CN104862348A - 一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法 - Google Patents

一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法 Download PDF

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CN104862348A CN201410067073.2A CN201410067073A CN104862348A CN 104862348 A CN104862348 A CN 104862348A CN 201410067073 A CN201410067073 A CN 201410067073A CN 104862348 A CN104862348 A CN 104862348A
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Abstract

本发明公开了一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，特别是高产十二碳二元酸（DC12）的方法。通过下述方案予以实现：将维斯假丝酵母（Candida viswanathii）培养成的种子液接入pH5.0-8.5含有5-40%（v/v）10-18个碳原子的正烷烃和95-60%（v/v）包括糖质多元底物做生长碳源的液体发酵培养基混合液中；上述混合液在24-40℃、通气量0.1-3.0vvm下培养42-194h，启动发酵与膜分离耦合装置，经耦合装置分离后的细胞循环回发酵罐，经耦合装置分离后的透过液进入提取环节制备长链二元酸，同时向发酵罐中补充培养基继续发酵过程。本方法用于转化正十二烷生产DC12时，产酸达250g/L，产酸速率大于1.6g/h·L，提高了发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期，提高合成二元酸的生产强度，未被利用的正烷烃也同时返回至发酵过程。

Description

一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法
技术领域
本发明的技术方案属于发酵工程技术领域，具体涉及一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸是合成香料、工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、树脂和医药等的重要原料。
目前，长链二元酸主要采用微生物发酵法生产，利用微生物双端氧化的特殊功能发酵正烷烃制取长链二元酸。国内外生产菌株的ω-氧化能力较强，产酸可达200g/L，但在生产长链二元酸过程中面临的一个首要问题是生产效率较低。因此，为了解决该问题研究人员从菌种筛选方面做了大量的工作，如中国专利CN1233658A公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选方法，该方法能快速而高效的获得α、ω-氧化能力强的假丝酵母突变菌株，为提高产酸量和转化率打下基础。另外，中国专利CN1130685A、CN1162644A、CN1369464A、CN1092108A、CN1034579A、CN1046757A分别公开了通过硝基胍、亚硝酸和紫外线多次反复诱变，选育ω-氧化能力更强的热带假丝酵母突变株并以烷烃作为生长碳源，氧化正烷烃生产长链二元酸的方法，这些菌株对十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸有一定效果。上述方法主要从菌种改良方面提高发酵效率，而菌种改良的工作量大，不确定因素多且发酵效率仍然较低，如专利CN1928100A中DC12生产效率是1.3g/L·h，专利CN102115765A中十七碳二元酸的生产效率为1.13g/L·h，专利CN10225411A中混合二元酸的生产效率仅有0.92g/L·h，因此如何进一步提高二元酸的发酵效率仍是急需解决的问题之一。
到目前为止，专利和文献主要是侧重于菌种的改造以获得高产二元酸的菌株的方面，而鲜有针对发酵工艺改变而提高其效率的报道。因此，本专利主要针对长链二元酸发酵过程的特点，开发一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的新技术。该技术利用膜工艺回流菌体并分离出已合成的高浓度二元酸，降低产物二元酸对其合成过程的抑制作用，提高发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期，提高合成二元酸的生产强度；特别是采用膜分离回流菌体时，未被利用的正烷烃也同时返回至发酵过程，降低了二元酸提取过程分离正烷烃的难度。
发明内容
针对目前微生物合成长链二元酸过程生产效率低下的问题，本发明所解决的技术问题是：发酵过程中利用膜技术回流菌体并分离出已合成的高浓度二元酸，降低产物二元酸对其合成过程的抑制作用；提高发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期，提高合成二元酸的生产强度；膜分离回流菌体时，未被利用的正烷烃也同时返回至发酵过程，降低了二元酸提取过程分离正烷烃的难度。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：
一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，包括如下步骤：
（1）将维斯假丝酵母ipe-1（Candida viswanathii ipe-1）培养成的种子液接入pH5.0-8.5含有5-40%（v/v）10-18个碳原子的正烷烃和95-60%（v/v）包括糖质多元底物做生长碳源的液体发酵培养基混合液中；液体发酵培养基包括：糖质10-90g/L，金属磷酸盐2-10g/L，酵母膏1-6g/L，玉米浆1-3g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L,钾盐1-10g/L，吐温0.5-1.5g/L；
（2）上述混合液在24-40℃、通气量0.1-3.0vvm下发酵42-194h，启动发酵与膜分离耦合装置，采用分批补料发酵、半连续发酵或连续发酵的形式，经膜组件分离后的细胞循环回发酵罐，经膜组件分离后的透过液进入提取环节制备长链二元酸，同时向发酵罐中补充液体发酵培养基继续发酵过程；
（3）在上述发酵过程中，通过连续或间歇的方式补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终大于等于1%（v/v）。
本专利采用的维斯假丝酵母ipe-1（Candida viswanathii ipe-1）已在2014年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.8824。
为实现上述过程，发酵与膜分离耦合装置中采用的膜为微滤膜或超滤膜，膜材料为：聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈有机膜，氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质陶瓷膜，Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜；膜组件的型式为平板式、外压中空纤维式或管式；当采用微滤膜时，膜的孔径为0.1-1μm的有机或无机膜，处理中的压力是0.01-0.2Mpa；当采用微滤膜时，膜截留分子量为1-1,000KDa的有机或无机膜，处理的压力是0.1-1.0Mpa。
发酵与膜分离耦合发酵过程，可以采用分批补料发酵、半连续发酵和连续发酵的形式。所述的分批补料发酵指的是发酵过程中通过连续或间歇的方式补加正烷烃和液体发酵培养基的混合液或仅补充正烷烃，直至发酵罐允许最大体积，当发酵罐中产物浓度未达到其最大发酵浓度时，采用分离耦合装置移除一定的发酵体积直至发酵初始体积，之后继续补料发酵过程，该过程反复进行，直至达到产物最大发酵浓度时终止该发酵过程；所述的半连续发酵指的是在发酵进行42-194h时，通过分离耦合装置移除产物二元酸，直至分离耦合装置死体积时，采用0-3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，然后将菌体全部返回发酵罐中并一次性补加权利要求1步骤（1）中的包括烷烃和液体发酵培养基的发酵成份，继续发酵过程，该过程反复进行；所述的连续发酵指的是发酵进行42-194h时，通过分离耦合装置移除已合成的二元酸，同时连续向发酵体系内补充步骤1中的液体发酵培养基，以连续或间歇的方式补加正烷烃，并以维持发酵液体积恒定、维持发酵液中残留二元酸浓度恒定或维持发酵液中残留烷烃浓度恒定的方式连续进行发酵过程。
该技术对不同菌种转化含有10-18个碳原子正烷烃或其混合物，进而合成相应的二元酸均有显著效果，特别是对于转化含有12-17个碳原子正烷烃或其混合物的效果更显著。
本发明与现有技术相比，有益效果是：第一，采用膜技术使发酵过程的二元酸移出发酵体系，降低产物抑制作用；第二，采用膜技术使发酵过程的菌体回流至发酵过程，提高发酵体系的菌体密度，缩短发酵周期；第三，实现了细胞的循环使用，降低了发酵前期培养细胞的物质消耗和培养时间，提高了二元酸的底物转化率；第四，膜分离回流菌体时，未被利用的正烷烃也同时返回至发酵过程，降低了二元酸提取过程分离正烷烃的难度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，本发明所涉及的主题保护范围并非仅限于这些实施例。
实施例1
本实施例为不添加发酵与膜分离耦合装置的发酵过程，作为添加发酵与膜分离耦合装置的对照，发酵合成长链二元酸的过程如下：
第一步，培养基配制
①斜面培养基：麦芽汁琼脂培养基；
②种子培养基：葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，正十二烷100mL/L；
③发酵培养基:葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，正十二烷300mL/L，吐温801g/L。
第二步，菌种活化
取一环维斯假丝酵母（Candida viswanathii）涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h。
第三步，种子培养
将斜面上活化的种子培养物接种于装100ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27℃，200r/min条件下振荡培养40小时。
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1%（v/v），培养42h产酸60.5g/L，培养194h时产酸210.2g/L发酵结束，平均产酸速率为1.08g/h·L。
实施例2
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐中DC12浓度小于10g/L时，降低经分离耦合装置后透过液的流出速率；当发酵罐中DC12>50g/L时，提高经分离耦合装置后透过液的流出速率；此过程通过补充新鲜的培养基控制发酵罐内体积恒定，新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1%（v/v）。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵300h，平均产酸速率2.0g/h·L，较对照提高1.85倍，长链二元酸平均浓度30.7g/L。
实施例3
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐中DC12浓度小于10g/L时，降低经分离耦合装置后透过液的流出速率；当发酵罐中DC12>50g/L时，提高经分离耦合装置后透过液的流出速率；此过程通过补充新鲜的培养基控制发酵罐内体积恒定，新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1%（v/v）。所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵300h，平均产酸速率2.1g/h·L，较对照提高1.94倍，长链二元酸平均浓度30.5g/L。
实施例4
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养194h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐中DC12浓度小于10g/L时，降低经分离耦合装置后透过液的流出速率；当发酵罐中DC12>50g/L时，提高经分离耦合装置后透过液的流出速率；此过程通过补充新鲜的培养基控制发酵罐内体积恒定，新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1%（v/v）。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵350h，平均产酸速率1.8g/h·L，较对照提高1.67倍，长链二元酸平均浓度110.2g/L。
实施例5
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养194h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐中DC12<10g/L时，降低经分离耦合装置后透过液的流出速率；当发酵罐中DC12>50g/L时，提高经分离耦合装置后透过液的流出速率；此过程通过补充新鲜的培养基控制发酵罐内体积恒定，新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，正十二烷300mL/L，吐温801g/L，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1%（v/v）。所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵350h，平均产酸速率1.9g/h·L，较对照提高1.76倍,长链二元酸平均浓度111.5g/L。
实施例6
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足膜组件运转所需时，用3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，之后将菌体返回发酵罐中，停止膜组件。然后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括（g/L）葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动膜组件重复上述过程，此过程反复进行。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵350h，平均产酸速率1.8g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.67倍,长链二元酸平均浓度205.6g/L。
实施例7
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足膜组件运转所需时，用3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，之后将菌体返回发酵罐中，停止膜组件。然后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括（g/L）葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动膜组件重复上述过程，此过程反复进行。所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵350h，平均产酸速率1.9g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.76倍,长链二元酸平均浓度202.5g/L。
实施例8
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足膜组件运转所需时,将菌体返回发酵罐中，停止膜组件。然后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括（g/L）葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动膜组件重复上述过程，此过程反复进行。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵350h，平均产酸速率1.6g/h·L，平均产酸速率较对照提高0.92倍,长链二元酸平均浓度213.6g/L。当所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵350h，平均产酸速率1.7g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.57倍,长链二元酸平均浓度216.5g/L。实施例9
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养194h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足膜组件运转所需时，用3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，之后将菌体返回发酵罐中，停止膜组件。然后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括（g/L）葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动膜组件重复上述过程，此过程反复进行。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵450h，平均产酸速率2.1g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.94倍,长链二元酸平均浓度215.6g/L。
实施例10
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以5-25%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH4.0～6.0，温度30-32℃，转速300-400r/min，培养194h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足膜组件运转所需时，用3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，之后将菌体返回发酵罐中，停止膜组件。然后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括（g/L）葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动膜组件重复上述过程，此过程反复进行。所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵450h，平均产酸速率2.2g/h·L，平均产酸速率较对照提高2.04倍,长链二元酸平均浓度218.7g/L。
实施例11
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养194h。启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足膜组件运转所需时，停止膜组件。然后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括（g/L）葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl1g/L,KCl1g/L，吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动膜组件重复上述过程，此过程反复进行。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵450h，平均产酸速率1.9g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.76倍,长链二元酸平均浓度220.5g/L。当所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵450h，平均产酸速率2.0g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.85倍,长链二元酸平均浓度216.7g/L。
实施例12
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h，开始流加正十二烷。当发酵体积增加25%，启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内醪液体积降至初始值时，停止分离耦合装置。此过程反复进行直至发酵产酸浓度达到270g/L，停止发酵过程。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。所述的膜组件采用微滤膜，操作压力是0.2Mpa，膜孔径为0.5μm的管式有机膜。发酵350h，平均产酸速率1.6g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.48倍,长链二元酸平均浓度250.1g/L。
实施例13
按如下步骤发酵合成长链二元酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始pH6.0，温度27℃，通气量1.0vvm，培养42h，开始流加正十二烷。当发酵体积增加25%，启动膜组件使菌体经膜组件回流至发酵罐中，经过膜组件的渗透液进入提取环节。当发酵罐内醪液体积降至初始值时，停止分离耦合装置。此过程反复进行直至发酵产酸浓度达到270g/L，停止发酵过程。所述的膜组件采用超滤膜，操作压力是0.5Mpa，膜截留分子量为300KDa管式陶瓷膜。发酵350h，平均产酸速率1.7g/h·L，平均产酸速率较对照提高1.57倍,长链二元酸平均浓度248.1g/L。

Claims (10)

1.一种发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，包括如下步骤： 
（1）将维斯假丝酵母ipe-1（Candida viswanathii ipe-1）培养成的种子液接入pH5.0-8.5含有5-40%（v/v）10-18个碳原子的正烷烃和95-60%（v/v）包括糖质多元底物做生长碳源的液体发酵培养基混合液中； 
（2）上述混合液在24-40℃、通气量0.1-3.0vvm下发酵42-194h，启动发酵与膜分离耦合装置，采用分批补料发酵、半连续发酵或连续发酵的形式，经耦合装置分离后的细胞循环回发酵罐，经耦合装置分离后的透过液进入提取环节制备长链二元酸，同时向发酵罐中补充液体发酵培养基继续发酵过程； 
（3）在上述发酵过程中，通过连续或间歇的方式补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终大于等于1%（v/v）。 
2.根据权利要求1所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用发酵与膜分离耦合装置中的膜为微滤膜或超滤膜。 
3.根据权利要求1所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的分批补料发酵指的是发酵过程中通过连续或间歇的方式补加正烷烃和液体发酵培养基的混合液或仅补充正烷烃，直至发酵罐允许最大体积，当发酵罐中产物浓度未达到其最大发酵浓度时，采用分离耦合装置移除一定的发酵体积直至发酵初始体积，之后继续补料发酵过程，该过程反复进行，直至达到产物最大发酵浓度时终止该发酵过程； 
所述的半连续发酵指的是在发酵进行42-194h时，通过分离耦合装置移除产物二元酸，直至分离耦合装置死体积时，采用0-3倍耦合装置死体积的无菌水洗涤菌体，然后将菌体全部返回发酵罐中，并一次性补加权利要求1步骤（1）中的包括烷烃和液体发酵培养基的发酵成份，继续发酵过程，该过程反复进行； 
所述的连续发酵指的是发酵进行42-194h时，通过分离耦合装置移除已合成的二元酸，同时连续向发酵体系内补充权利要求1中的液体发酵培养基，以连续或间歇的方式补加正烷烃，并以维持发酵液体积恒定、维持发酵液中残留二元酸浓度恒定或维持发酵液中残留烷烃浓度恒定的方式连续进行发酵过程。 
4.根据权利要求1所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基包括糖质10-90g/L，金属磷酸盐2-10g/L，酵 母膏1-6g/L，玉米浆1-3g/L，尿素0.5-1.5g/L，NaCl0.5-1g/L,硝酸盐1-10g/L，吐温0.5-1.5。 
5.根据权利要求4所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：发酵培养基中所述的糖质是葡萄糖、蔗糖或半乳糖；硝酸盐是KNO3或NaNO3；吐温是吐温60或吐温80；金属磷酸盐是钠盐或钾盐。 
6.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的微滤处理中的压力是0.01-0.2Mpa；所述的超滤处理的压力是0.1-1.0Mpa。 
7.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用微滤膜的孔径为0.1-1μm的有机或无机膜；采用超滤膜截留分子量为1-1,000KDa的有机或无机膜。 
8.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用的膜组件的型式为平板式、外压中空纤维式或管式。 
9.根据权利要求2所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：采用的膜材料为：聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯腈有机膜，氧化铝质、氧化钴质、氧化硅质、硅酸铝质、碳化硅质陶瓷膜，Ag膜、Ni膜、Ti膜及不锈钢膜金属膜或金属与陶瓷复合型无机膜。 
10.根据权利要求1或3所述的发酵与膜分离耦合生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述的正烷烃含有12-17个碳原子或其混合物。 
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755062A (zh) * 2016-03-31 2016-07-13 中国科学院过程工程研究所 一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法
CN106755146A (zh) * 2015-11-19 2017-05-31 中国石油化工股份有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置
CN109868296A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法
CN109868294A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法
CN109868226A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种营养盐溶液及其应用
CN109913512A (zh) * 2017-12-13 2019-06-21 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 生物发酵生产长链二元酸的方法
CN109943598A (zh) * 2017-12-20 2019-06-28 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN109943599A (zh) * 2017-12-20 2019-06-28 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN110272924A (zh) * 2018-03-14 2019-09-24 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN110564784A (zh) * 2019-06-25 2019-12-13 张艾琳 一种维斯假丝酵母发酵生产十四碳二元酸的方法
CN110616235A (zh) * 2019-06-25 2019-12-27 张艾琳 一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法
CN110669797A (zh) * 2018-07-03 2020-01-10 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN111850060A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备方法
CN113943760A (zh) * 2021-12-02 2022-01-18 王婷 维斯假丝酵母发酵生产长链二元酸的方法、产品与菌种
CN114432891A (zh) * 2022-03-03 2022-05-06 广西大学 一种陶瓷膜过滤山茶油加工方法
CN115044489A (zh) * 2022-06-13 2022-09-13 南京同凯兆业生物技术有限责任公司 一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿酒酵母的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101215583A (zh) * 2008-01-18 2008-07-09 南京工业大学 一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法
CN102051329A (zh) * 2009-10-27 2011-05-11 中国石油化工股份有限公司 生物质发酵-分离耦合装置及制备乙醇的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101215583A (zh) * 2008-01-18 2008-07-09 南京工业大学 一种发酵与膜分离单元耦合制备丁二酸的方法
CN102051329A (zh) * 2009-10-27 2011-05-11 中国石油化工股份有限公司 生物质发酵-分离耦合装置及制备乙醇的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
徐成勇等: "发酵法生产长链二元酸研究进展", 《生物工程进展》 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755146A (zh) * 2015-11-19 2017-05-31 中国石油化工股份有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置
CN106755146B (zh) * 2015-11-19 2020-04-10 中国石油化工股份有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置
CN105755062A (zh) * 2016-03-31 2016-07-13 中国科学院过程工程研究所 一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法
CN105755062B (zh) * 2016-03-31 2019-01-25 中国科学院过程工程研究所 一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法
CN109868296A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法
CN109868294A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种连续发酵生产长链二元酸的方法
CN109868226A (zh) * 2017-12-05 2019-06-11 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种营养盐溶液及其应用
CN109913512A (zh) * 2017-12-13 2019-06-21 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 生物发酵生产长链二元酸的方法
CN109943599A (zh) * 2017-12-20 2019-06-28 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN109943598A (zh) * 2017-12-20 2019-06-28 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN109943599B (zh) * 2017-12-20 2023-04-14 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN110272924A (zh) * 2018-03-14 2019-09-24 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN110669797A (zh) * 2018-07-03 2020-01-10 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产长链二元酸的方法
CN111850060A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备方法
CN110564784A (zh) * 2019-06-25 2019-12-13 张艾琳 一种维斯假丝酵母发酵生产十四碳二元酸的方法
CN110616235B (zh) * 2019-06-25 2022-06-03 张艾琳 一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法
CN110564784B (zh) * 2019-06-25 2023-01-24 张艾琳 一种维斯假丝酵母发酵生产十四碳二元酸的方法
CN110616235A (zh) * 2019-06-25 2019-12-27 张艾琳 一种维斯假丝酵母发酵生产十三碳二元酸的方法
CN113943760A (zh) * 2021-12-02 2022-01-18 王婷 维斯假丝酵母发酵生产长链二元酸的方法、产品与菌种
CN113943760B (zh) * 2021-12-02 2023-09-12 王婷 维斯假丝酵母发酵生产长链二元酸的方法、产品与菌种
CN114432891A (zh) * 2022-03-03 2022-05-06 广西大学 一种陶瓷膜过滤山茶油加工方法
CN115044489A (zh) * 2022-06-13 2022-09-13 南京同凯兆业生物技术有限责任公司 一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿酒酵母的方法
CN115044489B (zh) * 2022-06-13 2024-02-20 南京同凯兆业生物技术有限责任公司 一种利用连续发酵分离一体化技术培养酿酒酵母的方法

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