KR101453621B1 - 신규한 류코노스톡 메센터로이드 ｋｐｘ-14 및 이를 이용한 ｄ형 유산을 생산하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 김치에서 분리된 고순도의 D형 유산을 특이적으로 생산하는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주가 광학 이성질체인 D형 유산을 고순도 및 고효율로 생산하는 활성을 가지기 때문에, 순수한 광학 이성질체를 특이적으로 생산하는 생물학적 발효에 이용 가능하며, 이를 PDLA 생산에 이용하면 PLA에 비해 안정성이 향상된 생분해성 플라스틱을 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 류코노스톡 메센터로이드 ＫＰＸ-14 및 이를 이용한 Ｄ형 유산을 생산하는 방법{Novel Leuconostoc mesenteroides KPX-14 and method of producing D-type lactic acid with using the same}
김치에서 분리된 고순도의 D형 유산을 특이적으로 생산하는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주의 D형 유산 생산능에 관한 것이다.
유산은 생물체 내에서 탄수화물이 산화된 피루브산(pyruvate)의 환원으로 lactate dehydrogenase 효소에 의해 생산되는 유기산이다. 유산은 L-(+)-Lactic acid와 D-(-)-lactic acid의 광학 이성질체(enantiomer)를 갖는 특성을 갖고 있으며, 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질로 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용될 뿐만 아니라, 환경 친화적인 대체 고분자 물질인 생분해성 플라스틱 폴리유산(polylactic acid, PLA)의 원료로서 최근 그 수요가 크게 증가하고 있다. 또한, 유산은 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 유산 에스테르, 아세트알데하이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하므로, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.
유산은 일반적으로 식품 보존제, 향취제 또는 산미제 등의 식품 첨가제로 사용될 뿐만 아니라 화장품, 화학, 금속, 전자, 직물, 염색, 제약 등 산업적으로 광범위하게 이용되는 중요한 유기산이다. 뿐만 아니라 유산은 생분해성 플라스틱의 일종인 폴리유산의 원료물질로도 사용되는데, 근래에 들어서는 유가상승, 원유의 고갈, 석유유래 플라스틱 제품의 부패하지 않는 특성으로 인해 야기되는 환경오염 문제로 인한 난분해성 플라스틱의 환경친화적인 대체 고분자 물질에 대한 관심이 증가되고 있어서 이에 따른 유산의 수요가 크게 증가하는 추세이다. 세계적인 유산시장의 규모는 2000년 기준 연간 약 10만 톤 정도이며, 연간 약 5%의 성장을 하고 있으며, 생분해성 플라스틱의 수요가 점차적으로 증가하고 있음을 감안할 때 향후 수 년 이내에 유산의 수요는 더욱 증가할 것으로 예상된다. 특히 유산은 수산기와 카르복실기를 가지고 있어 반응성이 큰 유기산으로서, 폴리유산 뿐만 아니라 아세트알데히드(acetaldehyde), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 아크릴산(acrylic acid), 2,3-펜타디온(2,3-pentathione) 등의 화학물을 생산하는 중요한 원료 물질로도 사용된다. 유산은 또한, 생분해성이며 무독성 용제인 에틸락테이트(ethyl lactate)의 제조에도 사용되며, 이는 전자제조업, 페인트나 직물, 세제, 접착제나 인쇄물 등에 이용되고 있다.
이와 같이 유산은 산업적으로 유용성이 매우 큰 물질이며, 유산을 생산하는 방법으로는 전통적인 화학합성법과 탄수화물을 기질로 하는 생물학적 발효법이 있다. 상업적으로는 후자의 방법이 선호되어지는데, 그 이유는 화학합성법을 이용해 유산을 제조하는 경우 유가상승에 의한 원가상승 측면이나 환경오염 측면의 문제점 외에도 D형 유산과 L형 유산이 50%씩 섞여있는 라세믹(racemic) 혼합물 형태의 비활성인 디, 엘(D, L) 유산이 생성된다는 단점 때문이다. 이때에 D형과 L형 유산의 혼합물 조성비는 조절이 불가능하며, 라세믹 혼합물 형태의 유산을 원료로 폴리유산을 제조할 경우 용융점이 낮은 무정형의 고분자가 되어 내열성, 성형성, 가공성 등이 결여되므로 용도 개발시에도 제한이 많다. 반면에 미생물을 이용한 생물학적 발효법의 경우 사용하는 균주에 따라서 D형 또는 L형의 유산만을 선택적으로 생산하는 것이 가능하다. 예를 들면, 락토바실러스형(Lactobacillus), 바실러스형(Bacillus), 리조푸스형(Rhizopus), 스트렙토코코스형(Streptococcus), 엔테로코코스형(Enterococcus)의 미생물은 L형 유산을 주로 생산하며, 류코노스톡형(Leuconostoc)과 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus vulgaricus) 미생물은 D형 유산을 주로 생산하는 것으로 알려져 있다. 광학적으로 순수한 유산의 생산은 PLA의 물리적 성질에 중요한 역할을 하여 혼합된 유산에 의한 PLA 에 비해 안정적인 결정의 고분자 PLA를 얻을 수 있다. L형 유산만으로 제조된 PLA (PLLA)의 경우 용융점을 170℃인 반면 D형 유산으로 제조된 PLA (PDLA)를 혼합하여 제조된 streocomplex PLA의 경우 용융점이 약 230℃까지 높아진다. 그러한 이유로 D형 유산으로 제조된 PDLA의 생산이 필요하며 순수한 이성질체의 유산을 얻을 수 있는 미생물 발효를 이용한 D형 유산의 생산이 중요하게 여겨지고 있다. 이와 같이, 유산 발효 생산은 석유화학 공정과 달리 유산 생산 미생물에 절대적으로 의존적이기 때문에, 유산을 대량으로 생산할 수 있는 것은 물론 생산 비용을 절감할 수 있도록 높은 광학 순도의 유산을 생산할 수 있는 미생물을 확보하는 것이 무엇보다 중요하다. 고순도 광학 선택도의 유산을 대량 생산하기 위해서는 대량의 유산 원료가 투입되어야 하고, 여러 단계의 분리 정제 공정이 필수적으로 요구되기 때문에 생산 단가는 급격하게 증가된다. 따라서 유산을 대량으로 생산하는 것과 더불어 필수적으로 요구되는 기술이 고순도의 광학 선택도를 갖는 유산 생산 미생물 균주를 개발하는 것이다. 이를 위해서는 우수한 광학 선택도를 갖는 유산 생산 유전자 확보와 더불어 높은 광학 선택도의 대사 흐름을 최적화할 수 있는 시스템 분석 기술과 고도의 대사 공학 기술이 필수적으로 요구된다.
현재 석유화학공업의 발달로 인하여 대부분의 화학 물질들이 석유 및 천연가스로부터 생산되고 있으나, 최근 지구온난화 현상 등 환경문제의 대두로 전세계적으로 환경규제가 강화되어, 화학물질의 생산을 위한 대체공정의 개발에 대한 요구가 증가되고 있다. 이에 따라, 미생물 배양기술과 유전공학적 기술의 획기적인 발달에 힘입어 생물공정에 의한 생물학적 물질(biochemical)의 생산이 점차 석유화학공정에 대하여 경쟁력을 갖게 되었다. 생물학적인 방법은 값싼 재생자원(renewable resource)을 원료로서 이용하고, 이산화탄소 등 지구온난화가스의 발생을 공정상에서 억제할 수 있기 때문에 환경문제를 근본적으로 해결할 수 있는 환경친화적 공정으로 알려져 있으므로, 균주개발 및 공정개선 등 원가절감을 위한 연구가 확대되고 있는 추세이다. 아울러, 생물학적 물질의 시장성이 매우 높아지고 있어, 미생물을 이용하여 생물자원(biomass)으로부터 생물학적 물질의 생산에 대한 연구가 전세계적으로 활발히 진행되고 있다. 이러한 생물학적 물질 중에서, 유산(lactic acid)은 생분해성 플라스틱 모노머, 식품첨가제, 기타 유기화합물의 중간체 등 그 다양한 이용성과 가격경쟁력 때문에, 이들 물질에 대한 관심이 날로 증가하는 추세이다.
폴리유산(PLA)은 상업적으로 생산되는 바이오플라스틱(bio-plastic)의 원료로서 락타이드(lactide)의 축합중합(condensation)에 의해 생성되는 지방족 폴리에스테르(polyester)이다. PLA는 전자제품 포장재, 생수병, 자동차 내장재, 사무용 가구, 엔지니어링 플라스틱, 섬유 분야 등의 아주 중요한 용도를 갖고 있어 미래의 대표적인 생분해성 바이오플라스틱으로 각광을 받고 있다. 특히 근래에 전세계적으로 활발히 전개되고 있는 「지구환경보호운동」과 더불어 지구온난화, 기후변화에 대한 환경친화적인 차세대 대체 섬유 소재의 필요성이 대두됨에 따라, 천연적으로 재활용이 가능하고 오염물질을 배출하지 않으며, 합성섬유와 유사한 물리화학적 성질 및 기계적 성질을 가지면서 생분해가 가능한 PLA 생분해성 섬유는 무한한 잠재력을 가지고 있다고 볼 수 있다. 이러한 잠재력이 있음에도 불구하고 생분해성 섬유는 아직 일반합성섬유에 비해 5-10배 정도 생산단가가 높고 대량 생산을 하는데 어려움이 많을 뿐 아니라 특성에 따른 용도개발이 이루어져 있지 않아 그 실용화가 미미한 실정이다.
이와 같이 유산이 기존의 다양한 산업적 용도 뿐만 아니라 환경 친화적 대체 소재로서 커다란 잠재시장을 가지고있는 현 시점에서 생물학적 발효법에 의해 경제적으로 유산을 생산하는 방법의 개발은 매우 중요하므로, 순수한 광학 이성질체 유산을 고농도 고수율로 생산하는 생산 균주의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은, 생물학적 유산 발효공정에서 D형 유산 수율이 높고, 발효 종료시 발효액내 D형 유산의 농도가 높고, 요구되는 발효시간이 짧아 높은 생산성을 보이는 유산균을 분리하였으며, 이를 산업적으로 유용한 고농도 고수율의 D형 유산을 생산하는데 이용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
국내 공개 특허 제2013-0013226호
본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC 12332BP로 수탁된, D형 유산 생산능을 가지는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 (Leuconostoc mesenteroides KPX-14) 균주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 D형 유산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 균주가 생산한 D형 유산을 이용하여 폴리유산(PDLA)을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 12332BP로 수탁된, D형 유산 생산능을 가지는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 (Leuconostoc mesenteroides KPX-14) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 D형 유산을 생산하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명의 균주가 생산한 D형 유산을 이용하여 폴리유산(PDLA)을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주는 D형 유산을 고순도로 빠르게 생산하여, 우수한 D형 유산 생산성을 가지므로, 산업적으로 유용한 순수 광학 이성질체를 생산하는 생물학적 발효법에 적합하며, 생산된 고순도의 D형 유산을 안정적인 결정의 생분해성 플라스틱인 PDLA 생산에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주 (KCTC 12332BP)를 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 류코노스톡 메센터로이드 표준 균주 (KCTC 3718)를 배양한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC 12332BP로 수탁된, D형 유산 생산능을 가지는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 (Leuconostoc mesenteroides KPX-14) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 제1항의 균주를 전 배양하는 단계; 및
2) 상기 균주를 발효 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 D형 유산을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 전 배양은 포도당이 함유된 MRS 배지에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 2)의 발효 배지는 글루코즈, 펩톤, 효모추출물(yeast extract), 육즙 추출물(meat extract), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 암모늄 아세테이트(ammonium acetate), K2HPO4, MgSO47H2O 및 MnSO44H2O로 구성되는 MRS 배지에 포도당 80 g/L가 첨가된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 균주가 생산한 D형 유산을 이용하여 폴리유산(PDLA)을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 김치에서 유산을 생산하는 균주를 분리하였으며, 이 중 D형 유산을 특이적으로 생산하는 신규한 균주를 동정하여 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14로 명명하였다. 상기 균주의 D형 유산 생산능을 확인하였으며 (도 1), 이를 류코노스톡 메센터로이드 표준 균주와 비교한 결과 (표 3), 표준 균주에 비해 생장이 빠르고, D형 유산을 많이 생산하며, D형 유산의 비율이 매우 높음을 확인하였다(표 1 및 표 2).
따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주의 고순도 D형 유산 생산효율을 확인하였으므로, 이를 안정적인 결정의 고분자 PLA인 PDLA 제조에 이용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
< 실시예 1> D형 유산 생산 균주 선별 및 분리
본 발명자들은, 고농도 고수율로 D형 유산을 생산하는 균주를 분리하기 위하여, 김치로부터 유산 생산 균주를 선별 및 분리하였다.
구체적으로, 김치로부터 액즙을 분리한 후, 생리식염수 (9g/L NaCl)로 희석하여 MRS 플레이트 배지 (Difco Co.)에 균일하게 도말하였다. 37 ℃에서 2일 동안 배양한 후 콜로니를 순수 분리하였다. 분리한 균주들을 CaCO3를 포함하는 MRS 플레이트 배지에 재배양한 뒤, 콜로니 주위의 CaCO3를 용해하는 환 생성 균주를 유산 생산균으로 선별하였다. 선별한 균주들을 MRS 액체 배지에 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 균주의 균체를 제거한 상등액을 희석하여 HPLC로 D형 유산 생산능과 L형 유산 생산능을 Sumica chiral 컬럼 OA-5000 및 2mM CuSO4를 포함하는 아세토나이트릴(acetonitrile) : 물 (5:95)의 이동상 용매를 사용하여 유속 분당 1 ml 및 UV 254nm의 조건으로 Varian HPLC를 이용하여 확인하였다.
그 결과, D형 유산을 특이적으로 생산하는 균주를 분리하였다.
< 실시예 2> D형 유산 생산 균주 동정
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 분리한 D형 유산을 특이적으로 생산하는 균주의 16S rDNA 염기 서열을 분석하여 균주를 동정하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 분리한 D형 유산 생산능이 우수한 균주의 16S rDNA의 부분 염기서열을 27F 프라이머 (서열번호 2) 및 1492R 프라이머 (서열번호 3)를 이용하여 16S rDNA의 부분 염기서열을 결정하였다 (서열번호 1). 결정한 염기서열을 이용하여 표준 균주의 DNA 염기서열 데이터베이스 (EzBioCloud)와 비교하였다.
그 결과, 상기 분리된 균주는 류코노스톡속 표준 균주 류코노스톡 메센터로이드 균주 (Leuconostoc mesenteroides) KCTC 3718과 16S rDNA의 부분 염기서열과 유사성을 보이는 신규한 류코노스톡속 미생물로 판명되었으며, 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14로 명명하였다. 아울러, 한국생명공학연구원 내 생명자원센터 (Korean Collection for Type Culture, KCTC)에 2012년 12월 3일에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12332BP를 부여받았다.
< 실시예 3> 류코노스톡 메센터로이드 KPX -14 균주의 D형 유산 생산 활성 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 동정한 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주의 D형 유산 생산 활성을 확인하였다.
구체적으로, 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주를 MRS 배지에 18시간 동안 전 배양하였다. 전 배양한 균주 200 ml를 MRS 배지 (Difco, Lactobacillus MRS Broth) (글루코즈 20 g/L, 펩톤 10 g/L, 효모추출물(yeast extract) 5 g/L, 육즙 추출물(meat extract) 10 g/L, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 5 g/L, 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 2 g/L, K2HPO4 5 g/L, MgSO47H2O 0.1 g/L 및 MnSO44H2O 0.05 g/L)에 포도당 80 g/L를 첨가한 발효 배지 2.0 L가 들어있는 발효조 (5L)에 접종하였다. 접종 후, pH 5.5, 교반 속도 100 rpm, 32 ℃ 조건에서 29.5시간 동안 배양하였다.
그 결과, 배양 29.5시간 뒤의 세포성장은 흡광도 (O.D.600) 40이었으며, 포도당 100 g이 소모되고 D형 유산 80.6 g/L가 생성되었으며 (도 1), L형 유산 및 부산물을 제외한 순수 D형 유산의 수율은 96.8%이므로 시간당 부피 생산량은 2.73g/L/hr이다 (표 1).
따라서, 본 발명의 균주는 생산된 총 유산 중 97.3%를 D형 유산으로 생산하므로 (L형 유산 2.7%) 고순도로 D형 유산을 생산함을 확인할 수 있었다 (표 2).
그 후, D형 유산을 정제하기 위하여 배양 종료 후의 발효액에서 균체를 제거하고, Ca(OH)2를 첨가하여 Ca salt형의 유산으로 전환시켰다. 그 뒤, EtOH를 배양액의 2배수로 첨가하여 침전을 유도하고 정제하였다. D형 유산과 L형 유산을 분리하여 정제하기가 어렵기 때문에, 발효종료시의 D형 유산의 순도가 정제과정에서의 순도와 일치하였다.
균주 온도 dLA (g/L) Yp/s 시간 생산성 (g/L/hr)
Leuconostoc mesenteroides KPX-14 32℃ 80.6 96.7 29.5 2.73
유산 생산비율 D형 유산 L형 유산
Leuconostoc mesenteroides KPX-14 97.3% 2.7%
< 비교예 3> 류코노스톡 메센터로이드 표준 균주 ( KCTC 3718)의 D형 유산 생산능 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 본원발명의 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주의 D형 유산 생산능을 비교하기 위하여 표준 균주인 류코노스톡 메센터로이드 (KCTC 3718)의 D형 유산 생산 활성을 확인하였다.
구체적으로, 류코노스톡 메센터로이드 KCTC 3718 균주를 MRS 배지에 18시간 동안 배양하였다. 배양한 균주 200 ml를 결과적으로 포도당이 총 80 g/L가 첨가된, 글루코즈 40 g/L, 펩톤 10 g/L, 효모추출물(yeast extract) 5 g/L, 육즙 추출물(meat extract) 10 g/L, 소듐 아세테이트(sodium acetate) 5 g/L, 암모늄 아세테이트(ammonium acetate) 2 g/L, K2HPO4 5 g/L, MgSO47H2O 0.1 g/L 및 MnSO44H2O 0.05 g/L로 구성되는 배양 배지 (Difco, Lactobacillus MRS Broth) 2.0 L가 들어있는 발효조 (5L)에 접종하였다. 접종 후, pH 5.5, 교반 속도 100 rpm, 32 ℃ 조건에서 33시간 동안 배양하였다.
그 결과, 배양 33시간 뒤에 세포성장은 흡광도 (O.D.600) 13이었으며, 포도당은 잔존 포도당 농도 35.8 g/L까지 소모되고 D형 유산 32.7 g/L가 생성되었으며 (도 2), 표준 균주의 L형 유산 및 부산물을 제외한 순수 D형 유산의 수율은 51%, 시간당 부피 생산량은 0.99 g/L/hr이다 (표 3).
따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 균주의 D형 유산 생산능력이 표준 균주에 비해 약 3배 월등한 것을 알 수 있었다.
균주 dLA (g/L) Yp/s 시간 생산성 (g/L/hr)
Leuconostoc mesenteroides
subsp . mesenteroides
KCTC3718		 32.7 51 33 0.99
한국생명공학연구원 KCTC12332BP 20121203
<110> KPX BIOTECH CO., LTD. <120> Novel Leuconostoc mesenteroide KPX-14 and method of producing D-type lactic acid with high concentraion and high yield using the same <130> p121247 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1378 <212> DNA <213> Leuconostoc mesenteroides <400> 1 aaaggtgctt gcacctttca agtgagtggc gaacgggtga gtaacacgtg gacaacctgc 60 ctcaaggctg gggataacat ttggaaacag atgctaatac cgaataaaac ttagtgtcgc 120 atgacacaaa gttaaaaggc gcttcggcgt cacctagaga tggatccgcg gtgcattagt 180 tagttggtgg ggtaaaggcc taccaagaca atgatgcata gccgagttga gagactgatc 240 ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggctgcagt agggaatctt 300 ccacaatggg cgaaagcctg atggagcaac gccgcgtgtg tgatgaaggc tttcgggtcg 360 taaagcactg ttgtatggga agaacagcta gaataggaaa tgattttagt ttgacggtac 420 cataccagaa agggacggct aaatacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt atgtcccgag 480 cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcagacgg tttattaagt ctgatgtgaa 540 agcccggagc tcaactccgg aatggcattg gaaactggtt aacttgagtg cagtagaggt 600 aagtggaact ccatgtgtag cggtggaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 660 aggcggctta ctggactgca actgacgttg aggctcgaaa gtgtgggtag caaacaggat 720 tagataccct ggtagtccac accgtaaacg atgaacacta ggtgttagga ggtttccgcc 780 tcttagtgcc gaagctaacg cattaagtgt tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga 840 aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900 aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctttgaagc ttttagagat agaagtgttc 960 tcttcggaga caaagtgaca ggtggtgcat ggtcgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1020 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attgttagtt gccagcattc agatgggcac 1080 tctagcgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggcgggg acgacgtcag atcatcatgc 1140 cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggcgtat acaacgagtt gccaacccgc 1200 gagggtgagc taatctctta aagtacgtct cagttcggat tgtagtctgc aactcgacta 1260 catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg 1320 tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtttgtaat gcccaaagcc ggtggcct 1378 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (5)

  1. 기탁번호 KCTC 12332BP로 수탁된, D형 유산 생산능을 가지는 류코노스톡 메센터로이드 KPX-14 (Leuconostoc mesenteroides KPX-14) 균주.
  2. 1) 제1항의 균주를 전 배양하는 단계; 및
    2) 상기 균주를 발효 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 D형 유산을 생산하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 단계 1)의 전 배양은 포도당이 함유된 MRS 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 D형 유산을 생산하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단계 2)의 발효 배지는 글루코즈, 펩톤, 효모추출물(yeast extract), 육즙 추출물(meat extract), 소듐 아세테이트(sodium acetate), 암모늄 아세테이트(ammonium acetate), K2HPO4, MgSO47H2O 및 MnSO44H2O로 구성되는 MRS 배지에 포도당 80 g/L가 첨가된 것을 특징으로 하는 D형 유산을 생산하는 방법.
  5. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090305367A1 (en) 2005-12-30 2009-12-10 Ahmed Kamal Process for preparing long-chain dicarboxylic acids
WO2010084972A1 (ja) 2009-01-23 2010-07-29 株式会社アグリバイオインダストリ Ｄ－乳酸の製造方法および乳酸においてｄ－乳酸の光学純度または対糖収率を高める方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090305367A1 (en) 2005-12-30 2009-12-10 Ahmed Kamal Process for preparing long-chain dicarboxylic acids
WO2010084972A1 (ja) 2009-01-23 2010-07-29 株式会社アグリバイオインダストリ Ｄ－乳酸の製造方法および乳酸においてｄ－乳酸の光学純度または対糖収率を高める方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Appl. Biochem. Biotechnol., Vol.164, pp.1160-1171(2011.) *
Appl. Biochem. Biotechnol., Vol.164, pp.1160-1171(2011.)*
Macromolecules, Vol.20, pp.904-906(1987.) *
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