CN102115766B

CN102115766B - 微生物同步发酵正烷烃生产混合长链二元酸的方法

Info

Publication number: CN102115766B
Application number: CN 200910256587
Authority: CN
Inventors: 曹务波; 陈远童; 曹荀梅子
Original assignee: 张艾琳
Current assignee: Qingdao Think Tank Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2029-12-30
Also published as: CN102115766A

Abstract

本发明公开了一种生物合成生产长链α，ω-二羧酸的方法，特别是高产C₁₁-C₁₄混合长链二元酸(DC_m)的方法。所用微生物为一株热带假丝酵母(Candidatropicalis)突变新菌株ly-m。其特点是在微生物菌种分别接入C₁₁-C₁₈各种单一正烷烃、轻蜡油为基质的培养基后，第一阶段，控制体系以菌体生长为主，也生产一定量二元酸；第二阶段，控制发酵系统，以产酸为主，也生长菌体；第三阶段，控制系统只产酸，不长菌体。本方法用于发酵200^#轻蜡油(一种C₁₁-C₁₄的正烷烃混合物)，生产一种DC₁₁-DC₁₄的混合长链二元酸(DC_m)时，在210m³发酵罐中，发酵160小时，发酵清液中混合二元酸(DC_m)的含量达到175g/L。

Description

微生物同步发酵正烷烃生产混合长链二元酸的方法

技术领域：

本发明涉及微生物同步发酵混合正烷烃生产混合长链二元酸的方法，尤其是转化轻蜡油高产包括C₁₁-C₁₄二元酸的混合二元酸(DC_m)的方法。

背景技术：

长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、树脂和医药等的重要原料。长链混合二元酸(DC_m)是合成高性能共聚尼龙工程塑料、服装用高档尼龙热熔胶、高级润滑油和涂料的重要原料。尼龙12是目前国际上开发出来碳链最长，质量最好，价格最高，年产量达到10万吨的高级尼龙工程塑料。尼龙12是1966年由德国Huls公司和瑞士Emser公司投产，后来法国、日本、美国也均有生产，他们多采用纯化学方法，以丁二烯为原料，在高温、高压、催化剂条件下，经过7个复杂的反应步骤生产的，步骤多，收率低，成本高，我国目前还不能生产。如果以DC_m为原料合成共聚尼龙，只需要4个反应步骤，条件温和，步骤少，收率高，成本低，而且性能更优，是竞争力更强的合成方法。因此，利用微生物特异的氧化能力，在常温常压下转化200^#轻蜡油生产DC_m，开辟了二元酸的新来源和新品种，为共聚尼龙工程塑料、高级润滑油、服装用高档热熔胶和高级涂料等的工业生产提供物美价廉的重要原料。

在专利文献中，未见生物合成生产混合长链二元酸的相关公开专利。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的微生物菌种，以及利用该微生物菌种同步发酵混合正烷烃生产混合长链α，ω-二元酸的方法，尤其是同步发酵轻蜡油，高产混合长链α、ω-二元酸的方法。

本发明所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m，是以一株氧化正烷烃生产混合二元酸的热带假丝酵母【参见《微生物学报》20(1)：88-93，1980】为出发菌株，通过硝基胍、亚硝酸、紫外线和N⁺注入等多种诱变方法，经过多次反复诱变筛选培育出来的，能以C₁₁-C₁₈的各种单一正烷烃(nC₁₁...nC₁₈)和/或混合正烷烃，生产相应的单一和/或混合二元酸。尤其是以200^#轻蜡油为基质原料，高产出相应的混合长链二元酸(DC_m)。

具体筛选步骤如下：

将经过先用亚硝酸，后用紫外线，再用N⁺注入等三种诱变手段，连续处理2次的菌种液，用生理盐水分别稀释为10^-1-10^-2，吸取0.1ml稀释好的菌液，涂布于麦芽汁琼脂培养平板上，于29℃的培养箱中培养2天；以出发菌株为对照，对诱变后的菌株进行发酵产酸试验及产酸量检测，筛选出高产α，ω-二羧酸的菌株，即为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m。

本发明热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m已于2009年10月14日在中国典型培养物保藏中心进行保藏，地址为中国武汉武汉大学，保藏号为：CCTCC NO：M 209222。

热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m的生理特性如下：

糖类的发酵：葡萄糖+，半乳糖+，蔗糖+，麦芽糖+，乳糖-。

同化：葡萄糖+，半乳糖+，山梨糖-，蔗糖+，麦芽糖+，纤维二糖+，海藻糖+，乳糖-，密二糖-，棉子糖-，松二糖+，菊芋糖-，可溶性淀粉+，木糖+，L-阿戊糖+，D-阿戊糖-，核糖-，鼠李糖-，α-甲基葡萄糖苷+，甘油+，乙醇+，赤藓醇-，甘露醇+，肌醇-，核糠醇+，半乳糖醇-，葡萄糖醇+，柠檬酸钠-，丁二酸钠+，乳酸钙-。

生长素的需要：生物素++，维生素B₁++，维生素B₂+，维生素B₆+，维生素B₁₂+，叶酸+，烟酸+，泛酸+，肌醇+，对氨基苯甲酸+。

其他：硝酸盐-，冻化牛奶-，熊果酸分解-，凝固牛奶-，油脂酶-。

形态特征：奶油白色，皱褶型，菌落为蛋糕状和桃酥状。

培养特征：在麦芽汁液体培养基中培养时，假菌丝多而长；在烷烃种子培养基培养时，有一定数量的短假菌丝；而在发酵培养基中发酵时，大部分是单个椭圆细胞。

本发明所述同步发酵混合正烷烃生产混合长链二元酸是以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m为发酵菌种，在以混合正烷烃为发酵基质的培养基混合液中同步发酵，生产混合长链α，ω-二元酸；在以200^#轻蜡油(一种C₁₁-C₁₄的正烷烃混合物)为发酵基质的培养基混合液中同步发酵，生产包括C₁₁-C₁₄二元酸的混合二元酸(DC_m)

同步发酵过程中所使用的热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m的种子培养方法如下：

种子培养基：

(1)10Be′糖度的麦芽汁加2％琼脂制成的固体斜面；

(2)10Be′糖度的麦芽汁液体培养基；

(3)烷烃种子培养基包括：KH₂PO₄ 6-12g/L，酵母膏3-8g/L，玉米浆3-8g/L，蔗糖10-30g/L，重蜡10-30g/L，尿素1-3g/L，自来水配制，自然PH。

培养种子的过程如下：取一接种环ly-m酵母菌体，涂布在麦芽汁固体斜面上(φ15×180试管，每支装6-7mL培养基，灭菌后放成斜面)，于28-30℃培养40小时。取一支上述培养好的ly-m菌种全部刮入装有30mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于28-30℃220转/分的旋转摇床上培养40-48小时，作为摇瓶发酵种子或取两支上述培养好的ly-m斜面菌种全部刮入装有500mL培养基的5000mL三角瓶中，于220转/分的旋转摇床28-30℃培养44-48小时，菌株生长光密度OD达到0.6，作为一级种子罐的种子。

同步发酵生产混合长链二元酸的方法如下：

发酵培养基的主要组分为：碱金属磷酸盐4-15g/L(最好为6-10g/L)、氯化钠0.5-2.5g/L(最好为1.0-2.0g/L)、硝酸盐1-10g/L(最好为2-8g/L)、醋酸盐2-6g/L(最好是3-5g/L)、消泡剂400-1200ppm、重蜡或蔗糖15-30g/L、青霉素100-200单位/mL(最好是120-180单位/mL)以及一些其他公知的营养源，碱金属磷酸盐可从KH₂PO₄或NaH₂PO₄中选一种，硝酸盐可从钾或钠盐中选一种。

用本发明的热带假丝酵母ly-m菌株生产长链二元酸，特别是混合二羧酸(DC_m)的具体方法是：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液，按发酵培养基的15-25％(V/V)的用量，接入PH 5.5-9.0，最好为6.0-6.8的含有15-30％(V/V)的200^#轻蜡油和85-70％(V/V)发酵培养基的混合液中。将上述混合物在25-34℃，最好在27-31℃通气发酵72-170小时。第一阶段，体系PH控制在5.5-7.0，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系PH控制在7.0-8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体。从72小时开始，每天补加一定量正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终＞5％(V/V)。

发酵结束后，进行破乳分层，上层残油回收再用，放出中间清液，下层菌体层经膜分离压滤；合并清液，加入适量活性炭，在85-90℃脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至70-80℃，加HCL或H₂SO₄至PH3进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，空气吹干，烘干机烘干，得白色二元酸。

用本发明的ly-m菌株和发酵方法，可生产C₁₁-C₁₈的各种单一二元酸和混合二元酸，其中在210m³发酵罐中，发酵生产DC_m时，发酵160小时，产酸量达到175g/L，转化率达到90.5％，后处理总收率达到93.5％。

具体实施方式：

实施例1..

(1).取一接种环ly-m菌体，涂布在φ15×180大试管麦芽汁固体斜面上，30℃培养两天。

(2).取上述菌种一支，接入装有30mL烷烃种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃在220转/分的旋转摇床上培养46小时。烷烃种子培养基中，KH₂PO₄8g/L，酵母膏3g/L，玉米浆3.5g/L，蔗糖20g/L，尿素3g/L，重蜡30mL/L，自来水配制，PH 5.0，110℃灭菌30分钟。

(3)在装有15mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接入3.5mL上述种子液，在的220转/分旋转摇床上发酵4天，每24小时用NaOH调一次PH至7.5-8.0。发酵培养基混合液中含KH₂PO₄ 8g/L，NaAC 4g/L，KNO₃ 3g/L，酵母膏2g/L，玉米浆2.5g/L，NaCl 1g/L，尿素2g/L，蔗糖20g/L，青霉素160单位/mL，以及200^#轻蜡油200mL/L，自来水配制，PH 7.3，110℃灭菌30分钟。

发酵结束后，用6mol/L HCl调PH至3，用乙醚提取，除去乙醚，得白色结晶，用标准NaOH溶液滴定，计算二元酸含量。结果DC_m产量为88.5g/L。

实施例2.

按照实例1的方法，只是发酵基质用正十一碳烷(nC₁₁)(纯度99％)，结果十一碳二元酸(DC₁₁)产量为50.5g/L，DC₁₁纯度98.5％。

实施例3.

按照实例1的方法，只是发酵基质用正十四碳烷(nC₁₄)(纯度98％)，不加重蜡，结果十四碳二元酸(DC₁₄)产量为71.5g/L，DC₁₄纯度98.1％。

实施例4.

按照实例1的方法，只是发酵基质用正十七碳烷(nC₁₇)(纯度98％)，结果十七碳二元酸(DC₁₇)产量为58.1g/L，DC₁₇纯度97.8％。

实施例5.

(1).种子和发酵培养基同实例1。

(2).把2.5L培养2天，OD(×30，620nm)为0.75，PH4.2，健壮，无杂菌的菌种液接入装有1400L种子培养基，经121℃灭菌40分钟的2000L种子罐中，29±1℃，350转/分，罐压1.0kg/cm²，通气量1∶1，培养40小时，作为30m³种子罐的种母。

(3).把(2)中培养的健壮、无杂菌、OD为0.45的1400L一级种子液接入装有22m³烷烃种子培养基的30m³二级种子培养罐中，在29±1℃，170rpm，罐压1.0kg/cm²，通气量为1∶0.8，培养40小时。作为发酵种母。

(4).把(3)中培养好的健壮、无杂菌、OD为0.84的22m³种子液，接入装有100m³发酵培养基，经121℃灭菌40分钟的210m³发酵罐中，用工业碱调PH至6.9，加入18T灭菌的200^#轻蜡油，开始发酵。20小时以内，PH控制在7.0以下，菌体迅速生长，同时产生12.1g/L二元酸；20-60小时，体系PH控制在7.5以下，迅速产酸，也生长一定量菌体，到62小时，产酸量达到64.6g/L；60-120小时，每4小时调一次PH至8.0，迅速产酸；120小时以后，PH控制在8.4以下，继续产酸。于60、90和120小时分别补加6T、6T和3T轻蜡油。发酵160小时，产酸量达到175g/L，转化率87.6％。

发酵结束后，加碱至PH10，加热至80℃，破乳分层，回收残烃0.3T，菌层用膜分离方法除去菌体，清液通过活性炭脱色，压滤，脱色滤清液用浓H₂SO₄酸化结晶，板框压滤，水洗，压干、吹干、烘干和精制，获包括C₁-C₁₄二元酸的混合二元酸产品26.588T，后处理收率为92％，总酸含量为99.1％。

Claims

1.一种微生物同步发酵正烷烃生产混合长链二元酸的方法，其特征在于所用的微生物为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209222，以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m为发酵种子，在以正烷烃为发酵基质的培养基混合液中同步发酵，生产混合长链α，ω-二元酸，所述的正烷烃发酵基质为C₁₁-C₁₈正烷烃，所述混合长链α，ω-二元酸为C₁₁-C₁₈混合长链α，ω-二元酸；

所说的发酵种子是由热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m菌株经斜面培养、烷烃种子培养基培养，获得一级种子罐的种子；所使用的固体斜面培养基为10个巴林糖度的麦芽汁加2％琼脂制成；液体培养基为10个巴林的麦芽汁；烷烃种子培养基包括：KH₂PO₄6-12g/L，酵母膏3-8g/L，玉米浆3-8g/L，蔗糖10-30g/L，重蜡10-30g/L，尿素1-3g/L，自来水配制，自然pH；

所说的同步发酵过程如下：

发酵培养基的主要组分为：碱金属磷酸盐4-15g/L、氯化钠0.5-2.5g/L、硝酸盐1-10g/L、醋酸盐2-6g/L、消泡剂400-1200ppm、重蜡或蔗糖15-30g/L、青霉素100-200单位/mL、其中碱金属磷酸盐从KH₂PO₄或NaH₂PO₄中选一种，硝酸盐从钾盐或钠盐中选一种；

具体发酵方法为：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液，按发酵培养基的15-25%（v/v）用量，接入pH5.5-9.0的，含有15-30%（v/v）的200^#轻蜡油和85-70%（v/v）发酵培养基的混合液中；将上述混合物在25-34℃通气发酵72-170小时；第一阶段，体系pH控制在5.5-7.0，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制在7.0-8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体;从72小时开始，每天补加C₁₁-C₁₈正烷烃，使发酵液中C₁₁-C₁₈正烷烃浓度始终＞5％（v/v）。

2.如权利要求1所述微生物同步发酵正烷烃生产混合长链二元酸的方法，其特征在于，所说的同步发酵过程如下：

发酵培养基的组成为：碱金属磷酸盐6-10g/L、氯化钠1.0-2.0g/L、硝酸盐2-8g/L、醋酸盐3-5g/L、消泡剂400-1200ppm、重蜡或蔗糖15-30g/L、青霉素120-180单位/mL、其中碱金属磷酸盐从KH₂PO₄或NaH₂PO₄中选一种，硝酸盐从钾或钠盐中选一种；

具体发酵方法为：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液，按发酵培养基的15-25%（v/v）用量，接入pH6.0-6.8的含有15-30%（v/v）的200^#轻蜡油和85-70%（v/v）发酵培养基的混合液中；将上述混合物在27-31℃通气发酵72-170小时；第一阶段，体系pH控制在5.5-7.0，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制在7.0-8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体;从72小时开始，每天补加C₁₁-C₁₈正烷烃，使发酵液中C₁₁-C₁₈正烷烃浓度始终＞5％（v/v）。

3.如权利要求1所述微生物同步发酵正烷烃生产混合长链二元酸的方法，其特征在于所说的同步发酵结束后，进行破乳分层，上层残油回收再用，放出中间清液，下层菌体层经膜分离压滤;合并清液，加入适量活性炭，在85-90℃脱色30分钟，除去活性炭后，脱色液加热至70-80℃，加HCL或浓H₂SO₄至pH3进行酸化结晶，冷却至30℃后，压滤，空气吹干;烘干机烘干，得白色二元酸。

4.一种微生物同步发酵正烷烃生产单一长链二元酸的方法，其特征在于所用的微生物为热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m，该菌种已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为：CCTCC NO：M209222，以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ly-m为发酵种子，在以正烷烃为发酵基质的培养基混合液中同步发酵，生产单一长链α，ω-二元酸，所述的正烷烃发酵基质为单一C₁₁-C₁₈正烷烃，所述单一长链α，ω-二元酸为C₁₁-C₁₈单一长链α，ω-二元酸；

所说的同步发酵过程如下：

具体发酵方法为：把培养好的经过镜检，没有杂菌的菌种液，按发酵培养基的15-25%（v/v）用量，接入pH5.5-9.0的，含有15-30%（v/v）的单一C₁₁-C₁₈正烷烃和85-70%（v/v）发酵培养基的混合液中；将上述混合物在25-34℃通气发酵72-170小时；第一阶段，体系pH控制在5.5-7.0，以菌体生长为主，同时生产一定数量的二元酸；第二阶段，体系pH控制在7.0-8.0之间，以发酵产酸为主，也生长部分菌体；第三阶段，只产酸，不长菌体;从72小时开始，每天补加单一C₁₁-C₁₈正烷烃，使发酵液中单一C₁₁-C₁₈正烷烃浓度始终＞5％（v/v）。