CN105755062A - 一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法，所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵产酸三个步骤，所述发酵的体系为由菌体、无菌空气、烷烃和水组成的四相发酵体系，在所述发酵体系中引入ORP电极，通过调节通气量、搅拌转速，并结合氧化剂和还原剂，实现长链二元酸的两阶段ORP控制发酵，以生产长链二元酸。本发明通过在微生物发酵生产长链二元酸的过程中引入ORP电极，实现两阶段ORP控制策略，调节长链二元酸的发酵过程，从而提高了长链二元酸的产量及发酵体系的稳定性，发酵产率较未控制ORP时显著提高，甚至发酵产率为未控制ORP时的4.6倍以上，生产强度可高达1.78g·h?1·L?1。

Description

一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸是合成香料、工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、树脂和医药等的重要原料。目前，长链二元酸主要利用微生物双端氧化的特殊功能来发酵正烷烃制取，但是该工艺生产效率非常低下，如混合长链二元酸的生产强度仅有0.92g·h-1·L-1(CN101225411)、十七碳二元酸的生产强度仅有1.1g·h-1·L-1(CN102115769)和十二碳二元酸生产强度仅有1.3g·h-1·L-1(CN1928100)。为了提高长链二元酸的生产效率，研究人员在菌种筛选和发酵工艺优化方面开展了大量的工作。在菌种筛选方面，CN1233658A公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选方法，该方法能快速而高效的获得α、ω-氧化能力强的假丝酵母突变菌株，为提高产酸量和转化率打下基础。另外，CN1130685A、CN1162644A、CN1369464A、CN1092108A、CN1034579A和CN1046757A分别公开了通过硝基胍、亚硝酸和紫外线多次反复诱变，选育ω-氧化能力更强的热带假丝酵母突变株并以烷烃作为生长碳源，氧化正烷烃生产长链二元酸的方法，这些菌株对十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸有一定效果。
在发酵工艺的优化方面，通过在发酵液中添加减弱α或β氧化能力的试剂和pH调节等策略取得了不错的效果。如刘树臣等(化工学报，54(8)，1128-1133，2003)报道了控制发酵过程pH提高十三碳二元酸生产效率的方 法；苏庆旺等(CN102808004)在发酵过程中加入α-氧化脱羧抑制剂和/或β-氧化抑制剂来减弱菌株的α-氧化脱羧和β-氧化能力提高长链二元酸发酵产率；方向晨等(CN1611608)在发酵过程中加入抑制剂来减弱菌株的β-氧化能力，提高发酵产率。目前，尚未有控制氧化还原电位提高长链二元酸产量的报道。
发酵体系的氧化还原电位值是pH值、溶解氧浓度、平衡常数和大量溶解于培养基中物质的氧化还原电位的综合反映。目前，有通过调节氧化还原电位提高其他以糖质为底物的发酵产物产率的方法，CN101235397公开了华东理工大学王永红等控制发酵液的氧化还原电位为-190mv至-150mv，使菌体较快适应发酵环境，提高比生长速率，大大提高乳酸生产产量。CN101182555公开了南京工业大学江岷等将氧化还原电位控制在合适值，达到丁二酸的高效生产，减少副产物的生成，缩短了发酵时间。上述发明主要是针对厌氧发酵过程的调控，而CN101624608针对的是好氧发酵过程，其公开了江南大学刘立明等向发酵培养基中添加外源电子受体铁氰化钾，提高培养基的初始氧化还原电位至400mV，从而降低以葡萄糖为基质的光滑球拟酵母CCTCCM202019胞内NADH水平，加速糖酵解，提高丙酮酸的产量。
以上所述通过调节氧化还原电位值来调控二元酸生产的方法均是针对以糖质为原料进行发酵的短链二元酸而言，而通过套用或借用上述以糖质为底物的发酵过程中对氧化还原电位的控制策略很难实现长链二元酸的生产，微生物发酵生产长链二元酸是以正烷烃为原料，它与历来以糖质为原料的发酵不同，有其自身的特点：(1)四相体系的发酵：菌体、空气、烃类(油)和水组成四相体系，烃类难溶于水，只有形成小油滴，微生物才能接触到烷烃并形成以微生物为核心且烷烃包围在微生物四周的乳化液滴，微生物利用和氧化烷烃，产生二元酸。(2)需氧量和放热量大：微生物发酵正烷烃生成二元酸时，增加了四 个氧原子，因此需氧量大。有人经过试验和计算，认为烷烃发酵需氧量和放热量都是糖发酵时的2～3倍。(3)长链二元酸在水中溶解度小：长链二元酸易溶于乙醚、乙醇、酮类等有机溶剂中，而难溶于水，它们在水中的溶解度很小，而且随温度的变化改变不大。当微生物与烷烃结合形成乳化液滴后，不溶于水的烷烃将限制以水为媒介进行物质传递的过程，所以通过添加氧化剂或还原剂难以达到调节长链二元酸发酵过程ORP(氧化还原电位)的目的。因此，基于微生物发酵生产长链二元酸的特点，我们很难套用或借用上述以糖质为底物的发酵过程中对氧化还原电位的控制策略。
因此，在本领域，需要开发一种能够有效地促进长链二元酸合成以提高其产量的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法，本发明方法通过在发酵体系中引入ORP(氧化还原电位)电极，通过调节搅拌转速，控制通气量，并添加还原剂或氧化剂实现长链二元酸的两阶段ORP控制发酵，以达到长链二元酸的高效生产，并提高了长链二元酸发酵过程的稳定性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法，所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵产酸三个步骤，所述发酵的体系为由菌体、无菌空气、烷烃和水组成的四相发酵体系，在所述发酵体系中引入ORP电极，通过调节通气量、搅拌转速，并结合氧化剂和还原剂，实现长链二元酸的两阶段ORP控制发酵，以生产长链二元酸。
优选地，所述长链二元酸为碳原子数为11-18的二元酸，例如碳原子数为 11、12、13、14、15、16、17或18的二元酸。
短链的二元酸例如丁二酸的生产是利用以糖质为原料的微生物发酵过程，其发酵体系为菌体、空气和水三相体系，糖质原料易溶于水，微生物可与糖质充分接触，而在长链二元酸的生产中需要使用由菌体、空气、烃类和水组成的四相发酵体系，烃类难溶于水，只有形成小油滴，微生物才能接触到烷烃并形成以微生物为核心且烷烃包围在微生物四周的乳化液滴，微生物利用和氧化烷烃，产生二元酸。利用微生物发酵正烷烃生成二元酸时，增加了四个氧原子，因此需氧量大，长链二元酸的生产中需氧量和放热量都是短链的二元酸生产中糖发酵时的2～3倍，长链二元酸在水中溶解度小，而且随温度的变化改变不大。当微生物与烷烃结合形成乳化液滴后，不溶于水的烷烃将限制以水为媒介进行物质传递的过程，所以通过添加氧化剂或还原剂难以达到调节长链二元酸发酵过程ORP的目的，因此采用在所述四相发酵体系中引入ORP电极，结合氧化剂和还原剂，实现长链二元酸的两阶段ORP控制发酵。
在本发明中，所述发酵过程利用的微生物菌种为维斯假丝酵母ipe-1(Candida viswanathii ipe-1)，已于2014年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏单位的简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.8824。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述菌种活化时使用的斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基，所述麦芽汁琼脂培养基可通过购买获得。
优选地，所述述菌种活化为将菌种接种于斜面培养基中，于25-40℃培养24-72h，例如培养温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、37℃或40℃，培养时间可以为24h、26h、28h、30h、32h、36h、38h、40h、44h、48h、50h、55h、58h、60h、64h、68h或 72h。
优选地，所述种子培养过程中使用的种子培养基为pH 4.0-8.0(例如4.0、4.5、4.8、5.0、5.3、5.5、5.8、6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.4、7.8或8.0)的含有糖质和烷烃的液体培养基。
优选地，所述种子培养基包括如下组分：糖质15-60g/L(例如15g/L、18g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L或60g/L)，磷酸氢二钠1-3g/L(例如1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.8g/L或3g/L)，酵母膏0.5-2g/L(例如0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L或2g/L)，玉米浆1-3g/L(1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.8g/L或3g/L)，尿素0.1-0.8g/L(例如0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L或0.8g/L)，烷烃50-120mL/L(例如50mL/L、55mL/L、60mL/L、65mL/L、70mL/L、75mL/L、80mL/L、90mL/L、100mL/L、110mL/L或120mL/L)。
优选地，所述糖质为葡萄糖、蔗糖或半乳糖中的任意一种或至少两种的组合，优选葡萄糖。
优选地，所述烷烃为碳原子数为11-18(例如11、12、13、14、15、16、17或18)的正烷烃，例如正十一烷、正十二烷、正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷或正十八烷。
优选地，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，碳原子数11-18的正烷烃100mL/L。
优选地，所述种子培养为将活化后的菌种接种于种子培养基中，于25-40℃振荡培养20-48h，例如培养温度可以为25℃、26℃、27℃、28℃、 29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、37℃或40℃，培养时间可以为20h、24h、26h、28h、30h、32h、36h、38h、40h、44h或48h。
优选地，所述发酵产酸步骤中使用的发酵培养基为含有糖质和烷烃的液体培养基；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：糖质10-90g/L(例如12g/L、15g/L、18g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L或90g/L)，磷酸氢二钠1-5g/L(例如1g/L、1.3g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.4g/L、2.8g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L或5g/L)，酵母膏0.5-2g/L(例如0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L或2g/L)，玉米浆1-3g/L(例如1g/L、1.2g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.2g/L、2.5g/L、2.8g/L或3g/L)，尿素0.1-0.8g/L(例如0.1g/L、0.3g/L、0.5g/L、0.7g/L或0.8g/L)，NaCl 0.5-3g/L(例如0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、2.5g/L、2.8g/L或3g/L)，KCl 0.5-2g/L(例如0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.5g/L、1.8g/L或2g/L)，烷烃150-400mL/L(例如150mL/L、180mL/L、200mL/L、230mL/L、250mL/L、280mL/L、300mL/L、330mL/L、350mL/L、380mL/L或400mL/L)，吐温80 0.5-2g/L(例如0.5g/L、0.8g/L、1g/L、1.5g/L、1.8g/L或2g/L)。
优选地，所述糖质为葡萄糖、蔗糖或半乳糖中的任意一种或至少两种的组合，优选葡萄糖。
优选地，所述烷烃为碳原子数为11-18(例如11、12、13、14、15、16、17或18)的正烷烃，例如正十一烷、正十二烷、正十三烷、正十四烷、正十五烷、正十六烷、正十七烷或正十八烷。
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L，磷酸氢二钠2 g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl 1g/L，KCl 1g/L，碳原子数11-18的正烷烃300mL/L，吐温80 1g/L。
优选地，所述发酵时的菌种接种量为发酵培养基体积的4-30％，例如4％、6％、8％、10％、12％、15％、18％、20％、22％、24％、26％、28％或30％。
优选地，所述发酵时的温度为25-40℃，例如25℃、27℃、30℃、32℃、35℃、37℃、39℃或40℃。
优选地，所述发酵产酸过程的初始发酵阶段将培养基pH控制为4.0-8.0，当培养基中糖质消耗完毕时，进入第二发酵阶段，调节培养基pH至7.0-9.0。
优选地，在初始发酵阶段，控制ORP为0-200mV，例如0mV、10mV、20mV、40mV、60mV、80mV、100mV、120mV、140mV、160mV、180mV或200mV。
优选地，在第二发酵阶段，控制ORP为0-100mV，例如0mV、5mV、10mV、15mV、20mV、30mV、40mV、50mV、60mV、70mV、80mV、90mV或100mV。
优选地，在第二发酵阶段通过连续或间歇的方式补加烷烃，使发酵液中烷烃浓度始终大于等于1％，例如1％、3％、5％、10％、12％、15％、18％或20％等。在本发明中，起始发酵液的配料中烷烃浓度大于等于1％且小于等于40％，随着发酵的进行，烷烃消耗，其在发酵液中的浓度逐渐减小，通过连续或间歇的方式补加烷烃使得发酵液中烷烃浓度始终保持大于等于1％的浓度，一般补料操作中补加的烷烃浓度会小于初始料液中烷烃的浓度，只要保持烷烃浓度大于等于1％即可。
优选地，第二发酵阶段的发酵时间为60-200h，例如60h、65h、72h、83 h、85h、87h、90h、94h、98h、100h、110h、120h、140h、160h、180h或200h。
优选地，在发酵产酸过程中，向发酵罐中通入无菌空气。
优选地，在发酵产酸过程中，所述无菌空气的通气量为0.1-4.0vvm，例如0.1vvm、0.5vvm、0.8vvm、1vvm、1.3vvm、1.5vvm、1.8vvm、2vvm、2.3vvm、2.5vvm、2.8vvm、3vvm、3.2vvm、3.5vvm、3.8vvm或4vvm。
优选地，在发酵产酸过程中，将搅拌转速控制在50-1000rpm，例如50rpm、80rpm、100rpm、150rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm或1000rpm。
在本发明的第二发酵阶段通过调节搅拌转速和通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来控制ORP值，所述调节搅拌转速和通气量是指在本发明所限定的搅拌转速范围(50-1000rpm)和通气量范围(0.1-4.0vvm)内进行调节并通过配合添加氧化剂和/或还原剂以使ORP值达到本发明所限定的范围(在初始发酵阶段ORP为0-200mV；在第二发酵阶段ORP为0-100mV)；例如当ORP低于设定值时，首先增加搅拌转速及通气量，然后添加氧化剂调节ORP值；当ORP高于设定值时，首先降低搅拌转速及通气量，然后添加还原剂调节ORP。
优选地，所述氧化剂为过氧化氢、硫酸铁或铁氰化钾中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述还原剂为维生素C、硼氢化钠、半胱氨酸或硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
作为优选技术方案，本发明所述利用氧化还原电位调控发酵过程生产长链二元酸的方法具体包括以下步骤：
(1)菌种活化：将菌种接种于斜面培养基中，于25-40℃培养24-72h，所 述斜面培养基为pH＝6.0-6.5的麦芽汁琼脂培养基；
(2)种子培养：将活化后的菌种接种于种子培养基中，于25-40℃振荡培养20-48h，所述种子培养过程中使用的种子培养基为pH 4.0-8.0的含有糖质和正烷烃的液体培养基；
(3)发酵产酸：将步骤(2)得到的种子培养物以4-30％的接种量接种至发酵培养基上，控制初始pH 4.0-8.0，控制发酵温度在25-40℃，无菌空气的通气量为0.1-4.0vvm，搅拌转速为50-1000rpm，通过在所述搅拌转速范围内调节搅拌转速和在所述通气量范围内调节通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来控制初始发酵阶段ORP值为0-200mV；当培养基中糖类消耗完毕时，进行第二阶段发酵，调节培养基pH至7.0-9.0，通过在所述搅拌转速范围内调节搅拌转速和在所述通气量范围内调节通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来控制第二发酵阶段ORP值为0-100mV，继续进行发酵，同时在发酵过程中通过连续或间歇的方式补加烷烃，使发酵液中烷烃浓度始终大于等于1％，发酵60-200h，完成发酵，产生长链二元酸。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在微生物发酵生产长链二元酸的过程中引入了ORP电极，通过两阶段ORP控制策略，调节长链二元酸的发酵过程，从而提高了长链二元酸的产量及发酵体系的稳定性，发酵产率较未控制ORP时显著提高，甚至发酵产率为未控制ORP时的4.6倍以上，生产强度(单位时间单位体积的产酸量)可高达1.78g·h-1·L-1。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限 制。
实施例1
在本实施例中，通过以下方法来进行长链二元酸的生产，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii)涂布在20×180mm的大试管固体斜面培养基上，于27℃培养72h，所述斜面培养基为pH＝6.4的麦芽汁琼脂培养基；
(2)种子培养：将活化后的菌种接种于500ml三角瓶中的种子培养基(100mL)上，于27℃，200r/min下振荡培养40h，所述种子培养过程中使用的种子培养基的组成为葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，正十二烷100mL/L，种子培养基的pH为6.0；
(3)发酵产酸：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH 4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为30.6g/L、53.6g/L和40.3g/L；
当控制当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近， 同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为40.4g/L、70.6g/L和60.5g/L；
当控制初始pH8.0，温度27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为28.6g/L、37.3g/L和28.2g/L。
实施例2
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为40.6g/L、88.6g/L和85.2g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV附近，同时 通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为50.4g/L、99.3g/L和87.2g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为31.8g/L、58.3g/L和52.1g/L。
实施例3
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为70.6g/L、120.5g/L和116.3g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近， 当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为80.4g/L、140.6g/L和138.3g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为48.3g/L、78.2g/L和71.9g/L。
实施例4
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为66.3g/L、110.8g/L和105.2g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通 气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为76.4g/L、133.5g/L和130.2g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为37.5g/L、48.6g/L和41.5g/L。
实施例5
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为100.4g/L、150.6g/L和140.2g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量 0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为130.4g/L、170.3g/L和165.2g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于100mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在0mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为96.3g/L、145.2g/L和143.1g/L。
实施例6
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为110.3g/L、160.4g/L和156.3g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为130.5g/L、180.4g/L和170.5g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在100mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为99.5g/L、157.1g/L和150.6g/L。
实施例7
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0 下分别为78.3g/L、116.7g/L和110.2g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为80.4g/L、139.5g/L和132.2g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在0mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为54.5g/L、77.6g/L和56.7g/L。
实施例8
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液 中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为77.6g/L、140.6g/L和120.2g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为110.4g/L、190.3g/L和140.2g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在50mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为110.7g/L、150.2g/L和120.3g/L。
实施例9
本实施例与实施例1不同之处仅在于，发酵产酸过程为：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0， ORP控制在100mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为120.3g/L、170.4g/L和180.3g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV附近，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为150.5g/L、203.2g/L和190.5g/L；
当控制初始pH8.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当ORP低于0mV时逐渐增加搅拌转速(最大不超过1000rpm)、通气量(最大不超过4.0vvm)并添加还原剂或氧化剂，将ORP控制在200mV附近，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，ORP控制在100mV，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为100.3g/L、167.1g/L和160.6g/L。
对比例1
该对比例中，在发酵产酸步骤不进行ORP的调节，其生产长链二元酸的过程与实施例不同之处仅在于：
(3)发酵产酸：将步骤(2)得到的种子培养物以10％的接种量接种至装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中(平行进行三个实验)，控制初始pH 4.0，控制发酵温度在27℃，无菌空气的通气量为0.1vvm，搅拌转速为50rpm，当培养 基中糖类消耗完毕时，进行第二阶段发酵，调节培养基pH至7.0、8.0和9.0，继续进行发酵，同时在发酵过程中通过连续或间歇的方式补加烷烃，使发酵液中烷烃浓度始终大于等于1％，发酵114h，完成发酵，产生长链二元酸。通过测定在pH7.0、8.0和9.0下产酸分别为20.6g/L、40.6g/L和33.1g/L；
当控制初始pH6.0时，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为28.6g/L、44.6g/L和39.1g/L；
当控制初始pH8.0，控制发酵温度在27℃，搅拌转速50rpm，通气量0.1vvm，当葡萄糖消耗完毕时将pH调节至7.0，8.0和9.0，同时通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1％(v/v)，培养114h，产酸在pH7.0、8.0和9.0下分别为18.2g/L、32.7g/L和29.2g/L。
由实施例1-9以及对比例1的结果可以看出，本发明利用菌体、无菌空气、烷烃和水组成的四相发酵体系，在所述发酵体系中引入ORP电极，结合氧化剂和还原剂，以及对搅拌速度的调节可实现长链二元酸的两阶段ORP控制发酵，相比于不进行ORP调节的过程，本发明长链二元酸产量明显提高，可提高4.6倍，生产强度(单位时间单位体积的产酸量)可高达1.78g·h-1·L-1。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种利用氧化还原电位调控生产长链二元酸的方法，其特征在于，所述方法包括菌种活化、种子培养和发酵产酸三个步骤，所述发酵的体系为由菌体、无菌空气、烷烃和水组成的四相发酵体系，在所述发酵体系中引入ORP电极，通过调节通气量、搅拌转速，并结合氧化剂和还原剂，实现长链二元酸的两阶段ORP控制发酵，以生产长链二元酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述长链二元酸为碳原子数为11-18的二元酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵过程利用的微生物菌种为维斯假丝酵母ipe-1(Candida viswanathii ipe-1)，已于2014年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该保藏单位的简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.8824。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述菌种活化时使用的斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基；
优选地，所述述菌种活化为将菌种接种于斜面培养基中，于25-40℃培养24-72h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述种子培养过程中使用的种子培养基为pH 4.0-8.0的含有糖质和烷烃的液体培养基；
优选地，所述种子培养基包括如下组分：糖质15-60g/L，磷酸氢二钠1-3g/L，酵母膏0.5-2g/L，玉米浆1-3g/L，尿素0.1-0.8g/L，烷烃50-120mL/L；
优选地，所述糖质为葡萄糖、蔗糖或半乳糖中的任意一种或至少两种的组合，优选葡萄糖；
优选地，所述烷烃为碳原子数为11-18的正烷烃；
优选地，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，碳原子数11-18的正烷烃100mL/L。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述种子培养为将活化后的菌种接种于种子培养基中，于25-40℃振荡培养20-48h；
优选地，所述发酵产酸步骤中使用的发酵培养基为含有糖质和烷烃的液体培养基；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：糖质10-90g/L，磷酸氢二钠1-5g/L，酵母膏0.5-2g/L，玉米浆1-3g/L，尿素0.1-0.8g/L，NaCl 0.5-3g/L，KCl0.5-2g/L，烷烃150-400mL/L，吐温80 0.5-2g/L。
优选地，所述糖质为葡萄糖、蔗糖或半乳糖中的任意一种或至少两种的组合，优选葡萄糖；
优选地，所述烷烃为碳原子数为11-18的正烷烃；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：葡萄糖30g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏1g/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl 1g/L，KCl 1g/L，碳原子数11-18的正烷烃300mL/L，吐温80 1g/L。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵时的菌种接种量为发酵培养基体积的4-30％；
优选地，所述发酵时的温度为25-40℃；
优选地，所述发酵产酸过程的初始发酵阶段将培养基pH控制为4.0-8.0，当培养基中糖质消耗完毕时，进入第二发酵阶段，调节培养基pH至7.0-9.0；
优选地，在初始发酵阶段，控制ORP为0-200mV；
优选地，在第二发酵阶段，控制ORP为0-100mV；
优选地，在第二发酵阶段通过连续或间歇的方式补加烷烃，使发酵液中烷烃浓度始终大于等于1％；
优选地，第二发酵阶段的发酵时间为60-200h。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，在发酵产酸过程中，向发酵罐中通入无菌空气；
优选地，在发酵产酸过程中，所述无菌空气的通气量为0.1-4.0vvm；
优选地，在发酵产酸过程中，将搅拌转速控制在50-1000rpm。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，在发酵产酸过程中通过调节搅拌转速和通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来控制ORP值；
优选地，所述氧化剂为过氧化氢、硫酸铁或铁氰化钾中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述还原剂为维生素C、硼氢化钠、半胱氨酸或硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)菌种活化：将菌种接种于斜面培养基中，于25-40℃培养24-72h，所述斜面培养基为麦芽汁琼脂培养基；
(2)种子培养：将活化后的菌种接种于种子培养基中，于25-40℃振荡培养20-48h，所述种子培养过程中使用的种子培养基为pH 4.0-8.0的含有糖质和正烷烃的液体培养基；
(3)发酵产酸：将步骤(2)得到的种子培养物以4-30％的接种量接种至发酵培养基上，控制初始pH 4.0-8.0，控制发酵温度在25-40℃，无菌空气的通气量为0.1-4.0vvm，搅拌转速为50-1000rpm，通过在所述搅拌转速范围内调节搅拌转速和在所述通气量范围内调节通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来控制初始发酵阶段ORP值为0-200mV；当培养基中糖类消耗完毕时，进行第二阶段发酵，调节培养基pH至7.0-9.0，通过在所述搅拌转速范围内调节搅拌转速和在所述通气量范围内调节通气量以及添加氧化剂和/或还原剂来控制第二发酵阶段ORP值为0-100mV，继续进行发酵，同时在发酵过程中通过连续或间歇的方式补加烷烃，使发酵液中烷烃浓度始终大于等于1％，发酵60-200h，完成发酵，产生长链二元酸。
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