CN1092108A - 微生物发酵正烷烃生产长链α,W-二羧酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物发酵生产长链α,
W-二羧酸的方法,特别是高产十五碳二羧酸(DC15)
的方法。它包括用能够在以C11—C17各种正烷烃或
混合正烷烃为基质的培养基中形成和积累与基质链
长相同的单一长链二羧酸或混合长链二羧酸,特别是
在以正十五烷(nC15)为基质的培养基中形成和积累
DC15的热带假丝酵母(Candida tropicalis)
NP-6-126进行发酵,然后从发酵液中回收所形成的
二羧酸。
Description
本发明涉及微生物发酵正烷烃生产长链α,W-二羧酸,尤其是发酵正十五烷,高产十五碳二羧酸的方法。
长链二羧酸是合成香料,尼成工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂等的重要原料。十二个碳以上的长链二羧酸,自然界中不存在,化工上也还没有经济可行的合成方法,因此利用微生物特异的氧化能力,在常温常压下,转化石油中的正烷烃,生产长链二羧酸早已引起科学家们的重视和深入研究。
十五碳二羧酸是合成名贵香料环十五酮和麝香酮(即3-甲基-环十五酮)的重要原料,后者是天然麝香的主要成分之一。以人工合成的麝香酮代替稀罕难得的天然麝香,配制多种中成药,临床应用试验表明,疗效与天然麝香一样显著。
正十五烷也是微生物容易同化的一种烷烃,因此形成和积累十五碳二羧酸,特别是高产十五碳二羧酸比较困难。
在专利文献中,虽有有关利用微生物从正烷烃发酵生产长链二羧酸的方法,但还没有有关从正十五烷发酵生产十五碳二羧酸,特别是高产十五碳二羧酸的方法。在US4339536中,只有生产十二碳和十三碳二羧酸的实施例,而且产酸水平不高,只达到45g/L;而在US4624920中,只有在50ml和500ml摇瓶生产十四碳和十六碳二羧酸的实施例,且产酸水平太低,每升发酵液只有3mg;申请号为87105445和89102548的中国专利申请,主要是有关生产十六碳和十七碳二羧酸的方法,在16L罐上,产酸量分别为120g/L和133g/L。
日本植树南海男等人报道过用一株热带假丝酵母突变株M2030从正十五烷生产十五碳二羧酸,在3升罐上,产酸达到90g/L左右;上海沈永强等人报道过用一株热带假丝酵母N-15的高浓度静止细胞(菌浓为15×108个/毫升)转化正十五烷为十五碳二羧酸时达到109g/L,(《植物生理学报》1980.Vol.6,No:1)。但实验室发酵试验时,发酵8天,DC15的产量只达到77.2g/L。其他有关发酵生产十五碳二羧酸的报道都只有40-50g/L。因此用微生物发酵高产出地生产DC15是一个仍需解决的问题,本发明的目的是提供一种生产C11-C17单一长链二羧酸和混合长链二羧酸的方法,特别是高产出地生产DC15的方法。
本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)NP-6-126,是以一株氧化正烷烃生产混合二羧酸的热带假丝酵母(参见《微生物学报》20(1):88-93,1980)为出发菌株,通过亚硝酸和紫外线的多次反复诱变筛选培育出来的,能从C11-C17的各种单一正烷烃和混合正烷烃,尤其是正十五烷,高产出地生产相应链长的二羧酸。热带假丝酵母NP-6-126(以下简称NP-6-126)保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC NO.0206。
NP-6-126的生理特性如下:
一、糖类的发酵:葡萄糖+,半乳糖+,蔗糖+,麦芽糖+,乳糖-。
二、同化,葡萄糖+,半乳糖+,山梨糖-,蔗糖+,麦芽糖+,纤维二糖+,海藻糖+,乳糖-,密二糖-,棉子糖-,松三糖+,菊芋糖-,可溶性淀粉+,木糖+,L-阿戊糖+,D-阿戊糖-,核糖-,鼠李糖-,α-甲基葡萄糖苷+,甘油+,乙醇+,赤藓醇-,甘露醇+,肌醇-,核糖醇+,半乳糖醇-,葡萄糖醇+,柠檬酸钠-,丁二酸钠+,乳酸钙-。
三、生长素的需要:生物素++,维生素B1++,维生素B2+,维生素B6+,维生素B12+,叶酸+,烟酸+,泛酸十,肌醇十,对氨基苯甲酸十。
四、其它:硝酸盐-,冻化牛奶-,熊果酸分解-,凝固牛级-,油脂酶-。
形态特征:奶油白色,皱褶型,菌落为蛋糕状和桃酥状。
培养特征:
在麦芽汁液体培养基中培养时,假菌丝多而长;在烷烃种子培养基中培养时,有一定数量的短假菌丝;而在发酵培养基中发酵时,大部分是单个椭园细胞。
本发明的种子培养基:(1)、10个巴林糖度的麦芽汗加2%琼脂制成的固体斜面;(2)、10个巴林的麦芽汁液体培养基;(3)烷烃种子培养基包含:KH2PO46-12g/L,玉米浆3-8g/L,酵母膏3-8g/L,蔗糖3-8g/L,尿素3-6g/L,重蜡或正十五烷40-70ml/L,自来水配制,自然pH。
培养种子的过程为:取一接种环NP-6-126酵母菌体,涂布在麦芽汁固体斜面上(15×180试管,每支装6-7ml培养基,放成斜面),于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的NP-6-126菌种全部刮入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中,于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时,作为摇瓶发酵种子或者取两支上述培养好的NP-6-126菌种全部刮入装有500ml培养基的5000ml三角瓶中,于180转/分旋转摇床上28-30℃培养44-48小时,作为一级种子罐的种子。
用本发明的NP-6-126菌株生产长链二羧酸,特别是十五碳二羧酸的具体方法是:把发酵种子接入pH5.5-9.0,最好为6.5-7.5的含有15-45%(V/V)的C11-C19的正烷烃和85-55%(v/v)发酵培养基的混合液中。发酵培养基的组成为:碱金属磷酸盐6-14g/L,最好为7-10g/L,氯化钠0.5-2.0g/L、酵母膏1-6g/L,最好为3-5g/L,玉米浆0.5-2g/L,尿素0.5-2.5g/L,最好为1.0-2.0g/L,硝酸盐5-15g/L,最好为6-12g/L,二甲基亚砜10-20ml,消泡剂400-1200ppm以及一些其他公知的营养源,在pH6.5-7.5下将上述混合物在25-35℃,最好在27-31℃通气发酵48-170小时,每隔6-8小时用NaOH溶液调一次pH值,pH值控制在7.5-8.5之间。然后将产生的二羧酸从发酵液中分离出来。在发酵开始时,混合液中正烷烃含量为10-20%(v/v),以后在适当时间补加正烷烃,使发酵液中正烷烃浓度始终≥5%(v/v)为准。碱金属磷酸盐可从KH2PO4、NaH2PO4,K2HPO4和Na2HPO4中选一种。硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。
发酵结束后,加入适量的水,加碱至pH10-12,加热至85-90℃,进行破乳分层,上层为残油,回收再用,放出中间清液,下层菌体层再处理一次或压滤或离心,合并清液,加入适量活性炭,在85-90℃脱色30分钟,除去活性炭后,脱色液加热至60-70℃,加HCl或H2SO4至pH4-5进行酸化结晶,冷却至30℃后,压滤,用空气吹干,60℃烘干,得白色十五碳二羧酸结晶。
用本发明的NP-6-126菌株和发酵方法,可生产C11-C19的各种单一和混合二羧酸。其中在2.5吨罐上,从正十五烷发酵生产十五碳二羧酸,发酵6天,产酸量高达170-180g/L,后处理总收率达到80%,纯度达到96%左右。
实例一
(1)、取一接种环NP-6-126菌种,涂布在15×180大试管麦芽汁固体斜面上,30℃培养两天。
(2)、取上述菌种一支,接入装有25ml烷烃种子培养基的250ml三角瓶中于30℃在220转/分的旋转摇床上培养48小时。烷烃种子培养基中KH2PO48g/l,酵母膏5g/l,玉米浆3g/l,蔗糖5g/l,尿素3g/l,重蜡50ml/l,自来水配制,pH5.0。
(3)、在装有15ml发酵培养基的500ml三角瓶中,接入3.5ml上述种子液,在200转/分旋转摇床上发酵4天,每24小时用NaOH调一次pH至7.5-8.0。发酵培养基含KH2PO48g/l,酵母膏2g/l,玉米浆1g/l,氯化钠1.5g/l,尿素1g/l,正十五烷200ml/l,泡敌500ppm,KNO36g/l,自来水配制,pH7.5,在110℃下灭菌30分钟。发酵结束后,用HCl调pH至3,用100ml乙醚提取,除去乙醚,得白色结晶,用标准NaOH溶液滴定,计算二羧酸含量。结果DC11产量为53.6g/l,经气相色谱分析,DC11纯度为98.11%。
实例2
按照实例1的方法,只是正烷烃用nC15,结果DC15的产量为73.5g/l,纯度为96.31%。
实例3
按照实例1的方法,只是正烷烃用nC17,结果DC17的产量为53.9g/l,纯度为98.2%。
实例4
种子培养基和培养方法同实例1,发酵培养基为KH2PO48g/l,NaCl lg/L,酵母膏2g/l,玉米浆1g/L,KNO39g/l,二甲基亚砜6ml/l,泡敌600ppm,尿素1.2g/L,正十五烷200ml/l,自来水配制,pH7.5。把1.5L培养两天,镜检无杂菌的NP-6-126菌株种液接入装有8L发酵培养基,经121℃灭菌30分钟的16L自动控制罐中,在29℃,800转/分,罐压1Kg/cm2,通气量1∶1,24小时后pH控制在7.5,发酵165小时,DC15的产量达到130.1g/L。
实例5
种子培养基和培养方法同实例一,发酵培养基同实例二。把培养两天,经镜检无杂菌的400L,NP-6-126种液接入装有1500L发酵培养基,经121℃灭菌40分钟的2500L发酵罐中,29℃,200转/分,罐压0.8Kg/cm2,通气量1∶0.8,开始时,正十五烷300L,24小时后,每隔8-6小时,用NaOH溶液调一次pH至7.5,从第三天开始,每天补加正十五烷120L,共3次,发酵6天(144小时),发酵清液中十五碳二羧酸含量为178g/L。发酵结束后,加入一倍体积自来水,加热至90℃,加碱调pH至10,冷却降温至50℃后,放入分层罐中静量分层一天,放出上层残油,共60L,下层菌层通过压滤、除去菌体,滤清液与中层清液合并,加入0.7%活性炭,90℃脱色15分钟,压滤除去活性炭,脱色滤清液打入酸化罐中,加水至DC15浓度为4%,加热至70℃,加入浓HCl酸化至pH4,冷却降温至30℃左右,板框压滤,空气吹干,固形物在60℃烘干,得白色DC15229Kg,后处理总收率85.76%,纯度为96.5%。
Claims (3)
1、一种利用微生物发酵生产C11-C17长链α,W-二羧酸的方法,其特征在于它包括在以C11-C17的正烷烃为基质的培养基中,用热带假丝酵母(Candida tropicalis)NP-6-126,即CGMCC NO.0206发酵然后回收所形成的二羧酸。
2、根据权利要求1的方法,其特征在于所说的C11-C17的α,W-二羧酸为十五碳二羧酸,所说的正烷烃为正十五烷。
3、热带假丝酵母(Candida tropicalis)NP-6-126,即CGMCC NO.0206菌株。
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