JP6274494B2 - 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 - Google Patents
微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6274494B2 JP6274494B2 JP2013216465A JP2013216465A JP6274494B2 JP 6274494 B2 JP6274494 B2 JP 6274494B2 JP 2013216465 A JP2013216465 A JP 2013216465A JP 2013216465 A JP2013216465 A JP 2013216465A JP 6274494 B2 JP6274494 B2 JP 6274494B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- microorganism
- pha
- polyhydroxyalkanoic
- lignin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 68
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 17
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 claims description 39
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 20
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxybutyric acid Chemical compound CC(O)CC(O)=O WHBMMWSBFZVSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- 241001528539 Cupriavidus necator Species 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 241001528480 Cupriavidus Species 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 6
- 241000232299 Ralstonia Species 0.000 claims description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 22
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 11
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical group OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QAIPRVGONGVQAS-DUXPYHPUSA-N trans-caffeic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 QAIPRVGONGVQAS-DUXPYHPUSA-N 0.000 description 10
- YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-M 3,4-dihydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=C(C([O-])=O)C=C1O YQUVCSBJEUQKSH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000481518 Ralstonia eutropha H16 Species 0.000 description 9
- JMSVCTWVEWCHDZ-UHFFFAOYSA-N syringic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC(OC)=C1O JMSVCTWVEWCHDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 7
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-N Terephthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 KKEYFWRCBNTPAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 7
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N sinapic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 6
- PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N sinapinic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC(OC)=C1O PCMORTLOPMLEFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ACEAELOMUCBPJP-UHFFFAOYSA-N (E)-3,4,5-trihydroxycinnamic acid Natural products OC(=O)C=CC1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ACEAELOMUCBPJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M (E)-Ferulic acid Natural products COC1=CC(\C=C\C([O-])=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-M 0.000 description 5
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 4-Hydroxycinnamate Natural products OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 description 5
- DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N Acetovanillone Natural products COC1=CC(C(C)=O)=CC=C1O DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000004883 caffeic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940074360 caffeic acid Drugs 0.000 description 5
- QAIPRVGONGVQAS-UHFFFAOYSA-N cis-caffeic acid Natural products OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C(O)=C1 QAIPRVGONGVQAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 description 5
- 235000001785 ferulic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940114124 ferulic acid Drugs 0.000 description 5
- KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N ferulic acid Natural products COC1=CC(C=CC(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N trans-isoferulic acid Natural products COC1=CC=C(C=CC(O)=O)C=C1O QURCVMIEKCOAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WKOLLVMJNQIZCI-UHFFFAOYSA-N vanillic acid Chemical compound COC1=CC(C(O)=O)=CC=C1O WKOLLVMJNQIZCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TUUBOHWZSQXCSW-UHFFFAOYSA-N vanillic acid Natural products COC1=CC(O)=CC(C(O)=O)=C1 TUUBOHWZSQXCSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC(O)=C1O GLDQAMYCGOIJDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UIAFKZKHHVMJGS-UHFFFAOYSA-N 2,4-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1O UIAFKZKHHVMJGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N gallic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 LNTHITQWFMADLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- YIBXWXOYFGZLRU-UHFFFAOYSA-N syringic aldehyde Natural products CC12CCC(C3(CCC(=O)C(C)(C)C3CC=3)C)C=3C1(C)CCC2C1COC(C)(C)C(O)C(O)C1 YIBXWXOYFGZLRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- -1 for example Chemical compound 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- YDBHVMTTYXWHLI-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tribromo-3-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=C(Br)C=C(Br)C(O)=C1Br YDBHVMTTYXWHLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYEMGAFJOZZIFP-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC(O)=C1 UYEMGAFJOZZIFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypentanoic acid Chemical compound CCC(O)CC(O)=O REKYPYSUBKSCAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybutyric acid Chemical compound OCCCC(O)=O SJZRECIVHVDYJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241000498271 Necator Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyhexanoic acid Chemical compound CCCC(O)CC(O)=O HPMGFDVTYHWBAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 108010054320 Lignin peroxidase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059896 Manganese peroxidase Proteins 0.000 description 1
- FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N N-Ethyl-N-nitrosourea Chemical compound CCN(N=O)C(N)=O FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N N-Methyl-N-nitrosourea Chemical compound O=NN(C)C(N)=O ZRKWMRDKSOPRRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589781 Pseudomonas oleovorans Species 0.000 description 1
- 241000736110 Sphingomonas paucimobilis Species 0.000 description 1
- 241001228709 Suruga Species 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000229 biodegradable polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000004622 biodegradable polyester Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004146 energy storage Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N methyl methanesulfonate Chemical compound COS(C)(=O)=O MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 238000012667 polymer degradation Methods 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 1
- 229910021654 trace metal Chemical class 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 150000005170 trihydroxybenzoic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Description
本発明は、微生物によるリグニン関連物質からのポリヒドロキシアルカン酸（以下、「PHA」とも称する）の生産方法に関する。
PHAは、生分解性ポリエステル型ポリマーであり、微生物によるその生産方法が多数報告されている。例えば、ラウリン酸含量の高い油脂からPHAをカプリアビダス(Cupriavidus)属細菌により生産する方法が、特許文献１に記載されている。また、グルコース資化能が付与されたカプリアビダス(Cupriavidus)属細菌によりPHAを生産する方法が、特許文献２に記載されている。さらに別の例として、酢酸を炭素源としてシュードモナス属細菌によりPHAを生産する方法が、特許文献３に記載されている。
地球温暖化の要因物質のひとつである二酸化炭素の発生を抑制するために、植物由来の糖や油を原料としたバイオプラスチック、バイオエタノールなどの生産が試みられている。一方、芳香族化合物であるリグニンは植物から大量に得られるが、物理的、化学的に安定な化合物であるため、ほとんど利用されていない。自然界においてリグニンは白色腐朽菌によりリグニン誘導体に分解され、その分解物は微生物細胞内で芳香族カルボン酸を経て、ピルビン酸とオキサロ酢酸またはコハク酸に変換される。ピルビン酸から誘導されるアセチル-コエンザイムA (補酵素A)は、天然の微生物の一部が栄養制限下で細胞内にエネルギー貯蔵物質として蓄積するPHAの前駆体の一つである。PHAは包装材料や医療分野への応用が期待されている熱可塑性、生分解性、生体適合性を有する高分子材料である。未利用原料であるリグニン関連物質を利用したPHAの微生物生産は、未利用なバイオマス資源の活用という点で重要であるが、これまで報告がない。
一方、芳香族環を含む化合物を含む培地中で微生物を培養することによりPHAを生産する方法として、特許文献４〜８に記載の方法が知られている。
PHAを生産する多数の微生物が知られているが、リグニン関連物質からのPHAの生産については知られていない。
それゆえ、本発明は、リグニン誘導体や、その代謝産物である芳香族カルボン酸などのリグニン関連物質を炭素源として用いて、微生物によりPHAを生産することを目的とする。
リグニン関連物質から有用なPHAを生産する技術が確立されるならば、製紙パルプ産業で廃棄される未利用資源の有効な活用になるはずである。
本発明は、このような観点から鋭意研究を行い、完成されたものである。
本発明は、このような観点から鋭意研究を行い、完成されたものである。
本発明は、要約すると、以下に示す特徴を含む。
(1) リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物を、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
(2) 前記リグニン誘導体が、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸又はその塩である、(1)に記載の方法。
(3) 前記ポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物が、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、シリング酸、又はその塩である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記微生物が、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) 前記カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、20万〜200万の分子量を有する、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリ（3-ヒドロキシ酪酸）である、(7)に記載の方法。
(1) リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物を、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
(2) 前記リグニン誘導体が、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸又はその塩である、(1)に記載の方法。
(3) 前記ポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物が、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸、4-ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、シリング酸、又はその塩である、(1)又は(2)に記載の方法。
(4) 前記微生物が、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物である、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5) 前記カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、20万〜200万の分子量を有する、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8) 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリ（3-ヒドロキシ酪酸）である、(7)に記載の方法。
本発明により、微生物的方法によって、未利用資源であるリグニン関連物質から、有用なPHAを生産することが可能になった。
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法に関するものであり、以下の特徴を有する。
本発明は、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法に関するものであり、以下の特徴を有する。
(1)上記微生物が、リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属し、かつ、リグニン誘導体又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からPHAを生産する能力を有する微生物である。
(2)培地中の炭素源として、図4に記載されるような、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含有する。
(2)培地中の炭素源として、図4に記載されるような、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含有する。
明細書の「リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する」という用語は、微生物がリグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物を炭素源として増殖する性質を有していることを意味している。
＜微生物＞
上記微生物は、上記(1)に示した性質をすべて満たすものであれば、本発明の方法で使用できる。微生物は、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する細菌であり、リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物を炭素源として含有する培地にて増殖性を示し、また、PHAを生成することを確認できる。好ましい微生物は、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）又はアルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）であり、後者の2つの菌種は、前者の菌種の旧分類の菌種名であるので、これらの3つの菌種は実質的に同一である。従って、本明細書においてカプリアビダス・ネカトールに言及する場合は、これらの旧分類の菌種も包含される。さらに具体的には、微生物は、例えば、Cupriavidus necator (ATCC 17699 / H16 / DSM 428 / Stanier 337)、Cupriavidus necator (ATCC 43291 / DSM 13513 / N-1)、Cupriavidus necator (NBRC 102504)などである。
上記微生物は、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物のいずれであってもよい。
上記微生物は、上記(1)に示した性質をすべて満たすものであれば、本発明の方法で使用できる。微生物は、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する細菌であり、リグニン誘導体及び/又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物を炭素源として含有する培地にて増殖性を示し、また、PHAを生成することを確認できる。好ましい微生物は、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）又はアルカリゲネス・ユートロファス（Alcaligenes eutrophus）であり、後者の2つの菌種は、前者の菌種の旧分類の菌種名であるので、これらの3つの菌種は実質的に同一である。従って、本明細書においてカプリアビダス・ネカトールに言及する場合は、これらの旧分類の菌種も包含される。さらに具体的には、微生物は、例えば、Cupriavidus necator (ATCC 17699 / H16 / DSM 428 / Stanier 337)、Cupriavidus necator (ATCC 43291 / DSM 13513 / N-1)、Cupriavidus necator (NBRC 102504)などである。
上記微生物は、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物のいずれであってもよい。
単離微生物は、種々の源（ソース）から分離された微生物である。そのような源（ソース）として土壌、河川、海洋、深海および植物を例示できる。上記のとおり、リグニン誘導体又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物を炭素源として含有する培地にて増殖性を示し、また、PHAを生成する微生物をスクリーニングすることができる。培養は、例えば、試験微生物を上記の物質を含有するMS培地等の培地に植菌し、30℃で、24〜72時間行ったのち、増殖性コロニーを分離し、NR寒天培地等の培地にて培養し単一コロニーを得る。さらに、単離されたコロニーが、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する細菌であることを、16S rDNA配列又は菌学的性質についてタイプストレインと比較するなどの方法により同定・確認する。その後、PHAの生成について、細菌の破砕物からクロロホルムなどの有機溶媒で抽出し、濾過後、濾液（必要により濃縮後）にヘキサン等の有機溶媒を加えてPHAを析出し、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、NMR、IRなどの分析手法を用いて同定する。
寄託微生物は、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する細菌の寄託物について、単離微生物について記載したのと同様の手法を用いて、上記(1)の性質を有する微生物を選抜することによって得ることができる。
変異微生物は、単離微生物、寄託微生物などの上記(1)の性質を有する微生物に対し、突然変異処理を施すことによって作製されうる上記(1)と同等の性質を有する微生物である。突然変異処理には、例えば化学変異原、例えばN- エチル-N-ニトロソウレア、N−メチル−N−ニトロソウレア、メタンスルホン酸メチル、ニトロソグアニジンなど、放射線、例えば紫外線、X線、γ線などによる処理が含まれる。微生物を化学変異原を添加した培地で培養するか、或いは、放射線の照射下で微生物を培養し、変異型微生物のコロニーを分離し、単離微生物について記載したのと同様の手法を用いて、上記(1)の性質について確認する。
組換え微生物は、例えばPHA合成酵素遺伝子が改変された微生物であり、例えば特開2013-9627号公報に記載されるような微生物である。その他、異種のPHA合成酵素遺伝子が導入された微生物、PHA合成に関連する酵素群を導入した組換え微生物なども挙げることができる。
＜炭素源を含む培地＞
上記(2)の性質は、培地中の炭素源が、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含有することである。
上記(2)の性質は、培地中の炭素源が、リグニン誘導体及びそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物からなる群から選択される少なくとも1つの物質を含有することである。
リグニン誘導体は、パルプの製造工程から廃棄されるリグニンを、リグニンペルオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどの酵素により分解して得ることができる。リグニン誘導体は、一般に、p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸、又はその塩である。
リグニン誘導体のポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物は、例えば、白色腐朽菌などの菌類においてリグニンが分解されてリグニン誘導体が生じ、各リグニン誘導体が代謝されて中間代謝物が生じ、さらに中間代謝物がピルビン酸・オキサロ酢酸・コハク酸に変換される経路における中間代謝物であり、リグニン誘導体及びピルビン酸・オキサロ酢酸・コハク酸は含まない。該中間代謝物は、上記リグニン誘導体に類似したベンゼン環を有する構造をもつことが好ましい。具体的には、図４のリグニン誘導体からピルビン酸・オキサロ酢酸・コハク酸に至る経路に示される化合物のうち、リグニン誘導体より下流、かつ、ピルビン酸・オキサロ酢酸・コハク酸より上流の化合物、例えば、2,5-ジヒドロキシ安息香酸(2,5-DHBA)、3,4-ジヒドロキシ安息香酸(3,4-DHBA)、3,4,5-トリヒドロキシ安息香酸(3,4,5-THBA)、4-ヒドロキシ安息香酸(4-HBA)、バニリン酸、シリング酸、又はその塩である。
リグニン誘導体やポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物（特に、芳香族カルボン酸）は、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムのエタノール溶液に溶解し、中和する。エタノールでなくとも芳香族カルボン酸と水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムが溶解する溶媒でも代用できる。溶媒を除去した後、凍結乾燥によりエタノール成分を除き、固形物として芳香族カルボン酸塩を得ることができる。
培地は、貧栄養培地が望ましい。培地には、上記の炭素源のほかに、窒素源として無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素などを含むことができる。このほかに、培地には、無機塩類や微量金属塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、コバルト、銅、亜鉛などの塩が含まれる。必要であれば、有機窒素源を含有させることもできる。貧栄養培地の例は、MS培地である。
＜PHAの微生物生産＞
上記の微生物を、上記炭素源を含む上記培地にて培養する。培養は、好気的条件で行い、通気撹拌可能な発酵槽を使用することができる。培養規模に応じて発酵槽のサイズを、1KL〜5KL又はそれ以上とすることができる。連続的に又は間欠的に炭素源や他の栄養源を供給しながら培養を行うこともできる。培地中の炭素源濃度は、非限定的に、約0.5g/L〜約2.0g/Lの範囲に維持することが好ましい。温度、pH、炭素源濃度、通気量、撹拌速度などの条件を制御しながら、培養を行う。
上記の微生物を、上記炭素源を含む上記培地にて培養する。培養は、好気的条件で行い、通気撹拌可能な発酵槽を使用することができる。培養規模に応じて発酵槽のサイズを、1KL〜5KL又はそれ以上とすることができる。連続的に又は間欠的に炭素源や他の栄養源を供給しながら培養を行うこともできる。培地中の炭素源濃度は、非限定的に、約0.5g/L〜約2.0g/Lの範囲に維持することが好ましい。温度、pH、炭素源濃度、通気量、撹拌速度などの条件を制御しながら、培養を行う。
温度は、約25℃〜約40℃であるが、微生物が増殖し、PHAを生産することができる限り、この範囲に限定されないものとする。
pHは、通常、6〜8、好ましくは6.5〜7に維持される。
培地中の炭素源濃度は、約0.5g/L〜約2.0g/Lの範囲に維持することが好ましい。
通気量は、例えば、1 L/分〜3L/分、好ましくは1.5 L/分〜2.5L/分である。
撹拌速度は、例えば300rpm〜700rpmである。
培養日数は、1日〜7日であるが、この範囲に限定されない。
培地中の炭素源濃度は、約0.5g/L〜約2.0g/Lの範囲に維持することが好ましい。
通気量は、例えば、1 L/分〜3L/分、好ましくは1.5 L/分〜2.5L/分である。
撹拌速度は、例えば300rpm〜700rpmである。
培養日数は、1日〜7日であるが、この範囲に限定されない。
＜PHAの回収＞
微生物菌体に蓄積されたPHAは、公知の方法によって回収することができる（特開2013-9627号公報）。例えば、培養液から遠心分離機等の分離手段を用いて菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノール、ヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収することができる。
微生物菌体に蓄積されたPHAは、公知の方法によって回収することができる（特開2013-9627号公報）。例えば、培養液から遠心分離機等の分離手段を用いて菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノール、ヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収することができる。
上記の手法により回収されたPHAでは、分子量が、約20万〜約200万又はそれ以上、例えば約30万〜約100万を有する。
このPHAを構成するモノマー単位は3-ヒドロキシアルカン酸であって、具体的には3-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシ吉草酸、3-ヒドロキシヘキサン酸、それらの混合、などである。これら3-ヒドロキシアルカン酸が単重合もしくは共重合することにより、ポリマー分子が形成される。3-ヒドロキシ酪酸のホモポリマーが、ポリ(3-ヒドロキシ酪酸)（「P(3HB)」とも称する。）である。
後述の実施例で使用した微生物からは、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含むPHAが生産されうる。
後述の実施例で使用した微生物からは、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含むPHAが生産されうる。
以下の実施例で、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、それらの実施例に限定されないものとする。
［実施例１］
＜微生物の選択＞
PHA蓄積性微生物、すなわちRalstonia eutropha H16 (現命名、Cupriavidus necator, JCM 20644, ATCC 17699)、Delftia acidovorans DS-17 (JCM 10181)、Pseudomonas putida (JCM 13063T)、Pseudomonas aeruginosa (JCM 14847T)、Sphingomonas paucimobilis (JCM 7516T)、Bacillus megaterium (JCM 2506T)、Ralstonia eutropha PHB-4(DSM 541;H16のPHA陰性変異株)、Ralstonia eutropha PHB-4phaCAc(PHB-4の形質転換体;J-A Chuah et al., Polymer Degradation and Stability 98(1): 331-338 (2013))、Ralstonia eutropha PHB-4E11/S12、Ralstonia eutropha 11599(Techno Suruga Labotaroty Co., Ltd. (静岡、日本)から恵与された。) 、Pseudomonas putida GPo1(旧命名：Pseudomonas oleovorans GPo1)（ATCC 29347)及びVibrio sp. KN01(Hizushi Beach(沖縄、日本)の海水から単離された。)を、単一炭素源として10gのリグニン誘導体（p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸及びシナピン酸）及びポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物（バニリン酸、シナピン酸、シリング酸、4-HBA、2,5-DHBA、3,4-DHBA及び3,4,5-THBA）、それらの類似化合物（サリチル酸、3-HBA、2,3-DHBA、2,4-DHBA、2,6-DHBA、3,5-DHBA、2,3,4-THBA及び2,4,6-THBA）、その他の炭素源（グルコン酸、オクタン酸、テレフタル酸）(それぞれ、1g / 100 mL)、PHAの蓄積を判別する0.5mgの染色試薬ナイルレッド (200 mg / L)、9gのNa2HPO4・12H2O、1.5gのKH2PO4、0.5gのNH4Cl、0.2gのMgSO4・7H2O、1mLの微量元素養液(9.7gのFeCl3、7.8gのCaCl2、0.218gのCoCl2・6H2O、0.156gのCuSO4・5H2O、0.118gのNiCl3・6H2O及び0.105gのCrCl3・6H2Oを1Lの0.1M HClに溶解した溶液)、及び1.5gのアガーを1Lの蒸留水中に含むMineral-salt (MS) 寒天培地に植菌した。72時間後、コロニーのサイズ（直径）を測定することにより微生物の増殖を評価した。その結果、Ralstonia eutropha H16株(ATCC 17699)とPseudomonas putida 13063株(JCM 13063)が増殖性を示した（図１）。
＜微生物の選択＞
PHA蓄積性微生物、すなわちRalstonia eutropha H16 (現命名、Cupriavidus necator, JCM 20644, ATCC 17699)、Delftia acidovorans DS-17 (JCM 10181)、Pseudomonas putida (JCM 13063T)、Pseudomonas aeruginosa (JCM 14847T)、Sphingomonas paucimobilis (JCM 7516T)、Bacillus megaterium (JCM 2506T)、Ralstonia eutropha PHB-4(DSM 541;H16のPHA陰性変異株)、Ralstonia eutropha PHB-4phaCAc(PHB-4の形質転換体;J-A Chuah et al., Polymer Degradation and Stability 98(1): 331-338 (2013))、Ralstonia eutropha PHB-4E11/S12、Ralstonia eutropha 11599(Techno Suruga Labotaroty Co., Ltd. (静岡、日本)から恵与された。) 、Pseudomonas putida GPo1(旧命名：Pseudomonas oleovorans GPo1)（ATCC 29347)及びVibrio sp. KN01(Hizushi Beach(沖縄、日本)の海水から単離された。)を、単一炭素源として10gのリグニン誘導体（p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸及びシナピン酸）及びポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物（バニリン酸、シナピン酸、シリング酸、4-HBA、2,5-DHBA、3,4-DHBA及び3,4,5-THBA）、それらの類似化合物（サリチル酸、3-HBA、2,3-DHBA、2,4-DHBA、2,6-DHBA、3,5-DHBA、2,3,4-THBA及び2,4,6-THBA）、その他の炭素源（グルコン酸、オクタン酸、テレフタル酸）(それぞれ、1g / 100 mL)、PHAの蓄積を判別する0.5mgの染色試薬ナイルレッド (200 mg / L)、9gのNa2HPO4・12H2O、1.5gのKH2PO4、0.5gのNH4Cl、0.2gのMgSO4・7H2O、1mLの微量元素養液(9.7gのFeCl3、7.8gのCaCl2、0.218gのCoCl2・6H2O、0.156gのCuSO4・5H2O、0.118gのNiCl3・6H2O及び0.105gのCrCl3・6H2Oを1Lの0.1M HClに溶解した溶液)、及び1.5gのアガーを1Lの蒸留水中に含むMineral-salt (MS) 寒天培地に植菌した。72時間後、コロニーのサイズ（直径）を測定することにより微生物の増殖を評価した。その結果、Ralstonia eutropha H16株(ATCC 17699)とPseudomonas putida 13063株(JCM 13063)が増殖性を示した（図１）。
［実施例２］
＜PHAの生産＞
プレートアッセイで良好な増殖を示したRalstonia eutropha H16株(ATCC 17699)とPseudomonas putida 13063株(JCM 13063)について、100 mLスケールで培養した。微生物の増殖は乾燥菌体重量にて評価し、PHAの蓄積量はクロロホルムとメタノールを用いて抽出したPHAの質量により評価した。PHAの分子量と構造はゲルサイズ排除クロマトグラフィー (SEC)(RI-2031, PU-2086, AS-2055, CO-2056; JASCO,日本)、核磁気共鳴法 (1H-NMR)(JNM-Excalibur 270; JEOL, Ltd.,日本) を用いて解析した。分子量は、ポリスチレン分子量標準(1.32x103, 3.25x103, 1.01x104, 2.85x104, 6.60x104, 1.56x105, 4.60x105, 1.07x106, 3.15x106)と比較して推定した。
＜PHAの生産＞
プレートアッセイで良好な増殖を示したRalstonia eutropha H16株(ATCC 17699)とPseudomonas putida 13063株(JCM 13063)について、100 mLスケールで培養した。微生物の増殖は乾燥菌体重量にて評価し、PHAの蓄積量はクロロホルムとメタノールを用いて抽出したPHAの質量により評価した。PHAの分子量と構造はゲルサイズ排除クロマトグラフィー (SEC)(RI-2031, PU-2086, AS-2055, CO-2056; JASCO,日本)、核磁気共鳴法 (1H-NMR)(JNM-Excalibur 270; JEOL, Ltd.,日本) を用いて解析した。分子量は、ポリスチレン分子量標準(1.32x103, 3.25x103, 1.01x104, 2.85x104, 6.60x104, 1.56x105, 4.60x105, 1.07x106, 3.15x106)と比較して推定した。
リグニン誘導体、ポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物、等を単一炭素源とした寒天培地を用いてPHA蓄積微生物を培養した結果、P. putida 13063、P. putida GPo1及びP. aeruginosaはR. eutropha H16、Delftia acidovorans、Bacillus megateriumなどと比較して幅広い炭素源を資化することが明らかとなった（図1）。
また、R. eutropha H16は2,5-dihydroxybenzoic acid (2,5-DHBA)と3,4-DHBAを単一炭素源とした場合、PHAの蓄積の可能性を示す赤色のコロニーを形成した（図2）。そこで、幅広い炭素源に資化性を示したP. putida 13063及び赤色コロニーを形成したR. eutropha H16に着目し、100mLスケールで培養し、PHAの蓄積について詳細に解析した。
100mLスケールで培養した結果、P. putida 13063とR.eutropha H16は、リグニン誘導体 (p-クマル酸、カフェ酸、フェルラ酸、シナピン酸)を単一炭素源とするとほとんど増殖しなかった。一方、バニリン酸、4-ヒドロキシ安息香酸(4-HBA)、3,4-ジヒドロキシ安息香酸(3,4-DHBA)を炭素源としてP. putida 13063を培養した結果、乾燥菌体重量はそれぞれ2.8、3.3、3.0 g/Lであったが、PHAの蓄積は検出できなかった。R.eutropha H16を芳香族カルボン酸である2,5-DHBAを炭素源として培養したところ、ポジティブコントロールの炭素源であるグルコン酸と同程度の乾燥菌体重量 (5.2 g / L)、PHA含有量 (26 %) を示した (表1)。また、3,4-DHBAを炭素源とした場合もP(3HB)を蓄積し（図3）、乾燥菌体重量とPHA含有率は3.8 g / L、13 %であった。芳香族カルボン酸から得られたP(3HB)の数平均分子量 (72万、PDI3.4(2,5-DHBAの場合)、36万、PDI4.4(3,4-DHBAの場合)) はグルコン酸から合成されるP(3HB)の分子量 (120万)と比較して低分子量であった。
本発明は、微生物によるリグニン関連物質からのポリヒドロキシアルカン酸(PHA)の生産方法を提供するため、未利用資源の有効利用と、有用物質であるPHAの生産との両面から見ても、産業上の利用性を有する。
Claims (6)
- リグニン誘導体及び／又はそのポリヒドロキシアルカン酸生合成中間代謝物に資化性を有する、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ラルストニア（Ralstonia）属又はアルカリゲネス（Alcaligenes）属に属する微生物を、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つの物質を炭素源として含有する培地にて培養し、該微生物菌体からポリヒドロキシアルカン酸を回収することを含む、微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法。
- 前記微生物が、単離微生物、寄託微生物、変異微生物又は組換え微生物である、請求項１に記載の方法。
- 前記カプリアビダス属微生物が、カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、20万〜200万の分子量を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、3-ヒドロキシ酪酸モノマー単位を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が、ポリ（3-ヒドロキシ酪酸）である、請求項５に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013216465A JP6274494B2 (ja) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013216465A JP6274494B2 (ja) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015077103A JP2015077103A (ja) | 2015-04-23 |
| JP6274494B2 true JP6274494B2 (ja) | 2018-02-07 |
Family
ID=53009159
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013216465A Active JP6274494B2 (ja) | 2013-10-17 | 2013-10-17 | 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6274494B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6799290B2 (ja) * | 2015-11-05 | 2020-12-16 | 日本乳化剤株式会社 | アルキレングリコールモノアルキルエーテル類を分解することができる微生物及びその使用 |
| WO2019142717A1 (ja) * | 2018-01-16 | 2019-07-25 | 株式会社カネカ | 変異型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素、その遺伝子および形質転換体、並びに、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 |
| JP7063513B2 (ja) * | 2019-04-26 | 2022-05-09 | 株式会社 フューエンス | ポリヒドロキシアルカン酸及びその製造方法 |
| CN114381415B (zh) | 2022-03-22 | 2022-11-15 | 深圳蓝晶生物科技有限公司 | 高产pha的基因重组菌及其构建方法 |
-
2013
- 2013-10-17 JP JP2013216465A patent/JP6274494B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2015077103A (ja) | 2015-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bhuwal et al. | Isolation and screening of polyhydroxyalkanoates producing bacteria from pulp, paper, and cardboard industry wastes | |
| Quillaguaman et al. | Poly (β-hydroxybutyrate) production by a moderate halophile, Halomonas boliviensis LC1 | |
| Silva et al. | Poly-3-hydroxybutyrate (P3HB) production by bacteria from xylose, glucose and sugarcane bagasse hydrolysate | |
| Salgaonkar et al. | Biosynthesis of poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Halogeometricum borinquense strain E3 | |
| Rathi et al. | Polyhydroxyalkanoate biosynthesis and simplified polymer recovery by a novel moderately halophilic bacterium isolated from hypersaline microbial mats | |
| JP6274494B2 (ja) | 微生物によるポリヒドロキシアルカン酸の生産方法 | |
| Yamaguchi et al. | Production of poly (3-hydroyxybutylate) by a novel alginolytic bacterium Hydrogenophaga sp. strain UMI-18 using alginate as a sole carbon source | |
| Mayeli et al. | Production of polyhydroxybutyrate by Bacillus axaraqunsis BIPC01 using petrochemical wastewater as carbon source | |
| Tyagi et al. | Production of polyhydroxybutyrate (PHB) by Parapedobacter sp. ISTM3 isolated from Mawsmai cave utilizing molasses as carbon source | |
| Zhou et al. | Polyhydroxyalkanoates (PHAs) synthesis and degradation by microbes and applications towards a circular economy | |
| Akhlaq et al. | Polyhydroxybutyrate biosynthesis from different waste materials, degradation, and analytic methods: A short review | |
| Jeyaseelan et al. | Production of polyhydroxyalkanoate (PHA) using hydrolyzed grass and Syzygium cumini seed as low cost substrates | |
| Murugan et al. | Production of P (3HB‐co‐3HHx) with Controlled Compositions by Recombinant Cupriavidus necator Re2058/pCB113 from Renewable Resources | |
| Sathianachiyar et al. | Biopolymer production by bacterial species using glycerol, a byproduct of biodiesel | |
| Byrom | The synthesis and biodegradation of polyhydroxyalkanoates from bacteria | |
| Muthazhagan et al. | Production and FTIR analysis of bio-polymer by Bacillus sp. isolated from vellar estuary sediment | |
| Afghan et al. | Isolation and screening of polyhydroxyalkanoates (PHA) producing bacteria utilizing agricultural waste | |
| Patel et al. | Detection & characterization of PHB (polyhydroxybutyrate) Producers halophilic bacteria isolated from marine water sample of Valsad District | |
| KR20230128167A (ko) | 폴리하이드록시알카노에이트를 생산하는 새우젓 유래 신규 균주 할로모나스 쉬림파 ibth01 | |
| Malhotra et al. | Bio-based bioplastics: Current and future developments | |
| Chobchuenchom et al. | Production of medium chain length polyhydroxyalkanoates by Pseudomonas putida ATCC47054 using glycerol and sodium octanoate as substrates | |
| El-Nahrawy et al. | Production of Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) by Azotobacter sp. Isolated from Different Sources | |
| JP4649593B2 (ja) | ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法 | |
| Krishnaswamy | Isolation and screening of Phb producing halotolerant bacterial strains from a saline environment | |
| Saravanan et al. | Valorization of custard apple (Annona squamosa) waste through polyhydroxybutyrate (PHB) production by Bacillus megaterium MAPCS4: optimization, characterization, and biodegradation studies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160826 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160826 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170630 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170725 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170915 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171205 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171227 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6274494 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |