CN100491537C - 微生物好氧发酵生产1,3-丙二醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种由微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，属于生物化工技术领域。先将种子液加入含甘油浓度为20-50g/l的工业甘油或甘油发酵液的初始发酵培养基，在发酵温度30～40℃条件下利用产PDO的克雷伯氏肺炎杆菌或克雷伯氏产酸杆菌发酵生产PDO。在发酵的过程中通入0.2-1.0vvm的空气，搅拌转速50～250rpm。发酵开始3～5小时后流加500-1000g/l甘油和3-5M氢氧化钠，在发酵3～20小时维持甘油浓度5-10g/l，20-40h小时甘油浓度维持在20-30g/l，40小时停止流加至发酵结束。本发明的优点在于：大大降低了固定设备的投资及能耗，提高了PDO终浓度、生产强度及菌体生物量。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法。
背景技术
1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业。1，3-丙二醇最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，显示了比以1，2-丙二醇、丁二醇、乙二醇为单体合成的聚合物更优良的性能。目前全球每年消费数千万吨聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，而PTT的化学稳定性、生物可降解性等与PET相当，但耐污染性、韧性和回弹性及抗紫外性能等更优越。此外PTT纤维还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点，可在地毯领域与尼龙竞争。它还可用于具有优良性能的无纺布、工程塑料、服装、家庭装饰、垫衬料、织物等方面。PTT被评为美国98年六大石化新产品之一，被认为将是PET的升级产品。
PTT的优越性能及市场潜力早在50年前就被人们所认识，只因原料1，3-丙二醇生产技术难度大、成本高而导致PTT很难大规模工业化生产，迄今为止，只有Dupont和Shell两家跨国公司采用传统的化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产仅供它们合成PTT自用的1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源，且环氧乙烷和另一路线的中间产物丙烯醛分别是易燃易爆或剧毒的危险品。由于发酵法生产1，3-丙二醇选择性高，操作条件温和，因此近年来受到特别的重视。
目前，由甘油发酵生产1，3-丙二醇主要有以下几条途径：
1)采用肠道细菌厌氧条件下将甘油歧化为1，3-丙二醇(USP5254467，EP0373230 A1)
2)克雷伯氏杆菌等厌氧菌在厌氧条件下发酵生产1，3-丙二醇(Ruch et al.Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes.J Bacteriol.1974，119(1)：50-56；Streekstra et al.Overflow metabolism during anaericgrowth of Klebsiella pneumoniae NCTC418 on glycerol and dihydroxyacetonein chemostat culture.Arch Microbiol.1987，147：268-275；Zeng et al.Pathway analysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniae：Regulation of reducing equivalent balance and product formation.EnzymeMicrobiol Technol.1993，15：770-779.)
3)采用克雷伯氏杆菌在微氧条件下发酵生产1，3-丙二醇(王剑锋等，克雷伯氏菌微氧发酵生产1，3-丙二醇的研究，现代化工，2001，21(5)：28—31。修志龙等，一种微生物微氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，中国专利公开号：CN1348007)
4)采用克雷伯氏杆菌在厌氧条件下发酵产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇(Biebl et al.Fermentation of glycerol to 1，3-propanediol and 2，3-butanediol.ApplMicrobiol Biotechnol，1998，50：24-29)。
5)微生物前期厌氧后期有氧两段发酵法由甘油生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇(专利公开号：CN 1570123A)。
目前上述国内外利用微生物发酵生产PDO普遍是在厌氧条件下进行，这需要制氮设备维持发酵的厌氧环境，如果产业化，必将大大增加固定设备的投资及能耗。方法3提出了微氧发酵从一定程度上提高了PDO发酵的生产强度，但最终PDO浓度仍较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，解决了固定设备的投资及能耗高的问题，并提高了最终PDO浓度。
本发明采用微生物好氧发酵，并在发酵过程中不同时期控制不同甘油浓度的新工艺。具体步骤是将种子液加入含甘油浓度为20—50g/l的工业甘油或甘油发酵液的初始发酵培养基，在发酵温度30～40℃条件下利用产PDO的克雷伯氏肺炎杆菌或克雷伯氏产酸杆菌发酵生产PDO。在发酵的过程中通入0.2-1.0vvm的空气，搅拌转速50～250rpm。发酵开始3～5小时后流加500—1000g/l甘油和3—5M氢氧化钠，在发酵3～20小时维持甘油浓度5—10g/l，20—40h小时甘油浓度维持在20—30g/l，40h后停止流加至发酵结束。发酵结束时通过常规的脱盐、蒸馏和真空精馏步骤将1，3-丙二醇分离、提纯，制备产品。
本发明的优点在于：采用好氧发酵新工艺，将通氮气的厌氧条件改为通空气的好氧条件，大大降低了固定设备的投资及能耗，降低了对设备的要求，在发酵过程中不同时期控制不同的甘油浓度，提高了PDO终浓度、生产强度及菌体生物量。
具体实施方式
本发明提供一种微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：所述生产1，3-丙二醇的方法是采用微生物好氧发酵，并在发酵过程中不同时期控制不同甘油浓度的新工艺。具体实施方式是将种子液加入含甘油浓度为20—50g/l的工业甘油或甘油发酵液的初始发酵培养基，在发酵温度30～40℃条件下利用产PDO的克雷伯氏肺炎杆菌或克雷伯氏产酸杆菌发酵生产PDO。在发酵的过程中通入0.2-1.0vvm的空气，发酵开始3～5小时后流加500—1000g/l甘油和3—5M氢氧化钠，在发酵过程中3～20h维持甘油浓度不高于10g/l，20h—40h甘油浓度维持在30g/l，40h停止流加至发酵结束。发酵结束时通过常规的脱盐、蒸馏和真空精馏步骤将1，3-丙二醇分离、提纯，制备产品。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。
实例1：
(1)菌种：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)
(2)培养基：
(A)固体培养基(g/L)
LB培养基：酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 5，琼脂15，调节pH7.0。用于克雷伯氏肺炎杆菌菌种的短期保藏及活化。
(B)种子培养基及发酵培养基
*铁溶液的配制：每升水中加入FeSO4·H2O 5.0g，37％的浓盐酸4ml。
微量元素溶液的组成
(3)培养方式：
甘油管保藏的菌种转接至LB斜面，37℃下活化12小时。种子培养采用有氧培养，使用500ml三角瓶，装液量100ml。培养温度37℃，摇床转速120rpm。
发酵培养使用5L发酵罐，装液量4L，培养温度37℃，pH值6.8。发酵过程中用含工业甘油浓度为50g/l的初始发酵培养基，发酵开始3.5小时后流加800g/l甘油水溶液，发酵3.5～20h，甘油浓度维持在10g/l，其后维持在30g/l。发酵过程中通入空气，通气量0.5vvm，发酵罐搅拌转速150rpm。
(4)发酵结果如下：
发酵27h，1，3—丙二醇浓度44.7g/l，2，3—丁二醇4.7g/l，乳酸3.8g/l，乙酸3.5g/l。1，3—丙二醇生产强度1.7g/(lh)。发酵66小时，1，3—丙二醇浓度66.3g/l，2，3—丁二醇7.9g/l，乳酸31.9g/l，乙酸1.5g/l。1，3—丙二醇生产强度1.0g/(lh)。
实例2：
(1)菌种：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)
(2)培养基同实例1
(3)培养方式同实例1，但发酵温度为40℃。
(4)发酵结果如下：
发酵25h，1，3—丙二醇浓度35g/l，乳酸10g/l。1，3—丙二醇生产强度1.4g/(lh)。发酵48小时，1，3—丙二醇浓度44g/l，乳酸23g/l。1，3—丙二醇生产强度0.92g/(lh)。
实例3：
(1)菌种：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)
(2)培养基同实例1
(3)培养方式同实例1，但搅拌转速为250rpm。
(4)发酵结果：
发酵48h，1，3—丙二醇浓度56.5g/l，2，3—丁二醇7.4g/l，乳酸40.7g/l，乙酸1.8g/l。1，3—丙二醇生产强度1.2g/(lh)。发酵68小时，1，3—丙二醇浓度60.5g/l，2，3—丁二醇7.7g/l，乳酸53.4g/l，乙酸2g/l。1，3—丙二醇生产强度0.89g/(lh)。
实例4：
(1)菌种：克雷伯氏产酸杆菌(Klebsiella oxytoca)
(2)培养基同实例1
(3)培养方式同实例1
(4)发酵结果：
发酵32小时，1，3—丙二醇浓度44.3g/l，2，3—丁二醇11.3g/l，乳酸7.1g/l，乙酸2g/l。1，3—丙二醇生产强度1.4g/(lh)。发酵58小时，1，3—丙二醇浓度55.6g/l，2，3—丁二醇16.1g/l，乳酸10.3g/l，乙酸2.5g/l。1，3—丙二醇生产强度0.96g/(lh)。
Claims (1)
1一种微生物好氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，其特征在于：采用微生物好氧发酵，并在发酵过程中不同时期控制不同甘油浓度；具体步骤为：
a、将种子液加入含甘油浓度为20—50g/l的初始发酵培养基，在发酵温度30～40℃条件下利用产1，3-丙二醇的克雷伯氏肺炎杆菌或克雷伯氏产酸杆菌发酵生产1，3-丙二醇；
b、在发酵的过程中通入0.2-1.0vvm的空气，搅拌转速50～250rpm，发酵开始3～5小时后流加浓度为500—1000g/l甘油和3—5M氢氧化钠，在发酵3～20小时维持甘油浓度5—10g/l，20—40小时甘油浓度维持在20—30g/l，40小时停止流加至发酵结束；
c、发酵结束时通过脱盐、蒸馏和真空精馏步骤将1，3-丙二醇分离、提纯，制备成产品。
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