要CoA激活。但是，脂肪酸和二羧酸二者都可能在激活相应的酰基-CoA酯后通过过氧化物酶体中的β-氧化途径降解(Atsuo Tanaka和Saburo Fukui，In：The Yeasts，Vol.3，Metabolism and physiology of Yeasts，A.H.Rose和J.S.Harrison编，第二版，Academic Press，Harcourt Brace Jovanovich，Pulishers)，导致链缩短。在酵母中，β-氧化仅在过氧化物酶体中发生(Mitsuyoshi Ueda，Kazunori Yamanoi，Tadashi Morikawa，Hirofumi Okada和Atsuo tanaka，Agr.Biol.Chem.，1985，49，1821-1828)。
通过发酵由大多数酵母(包括热带念珠菌)产生的二羧酸通常比原始底物短一对或多对碳原子，且通常是混合物(Shigeo Ogino，KeijiYano，Gakuzo Tamura和Kei Arima，Agr.Biol.Chem.，1965，29(11)，1009-1015；Shio和Uchio，Agr.Biol.Chem..，1971，35(13)，2033-2042)。这些不需要的副产物通常伴随着二羧酸的生物法生产。
已知通过利用合适的突变体可以实质性地增加二酸的产生(Ryousuke Uchio和Isamu Shiio，Agri.Biol.Chem.，1972，36(3)，426-433)。野生型酵母产生很少(如果有的话)的二羧酸。通常，部分缺失在链烷、脂肪酸或二羧酸底物上生长的能力的突变体表现出提高的二羧酸产量。但是，除了这些突变体利用这些化合物作为碳源进行生长的能力降低以外，没有对其它方面进行表征。可能是通过β-氧化途径的部分阻滞增强了它们产生二羧酸的能力。此外，已知抑制β-氧化的化合物(如丙烯酸酯)也导致二羧酸产量的增加。
另外，这种突变体的使用应防止与通过β-氧化途径相关的不需要的链修饰，如不饱和化、羟基化或链缩短。
许多有机体完成这一转化，包括新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、棒杆菌种(Corynebacterium sp.)及至少两个念珠菌菌株，即阴沟念珠菌和热带念珠菌(Kenneth D.Green，Michael K.Turner，Johm M.Woodley，Enzyme and Microbial Technology，2000，27，205-211)。
利用细菌细胞的研究采用了野生型有机体，其中溶剂、去污剂和固定化都可能提高转化(E.C.Chan和J.Kuo，Biotransformation ofdicarboxylic acid by immobilized Cryptococcus cells.Enzyme Microb.Technol，1997，20，585-589)。相反，利用酵母菌株的研究通常采用其中脂肪酸的β-氧化被削弱的热带念珠菌的突变体。缺乏β-氧化的几种关键酶的热带念珠菌的工程菌株是这些氧化的特别高效的催化物。这导致朝向ω-氧化的代谢流，因而正链烷被更有效地转化为相应的二酸。
发明目的
本发明的主要目的是提供一种通过使用微生物由相应的长链烃以更高的产量和选择性制备饱和二羧酸的方法。
本发明的其它目的将通过下面的描述变得很清楚。
发明内容
本发明提供一种由一种或多种相应的饱和烃制备具有相同数目碳原子的一种或多种饱和二羧酸的方法，其中保持原料化合物的立体结构，该方法包括在含所述饱和烃作为底物的液体培养基中培养选自酸酒念珠菌(Candida vini)、虫媒念珠菌(Candida entamophila)、布兰克念珠菌(Candida blankii)和粉状毕赤酵母(Pichia farinose)的菌株。
在本发明的一种实施方式中，所使用的饱和烃底物的浓度在5-15％(v/v)之间。
在本发明的另一实施方式中，所述液体培养基含有金属盐和有机辅助因子。
在本发明的另一实施方式中，所述培养包括在20至35℃之间的温度下进行最多3天时间的生物化学氧化。
在本发明的另一实施方式中，所使用的饱和烃为具有13个碳原子并在两端具有甲基基团的直链烃。
在本发明的另一实施方式中，所述饱和二羧酸通过任何常规手段从培养基中回收。
在本发明的另一实施方式中，所使用的饱和烃为十三烷，且所产生的相应的饱和二羧酸为十三烷二酸(Brassylic acid)。
在本发明的另一实施方式中，用于生产长链二羧酸的方法包括在含直链烃作为底物的液体培养基中培养选自能够同化直链烃的酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的酵母菌株以获得含与所述烃对应的长链二羧酸的发酵液，和回收所述饱和长链二羧酸。
在本发明的另一实施方式中，所述培养是在需氧条件下进行的。
在本发明的另一实施方式中，所述微生物菌株在含选自正癸烷和正十二烷并且可被该微生物同化的不同碳源的培养基中起始培养，随后在微生物已充分生长时将所述饱和烃加入该培养基中，且在需氧条件下继续氧化以产生所述饱和二羧酸。
在本发明的另一实施方式中，所述培养基的pH值在培养的起始阶段在6.0-7.0的范围内，而在培养的后续阶段为7.0。
在本发明的另一实施方式中，向所述液体培养基中加入一种或多种选自H2O2、链烷及其混合物的产量诱导剂(yield inducer)。
在本发明的另一实施方式中，用己烷萃取所述液体培养基以去除其中的不需要的物质如未反应的烃，有效地除去副产物如单羧酸，在发酵液中留下所述二羧酸，随后向发酵液中加入选自氢氧化钠或氢氧化钾的碱溶液以调节溶液的pH值至10-13，优选11-12，从而使所述二羧酸溶解在所述发酵液中，随后用选自盐酸、硫酸、磷酸和溴酸的无机酸调节发酵液的pH值至pH2以沉淀溶解的二羧酸，随后用醚提取二羧酸。
在本发明的另一实施方式中，用于微生物生长的培养基包含3.0g酵母提取物、3.0g麦芽提取物、5.0g蛋白胨、10g葡萄糖和1L蒸馏水，pH为7.0。
在本发明的另一实施方式中，用于测试二羧酸的中间产生(medium production)的培养基包含10g(NH4)2HPO4、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、9ml十三烷和900ml蒸馏水，pH为7.0。
在本发明的另一实施方式中，用于制备发酵用静息细胞和种子培养物的培养基包含20g D-山梨醇、10g(NH4)2HPO4、2g K2HPO4、0.3gMgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、2g酵母提取物、100μg生物素和900ml蒸馏水，pH为7.0。
在本发明的另一实施方式中，用于发酵的培养基包含5％v/v的十三烷、5g乙酸钠、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mgZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、2g酵母提取物和900ml蒸馏水，pH为7.0。
在本发明的另一实施方式中，粉状毕赤酵母通过十三烷的氧化得到十三烷二酸的选择性为73.81％，转化百分率为21.59。
在本发明的另一实施方式中，布兰克念珠菌通过十三烷的氧化得到十三烷二酸的选择性为45.68％，转化百分率为5.22。
在本发明的另一实施方式中，酸酒念珠菌通过十三烷的氧化得到十三烷二酸的选择性为99.18％，转化百分率为2.80。
在本发明的另一实施方式中，虫媒念珠菌通过十三烷的氧化得到十三烷二酸的选择性为23.58％，转化百分率为28.70。
在本发明的另一实施方式中，培养基包含一种或多种选自氮源和无机盐的附加营养成分。
在本发明的另一实施方式中，氮源选自蛋白胨、脲、磷酸铵、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵。
在本发明的另一实施方式中，无机盐选自钠、钾、镁、铁、镍和锌的磷酸盐、硫酸盐和盐酸盐，依次分别选自KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4.12 H2O、MgSO4.7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和NaCl。
在本发明的另一实施方式中，向培养基中加入选自酵母提取物、肉膏和D-生物素的一种或多种常规营养成分，以帮助酵母生长。
具体实施方式
本发明公开了通过在含直链饱和烃(十三烷)作为底物的液体培养基中培养属于能够产生长链二羧酸的酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的微生物而制备长链二羧酸的方法。
本发明涉及一种通过利用所述酵母菌株由饱和烃制备所述饱和二羧酸的方法。
在本发明的一个实施方式中，为制备长链二羧酸，该方法包括在含直链烃作为底物的液体培养基中培养属于能够同化直链烃的酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的酵母，以获得含与所述烃对应的长链二羧酸的发酵液。
用作制备饱和二羧酸的原料的碳源为具有13个碳原子的饱和烃。
根据本发明，用饱和烃作为碳源，以在需氧条件下培养前述微生物产生具有13个碳原子的饱和二羧酸。或者，所述微生物起始可以在含有除上述饱和烃以外的、可被微生物同化的不同碳源如正癸烷和正十二烷的培养基中培养。随后在微生物已充分生长时将所述饱和烃加入该培养基中，且在需氧条件下继续培养以产生所述饱和二羧酸。
在本发明的再另一实施方式中，前述酵母的静息细胞可以通过以下方式用于制备饱和二羧酸。首先，微生物在含有能被微生物同化而不同于所述饱和烃(即原料化合物)的碳源的培养基中培育。随后微生物在含有饱和烃的培养基中培养，该培养基即作为二羧酸产生的测试培养基的培养基B，将如此培养的微生物转移到培养基D中，以制备用于发酵实验的静息细胞和种子培养物。静息细胞用于所述饱和烃的酶催化氧化以获得饱和二羧酸。这一反应可以在从培养基D中分离出微生物并向培养基E(发酵培养基)中加入适量的饱和烃后，通过悬浮该微生物来完成。在采用微生物的静息细胞的方法中，微生物的培育和所述饱和烃的氧化可以分开进行。在氧化步骤中，所述微生物由于没有碳源而不再能够被培育。氧化步骤中所使用的原料(饱和烃)没有用于微生物的培育。
因为所述饱和烃是液体，所述饱和烃优选通过强烈搅拌或振摇(通常是足够的)保持与水相和微生物的接触。如果需要，充分接触可以通过加入表面活性剂等达到。
本发明的培养过程在含有前述碳源和其它常规营养成分如氮源和无机盐的培养基中进行。合适的氮源的例子包括有机和无机含氮化合物，如蛋白胨、脲、磷酸铵、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵。无机盐的例子包括钠、钾、镁、铁、镍和锌的磷酸盐、硫酸盐和盐酸盐，例如KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4.12 H2O、MgSO4.7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和NaCl。另外，向培养基中加入其它营养成分，如酵母提取物、肉膏和D-生物素，用于帮助酵母生长。
培养在室温下或稍高于室温的温度下进行。20℃-35℃范围内的温度是优选的。培养基的pH值在培养的初始阶段在6.0-7.0的范围内，随后在培养的后续阶段为7.0。pH值通过加入中和剂如氨、氢氧化钠或氢氧化钾进行调节。
此外，培养在需氧条件下进行，如在通气条件下振摇或搅拌。这些过程能够使用作原料的饱和烃、液体培养基和空气相之间适宜地接触。
在上面所述的培养中，所述微生物生长，以氧化所述饱和烃，从而所述二羧酸在培养基中积聚。
当D-生物素作为营养成分加入，且所述饱和烃与另一碳源(如D-山梨醇)一起存在时，微生物起初利用该碳源而不是利用饱和烃生长。静息细胞培养基具有D-生物素和D-山梨醇，然后如此生长的微生物开始氧化发酵培养基中的饱和烃。
在培养基中产生和积聚的所述二羧酸可以被回收和分离。例如，通常采用有机溶剂萃取或通过调节液体培养基的pH值而沉淀的方法。如果需要，液体培养基可以通过适当的方法处理，例如离心或过滤，以除去微生物。如此处理的液体培养基然后在酸化后进行适当的过程，如用二乙醚萃取等等，以有效地分离所需要的产物。
所述饱和二羧酸产物可以按如下方法鉴定。将液体培养基或反应液体用氢氧化钾碱化以溶解饱和二羧酸。取出该溶液并用浓盐酸酸化，再用二乙醚萃取。该醚萃取液随后用重氮甲烷处理以进行甲基化，其再通过气相色谱和GC-MS(气相色谱和质谱检测)进行分析。
如前所述，本发明因此提供一种制备目前仅能通过合成方法困难地制备的饱和二羧酸的方法，其中微生物工艺应用于所述饱和烃。
本发明的显著特征在于，属于酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的四种酵母，其能够同化在含有直链烃作为底物的液体培养基中的直链烃以获得含有对应于所述烃的长链二羧酸的发酵液。
所有相关的微生物菌株在表1中描述。
表1：发现具有在含直链饱和烃(十三烷)作为底物的液体培养基中产生长链二羧酸的能力的微生物菌株列表
| 菌株 | 基因型 | 来源 |
| MTCC998 | 野生型 | 微生物典型培养物保藏中心，IMTECH，昌迪加尔 |
| MTCC1387 | 野生型 | 微生物典型培养物保藏中心，IMTECH，昌迪加尔 |
| MTCC1030 | 野生型 | 微生物典型培养物保藏中心，IMTECH，昌迪加尔 |
| MTCC624 | 野生型 | 微生物典型培养物保藏中心，IMTECH，昌迪加尔 |
材料和方法
微生物：从培养物库中筛选利用正链烷及产生二羧酸的微生物。筛选的75个种中的4个可由正链烷产生所述二羧酸。筛选出粉状毕赤酵母、酸酒念珠菌、虫媒念珠菌和布兰克念珠菌用于由十三烷产生十三烷二酸。
培养基：采用下面的培养基。
培养基A：微生物生长培养基。
3.0g酵母提取物、3.0g麦芽提取物、5.0g蛋白胨、10g葡萄糖和1L蒸馏水，pH7.0。
培养基B：测试二羧酸的中间产生。
10g(NH4)2HPO4、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、9ml十三烷和900ml蒸馏水，pH7.0。
培养基D：用于发酵实验的静息细胞和种子培养物的制备。
20g D-山梨醇、10g(NH4)2HPO4、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mgFeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、2g酵母提取物、100μg生物素和900ml蒸馏水，pH7.0。
培养基E：用于制备二羧酸的发酵培养基。
5％v/v的十三烷、5g乙酸钠、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mgFeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、2g酵母提取物和900ml蒸馏水，pH7.0。
培养
培养基A用于生长微生物。将所述微生物从斜面上转移到培养基A中并在30℃下200rpm的振荡器上孵育2天。将10ml的接种物从培养基A转移到500ml烧瓶中的100ml培养基B中，在30℃下200rpm的振荡器上进行培养2天以检查二羧酸的产生。为制备静息细胞，将10ml的接种物从培养基B转移到500ml锥形烧瓶中的200ml培养基D中，在30℃下200rpm进行培养2天。在旋转振荡器上以200rpm培养2天后，将具有所述微生物的培养基D以8000rpm离心10分钟，并收集细胞团块。将所获得的酵母的细胞团块转移到培养基E(发酵培养基)中，用于从具有作为底物的所述饱和烃的液体培养基制备所述二羧酸。
可用于本发明的微生物是属于具有由直链烃产生长链二羧酸的能力的酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的微生物。本发明的另一目的是通过使用诱导剂利用所述微生物由直链烃产生更大产量的所述二羧酸。诱导剂如H2O2、链烷、H2O2和链烷的组合，用于增加由具有作为底物的饱和烃的液体培养基产生所述二羧酸的产量。
将属于酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的产生长链二羧酸的酵母接种到含有直链饱和烃、特别是具有13个碳原子的直链饱和烃作为底物的培养基中并在其中进行培养，在培养的起始阶段将培养基的pH值调节在6.0-7.0的范围内，然后在培养的剩余过程中将pH值调节为7.0。优选通过加入中和剂如氨、氢氧化钠或氢氧化钾调节pH值，从而产生高产量的对应于用作培养基的底物的烃的长链二羧酸。关于添加烃(作为底物)和碱性物质的方式，它们可以通过采用适当方法预先混合并形成乳液而同时添加，或者它们可以彼此单独添加。另外，培养在需氧条件下进行，例如在通气条件下振摇或搅拌。这些过程能够使用作原料的饱和烃、液体培养基和空气相之间适宜地接触。
当D-生物素作为营养成分加入，且所述饱和烃与另一碳源(如D-山梨醇)一起存在时，微生物起初利用该碳源而不是利用饱和烃生长。静息细胞培养基具有D-生物素和D-山梨醇，然后如此生长的微生物开始氧化发酵培养基中的饱和烃。
通过在培养的初始阶段调节培养基的pH值到6.0-7.0而在所述培养基中进行所述产生二羧酸的酵母的培养，有可能防止所述酵母产生二羧酸的能力的削弱，这种削弱可能是由培养过程中其它污染微生物在培养基中混合和生长而引起的。通过从培养之初维持培养基pH值，进行所述产生二羧酸的酵母的培养。
在如上所述的培养中，微生物生长以氧化所述饱和烃，从而所述饱和二羧酸积聚在培养基中。
用己烷萃取液体培养基以去除与长链二羧酸混合存在于发酵液中的物质如未反应的烃，有效地除去副产物如单羧酸，在所述发酵液中留下所述二羧酸，随后向通过所述培养获得的发酵液中加入如氢氧化钠或氢氧化钾的碱溶液以调节溶液的pH值至10-13，优选11-12，从而使所述二羧酸溶解在所述发酵液中。将所述发酵液调节至pH2.0，以沉淀溶解的二羧酸。合适的强无机酸的例子包括，但不限于，盐酸、硫酸、磷酸和溴酸。随后用醚萃取，长链二羧酸在醚中基本以溶解状态存在。
所获得的产物用气相色谱确认。
GC分析过程
GC条件为填充柱和毛细管柱上的标准化条件
链烷氧化途径的路线如下。
本发明参照下面的说明实施例进一步详细地加以说明。
实施例1：通过用粉状毕赤酵母发酵十三烷制备十三烷二酸
将来自营养培养基斜面的一菌环量的粉状毕赤酵母(MTCC998)转移到培养基A中，并在30℃下200rpm的旋转振荡器上孵育2天。将10ml的接种物从培养基A转移到500ml烧瓶中的100ml培养基B中，在30℃下200rpm的振荡器上进行培养2天，这是为了检查二羧酸的产生。为制备静息细胞，将10ml的接种物从培养基B转移到500ml锥形烧瓶中的200ml培养基D中，在30℃下200rpm进行培养2天。
本发明的一个方面提供一种通过使用诱导剂增加用所述微生物由直链烃产生所述二羧酸的产量的方法。0.1％的H2O2和0.1％的链烷在培养基D中用作诱导剂。在200rpm的旋转振荡器上培养2天后，将带有所述微生物的培养基D以8000rpm离心10分钟。所述带有酵母的发酵液离心后得到10.08gm(对于200ml培养基D)的细胞团块。所有培养基都在121℃灭菌20分钟。
将获得的所述酵母的细胞团块转移到培养基E中，培养基E即用于从液体培养基产生所述二羧酸(十三烷二酸)的含有5％(v/v)所述饱和烃(十三烷)的发酵培养基。
碳源优选保持与水相和微生物接触。氧化在室温下进行。在20℃-35℃范围内的温度是优选的。培养基的pH值在培养的初始阶段在6.0-7.0的范围内，随后在培养的后续阶段保持在7.0。pH值优选通过添加中和剂如氨、氢氧化钠或氢氧化钾进行调节。
用己烷萃取液体培养基以去除与长链二羧酸混合存在于发酵液中的物质如未反应的烃，有效地除去副产物如单羧酸以在所述发酵液中留下所述二羧酸，随后向通过所述培养获得的发酵液中加入如氢氧化钠或氢氧化钾的碱溶液以调节溶液的pH值至10-13，优选11-12，从而使所述二羧酸溶解在所述发酵液中。将所述发酵液调节至pH2.0，以沉淀溶解的二羧酸。合适的强无机酸的例子包括，但不限于，盐酸、硫酸、磷酸和溴酸。随后用醚萃取，长链二羧酸在醚中基本以溶解状态存在。
所获得的产物通过气相色谱进行确定，并通过GC-MS确认。由于产物的GC-MS数据与基准试样相符，产物被确认为十三烷二酸。
粉状毕赤酵母通过十三烷的氧化产生3876.71mg/L的十三烷二酸，选择性为73.81％，转化百分率为21.59。
实施例2：通过用酸酒念珠菌发酵十三烷制备十三烷二酸
将来自营养培养基斜面的一菌环量的酸酒念珠菌(MTCC1387)转移到培养基A中，并在30℃下200rpm的旋转振荡器上孵育2天。以实施例1中的相同方法进行培养。
根据本发明，通过在培养基D中使用0.1％的链烷作为诱导剂增加了用所述微生物由直链烃产生所述二羧酸的产量。在200rpm的旋转振荡器上培养2天后，将带有所述微生物的培养基D以8000rpm离心10分钟。所述带有酵母的发酵液离心后得到3.098gm(对于200ml培养基D)的细胞团块。所有培养基都在121℃灭菌20分钟。
将获得的所述酵母的细胞团块转移到培养基E中，培养基E即用于从液体培养基产生所述二羧酸的含有5％(v/v)所述饱和烃的发酵培养基。
用于分离所述二羧酸的液体培养液的提取按照实施例1中相同的方法进行。
所获得的产物通过气相色谱进行确定，并通过GC-MS确认。由于产物的GC-MS数据与基准试样相符，产物被确认为十三烷二酸。
酸酒念珠菌通过十三烷的氧化产生351.86mg/L的十三烷二酸，选择性为99.18％，转化百分率为2.80。
实施例3：通过用虫媒念珠菌发酵十三烷制备十三烷二酸
将来自营养培养基斜面的一菌环量的虫媒念珠菌(MTCC1030)转移到培养基A中，并在30℃下200rpm的旋转振荡器上孵育2天。以实施例1中的相同方法进行培养。
根据本发明，通过在培养基D中使用0.1％的H2O2和0.1％的链烷作为诱导剂增加了用所述微生物由直链烃产生所述二羧酸的产量。在200rpm的旋转振荡器上培养2天后，将带有所述微生物的培养基D以8000rpm离心10分钟。所述带有酵母的发酵液离心后得到6.79gm(对于200ml培养基D)的细胞团块。所有培养基都在121℃灭菌20分钟。
将获得的所述酵母的细胞团块转移到培养基E中，培养基E即用于从液体培养基产生所述二羧酸的含有5％(v/v)所述饱和烃的发酵培养基。
用于分离所述二羧酸的液体培养液的提取按照实施例1中相同的方法进行。所获得的产物通过气相色谱进行确定，并通过GC-MS确认。由于产物的GC-MS数据与基准试样相符，产物被确认为十三烷二酸。
虫媒念珠菌通过十三烷的氧化产生778.02mg/L的十三烷二酸，选择性为23.58％，转化百分率为28.70。
实施例4：通过用布兰克念珠菌发酵十三烷制备十三烷二酸
将来自营养培养基斜面的一菌环量的布兰克念珠菌(MTCC624)转移到培养基A中，并在30℃下200rpm的旋转振荡器上孵育2天。以实施例1中的相同方法进行培养。
根据本发明，通过在培养基D中使用0.1％的H2O2和1％的链烷作为诱导剂增加了用所述微生物由直链烃产生所述二羧酸的产量。在200rpm的旋转振荡器上培养2天后，将带有所述微生物的培养基D以8000rpm离心10分钟。所述带有酵母的发酵液离心后得到6.79gm(对于200ml培养基D)的细胞团块。所有培养基都在121℃灭菌20分钟。
将获得的所述酵母的细胞团块转移到培养基E中，培养基E即用于从液体培养基产生所述二羧酸的含有5％(v/v)所述饱和烃的发酵培养基。
用于分离所述二羧酸的液体培养液的提取按照实施例1中相同的方法进行。
所获得的产物通过气相色谱进行确定，并通过GC-MS确认。由于产物的GC-MS数据与基准试样相符，产物被确认为十三烷二酸。
布兰克念珠菌通过十三烷的氧化产生274.09mg/L的十三烷二酸，选择性为45.68％，转化百分率为5.22。
显示酵母由十三烷产生十三烷二酸的百分转化率和选择性的表
| 培养物号 | 种 | 产率mg/L | 诱导剂 | 选择性％ | 转化率％ |
| MTCC998 | 粉状毕赤酵母 | 3876.71 | 0.1％H2O2+0.1％链烷 | 73.81 | 21.59 |
| MTCC1387 | 酸酒念珠菌 | 351.86 | 0.1％链烷 | 99.18 | 2.80 |
| MTCC1030 | 虫媒念珠菌 | 778.02 | 0.1％H2O2+0.1％链烷 | 23.58 | 28.70 |
| MTCC624 | 布兰克念珠菌 | 274.09 | 0.1％H2O2+1％己烷 | 45.68 | 5.22 |
本发明的主要优势在于：
可由正链烷的微生物氧化产生的脂族长链α，ω-二羧酸(DC)广泛用作合成产品如香料、聚合物、粘合剂、大环内酯抗生素和高质量润滑剂的原料。在医药应用中，1，13-二羧酸在制备合成麝香酮(一种用于治疗冠心病和关节炎症的传统中药的活性成分)方面是很有价值的。天然麝香酮一般从成年雄性麝鹿的香腺中提取。采用化学途径合成长链α，ω-二羧酸产生包含较短链长度的混合物。结果，需要大量的纯化步骤，因此最近人们对通过利用微生物按照发酵工艺生产这种长链二羧酸的方法的兴趣逐渐增加。本发明的显著特征在于，筛选出四种属于酸酒念珠菌、虫媒念珠菌、布兰克念珠菌和粉状毕赤酵母的酵母，其能够同化在含有直链烃(十三烷)作为底物的液体培养基中的直链烃，从而获得含有对应于所述烃的长链二羧酸的发酵液。
本发明的另一优势是通过使用诱导剂能够利用所述微生物由直链烃产生更大产量的所述二羧酸。诱导剂如H2O2、链烷、H2O2和链烷的组合。链烷用于提高从含有饱和烃作为底物的液体培养基产生所述二羧酸的产量。
Claims (22)
1.一种由一种或多种相应的饱和烃制备一种或多种具有相同数目碳原子的饱和二羧酸的方法，其中保持原料化合物的立体结构，该方法包括在含所述饱和烃作为底物的液体培养基中培养粉状毕赤酵母，其中所使用的饱和烃为十三烷，且所产生的相应的饱和二羧酸为十三烷二酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所使用的饱和烃底物的浓度在5-15％v/v之间。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述液体培养基含有金属盐和有机辅助因子。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述培养包括在20至35℃之间的温度下进行最多3天时间的生物化学氧化。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述饱和二羧酸通过常规手段从培养基中回收。
6.一种生产长链二羧酸的方法，其包括在含直链烃作为底物的液体培养基中培养能够同化直链烃的粉状毕赤酵母，以获得含有与所述烃对应的长链二羧酸的发酵液，和回收所述饱和长链二羧酸，其中所使用的直链烃为十三烷，且所产生的对应的长链二羧酸为十三烷二酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述培养是在需氧条件下进行的。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述粉状毕赤酵母在含选自正癸烷和正十二烷并可被该微生物同化的不同碳源的液体培养基中起始培养，随后在粉状毕赤酵母已充分生长时将十三烷加入该培养基中，且在需氧条件下继续氧化，以产生所述饱和二羧酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述液体培养基的pH值在培养的起始阶段在6.0-7.0的范围内，而在培养的后续阶段为7.0。
10.如权利要求1或8所述的方法，其中向所述液体培养基中加入一种或多种选自H2O2、链烷及其混合物的产量诱导剂。
11.如权利要求1或8所述的方法，其中用己烷萃取所述液体培养基以去除其中不需要的物质，有效地除去副产物，在发酵液中留下所述二羧酸，随后向发酵液中加入选自氢氧化钠和氢氧化钾的碱溶液以调节溶液的pH值至10-13，从而使所述二羧酸溶解在所述发酵液中，随后用选自盐酸、硫酸、磷酸和溴酸的无机酸调节发酵液的pH值至pH2以沉淀溶解的二羧酸，随后用醚提取该二羧酸。
12.如权利要求11所述的方法，其中向发酵液中加入选自氢氧化钠和氢氧化钾的碱溶液调节溶液的pH值至11-12。
13.如权利要求1-9所述的方法，包括在生长培养基中生长粉状毕赤酵母的步骤，其中所述用于粉状毕赤酵母生长的培养基包含3.0g酵母提取物、3.0g麦芽提取物、5.0g蛋白胨、10g葡萄糖和1L蒸馏水，pH为7.0。
14.如权利要求1-9所述的方法，包括测试二羧酸的中间产生的步骤，其中用于测试二羧酸的中间产生的培养基包含10g(NH4)2HPO4、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mgZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、9ml十三烷和900ml蒸馏水，pH为7.0。
15.如权利要求1-9所述的方法，包括制备用于发酵的静息细胞和种子培养物的步骤，其中用于制备发酵用静息细胞和种子培养物的培养基包含20g D-山梨醇、10g(NH4)2HPO4、2g K2HPO4、0.3g MgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、2g酵母提取物、100μg生物素和900ml蒸馏水，pH为7.0。
16.如权利要求1-9所述的方法，其中所述用于通过发酵产生二羧酸的培养基包含5％v/v的十三烷、5g乙酸钠、2g K2HPO4、0.3gMgSO4、10mg FeSO4·7H2O、8mg ZnSO4·7H2O、8mg MnSO4、2g酵母提取物和900ml蒸馏水，pH为7.0。
17.如权利要求1或8所述的方法，其中粉状毕赤酵母通过十三烷的氧化得到十三烷二酸的选择性为73.81％，转化百分率为21.59％。
18.如权利要求1或8所述的方法，其中所述培养基包含一种或多种选自氮源和无机盐的附加营养成分。
19.如权利要求18所述的方法，其中所使用的氮源选自蛋白胨、脲、磷酸铵、氯化铵、硫酸铵和硝酸铵。
20.如权利要求18所述的方法，其中所使用的无机盐选自钠、钾、镁、铁、镍和锌的磷酸盐、硫酸盐和盐酸盐。
21.如权利要求18所述的方法，其中所使用的无机盐选自KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和NaCl。
22.如权利要求1或8所述的方法，其中向培养基中加入选自酵母提取物、肉膏和D-生物素的一种或多种常规营养成分，以帮助粉状毕赤酵母生长。
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