CN110218745A - 发酵生产长链二元酸的方法及其得到的长链二元酸 - Google Patents

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CN110218745A CN201810169682.7A CN201810169682A CN110218745A CN 110218745 A CN110218745 A CN 110218745A CN 201810169682 A CN201810169682 A CN 201810169682A CN 110218745 A CN110218745 A CN 110218745A
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杨晨
秦兵兵
李乃强
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Abstract

本发明提供发酵生产长链二元酸的方法及其得到的长链二元酸产品，发酵在以下条件下进行：温度为28～32℃，风量为0.3～0.7vvm，压力为0.05～0.14MPa，菌体生长期的pH为3.0以上，转化期的pH为7.0以下。本发明的长链二元酸生产方法具有缩短发酵时间、提高产酸量、减少培养基用量、适用于多种类的长链二元酸生产等诸多优点。与现有生产工艺相比，不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业化价值优势。

Description

发酵生产长链二元酸的方法及其得到的长链二元酸
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体发酵生产长链二元酸的方法及其得到的长链二元酸。
背景技术
长链二元酸(LCDA)的通式为(HOOC(CH2)nCOOH，n≥7)，有着非常广泛的用途，以长链二元酸为原料可以合成特种尼龙、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。长链二元酸通常可以用化学法或生物法来合成。化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。而生物法是以长链烷烃为底物，通过微生物转化得到，其生产过程常温、常压，可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。
生物法生产长链二元酸已经被研究了很多年。学者最早从油田中筛选到能生产长链二元酸的菌株，对菌株进行诱变来提高长链二元酸的产率。有的学者也研究了长链二元酸合成过程中的关键酶。国外研究长链二元酸的文献大多是对菌株进行基因改造，通过阻断或者弱化脂肪酸β氧化的相关酶系，强化脂肪酸α-ω氧化的酶系来提高产品的产率。公开的专利如CN 1071951A、CN 1067725C、CN 1259424C、200410018255.7、200610029784.6等都提供了微生物发酵生产长链二元酸的方法，这些方法都要求在发酵过程中，特别是在产酸期要将发酵液的pH值调整到7.0以上。专利US 6569670B2报道了在pH值5.8的环境下用脂肪酸为原料生产长链二元酸的方法，其主要原因是在pH值7.0以上，脂肪酸会以脂肪酸盐的形式存在，特别容易起泡，导致发酵无法进行，所以必须在较低的pH值下进行发酵，但低pH值下P450酶的活力较低，代谢缓慢，生产效率低。
发明内容
为克服现有长链二元酸生产过程中存在的缺陷，本发明的提供一种发酵生产长链二元酸的方法，所述发酵在以下条件下进行：所述发酵的温度为28～32℃，所述发酵的风量为0.3～0.7vvm，所述发酵的压力为0.05～0.14MPa，所述发酵的菌体生长期的pH为3.0以上，所述发酵的转化期的pH为7.0以下。
本发明的生产方法中，所述发酵过程包括菌体生长期和转化期(即：产酸期)。
本发明的一个优选的技术方案，所述菌体生长期发酵体系的pH值优选为3.5～6.5。
本发明的一个优选的技术方案，所所述转化期发酵体系的pH值优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5。
本发明的一个优选的技术方案，在所述发酵过程中，当菌体光密度(OD620)0.5(稀释30倍)以上时，控制所述发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的温度为29～31℃。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的风量为0.4～0.6vvm。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的压力为0.08～0.12MPa。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的菌种包括热带假丝酵母(CandidaTropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)，优选热带假丝酵母(Candida Tropicalis)(保藏号为CCTCC M203052)，或者热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145(保藏号为CCTCC M 2011192)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4013(保藏号为CCTCCM2011486)，或者热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CAT H1614(保藏号为CCTCC M2013143)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4014(保藏号为CCTCC M2011487)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4012(保藏号为CCTCC M2011485)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4016(保藏号为CCTCC M2011488)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430(保藏号为CCTCC M2011489)。
本发明的一个优选的技术方案，所述菌株的接种量为10％～30％，所述百分比为相对于发酵起始体积的百分比，v/v。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的转化期溶氧不低于15％。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵转化过程在发酵培养基或缓冲溶液中进行。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐。
其中，所述碳源包括：葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；所述碳源的添加量优选1％～10％(w/v)。
其中，所述氮源包括：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；所述氮源的总添加量优选0.1％～3％(w/v)。
其中，所述无机盐包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；所述无机盐的总添加量优选0.1％～1.5％(w/v)。
其中，所述营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；所述营养因子的总添加量优选0～1％(w/v)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～0.9％、酵母膏0.1％～0.5％、硝酸钾0.05％～1.2％、磷酸二氢钾0.05％～1.0％、尿素0.05％～0.3％、硫酸铵0.05％～0.3％以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖1％～5％、硝酸钾0.05％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.6％、硫酸铵0.05％～0.3％以及硫酸镁0.05％～0.3％(w/v)。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵过程可以补加二次碳源，二次碳源补加的方式可以批次补加，也可以连续流加。所述二次碳源为蔗糖或葡萄糖。所述二次碳源的浓度为10％～70％。通过补加二次碳源，控制发酵转化体系中的糖浓度为0.1％～1％(w/v)。
按照发酵领域常识，本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL。
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；优选为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液。当所述转化在缓冲溶液中进行时，具体包括以下步骤：为当菌体生长光密度(OD620)大于0.5(稀释倍数为30倍)，将所述菌体从发酵液中分离出来，加入缓冲液体系，添加底物进行转化。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的底物包括烷烃，优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的起始添加0％～3％的底物。
本发明的一个优选的技术方案，所述菌株培养至菌体稀释三十倍后OD620为大于0.5，加入底物进行发酵转化。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更有选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。
本发明还提供一种长链二元酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按照如上所述的发酵生产长链二元酸的方法，得到长链二元酸发酵液；
(2)步骤(1)得到的发酵液酸化，分离得固形物，再将固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，结晶，得长链二元酸产品。
本发明的一个优选的技术方案，所述酸化的pH优选2.5～5，更优选3～4，可以为2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0。
本发明的一个优选的技术方案，所述酸化为使用硫酸和/或盐酸酸化。
本发明的一个优选的技术方案，所述分离的方法为离心或过滤。
本发明的一个优选的技术方案，有机溶剂包括：醇、酸、酮类和酯的一种多种。其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种。所述酸包括乙酸。所述酮包括丙酮。所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯。
本发明的一个优选的技术方案，所述溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液。所述脱色的方法可以为活性炭脱色。所述活性炭的添加量为不超过清液体积5％。所述脱色的温度为85～100℃。所述脱色的时间为15～165min。
本发明的一个优选的技术方案，所述结晶为降温结晶。所述降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶。
本发明的一个优选的技术方案，所述结晶后，分离，得二元酸产品。所述分离的方法为离心分离。
本发明还提供如所述的方法制得的长链二元酸。
本发明提供的长链二元酸生产方法具有缩短发酵时间、提高产酸量、减少培养基用量、适用于多种类的长链二元酸生产等诸多优点。与现有生产工艺相比，不仅具有显著的成本优势，而且能有效地减轻对资源和环境的压力，因此具有非常明显的工业化价值优势。
具体实施方式
本发明提供一种发酵生产长链二元酸的方法，以长链烷烃为底物，且在以下条件下进行：发酵的温度为28～32℃，风量为0.3～0.7vvm，压力为0.05～0.14MPa，菌体生长期的pH为3.0以上，优选为3.5～6.5，转化期的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5。
本发明的长链二元酸的生产方法包括菌体生长期和发酵转化期(产酸期)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，具体而言，菌体生长期发酵体系的pH值可以为：3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，具体而言，转化期发酵体系的pH值可以为：3，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，发酵时，当菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。
本发明对发酵转化过程中pH值的调节或控制方式没有特别限制，可以是恒控某一pH值、不控制pH值、不低于某pH值、不高于某pH值、上调pH值、下调pH值、从范围外控制进入或自然进入所述pH值范围内的方式中的一种或多种的组合。本发明对于pH值的调控方法亦不做限定，可采用发酵领域的常用手段，如加入适当浓度的碱液。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，发酵的菌种包括热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)，优选热带假丝酵母(Candida Tropicalis)(保藏号为CCTCC M203052)，或者热带假丝酵母(CandidaTropicalis)CATN145(保藏号为CCTCC M 2011192)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4013(保藏号为CCTCC M2011486)，或者热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)CATH1614(保藏号为CCTCC M 2013143)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4014(保藏号为CCTCC M2011487)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4012(保藏号为CCTCCM2011485)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH4016(保藏号为CCTCC M2011488)，或者清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430(保藏号为CCTCC M2011489)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，菌株的接种量为10％～30％。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，发酵转化过程中溶氧不低于15％。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，发酵转化过程可在发酵培养基或缓冲溶液中进行。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，当在培养基中进行发酵转化时，可直接向培养基中加入底物，也可转移发酵罐中加入发酵培养基和底物进行发酵转化。
其中，当于发酵培养基中进行发酵转化时，发酵培养基中的成分可包括碳源、氮源、无机盐、营养因子等。其中，碳源可以为假丝酵母可发酵性糖，包括：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等的一种或多种；氮源可以为有机氮和/或无机氮，有机氮包括：酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或多种，无机氮包括：尿素、硫酸铵、硝酸钾中的一种或多种；无机盐包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，可选用一种水溶液培养基(以下简称“发酵培养基1”)，其按照质量百分比浓度包括以下成分：葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～0.9％、酵母膏0.1％～0.5％、硝酸钾0.05％～1.2％、磷酸二氢钾0.05％～1.0％、尿素0.05％～0.3％、硫酸铵0.05％～0.3％以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)。发酵培养基1可以适用于从几十毫升的摇瓶到几百吨发酵罐规模的发酵生产。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的另一个优选实施方式中，根据发酵体系的pH值的特点，还可选用低营养物浓度的水溶液培养基(以下简称“发酵培养基2”)，其按照质量百分比浓度包括以下成分：葡萄糖1％～5％、硝酸钾0.05％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.6％、硫酸铵0.05％～0.3％以及硫酸镁0.05％～0.3％(w/v)。发酵培养基2减少了一些复杂的成分如玉米浆、酵母膏等，培养基的成分更明确，可以更好地控制发酵指标和产品质量。其可用水配制，在121℃下灭菌20min，冷却到合适温度，作为发酵培养使用。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，发酵转化过程在缓冲溶液中进行；缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；优选为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液。具体包括以下步骤：为当菌体生长光密度(OD620)大于0.5(稀释倍数为30倍)，将所述菌体从发酵液中分离出来，加入缓冲液体系，添加底物(烷烃)进行转化。转化过程控制pH值为7以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，发酵过程中还可以通过补加糖水溶液作为碳源进一步提升发酵转化率。糖水溶液补加的方式可以为批次补加，也可以为连续流加。糖可以是常见的蔗糖或葡萄糖，补加糖水溶液的浓度可以为10％～70％(w/v)。通过补加糖水溶液，可控制发酵转化体系的糖浓度0.1％～1％(w/v)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，当在缓冲溶液中进行发酵转化时：缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；优选为磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲溶液。当在缓冲溶液中进行发酵转化时，可先将培养得到的菌体进行分离，转至缓冲溶液中，并加入底物进行发酵转化，具体包括以下步骤：当菌体生长光密度(OD620)大于0.5(稀释倍数为30倍)，将所述菌体从发酵液中分离出来，加入缓冲液体系，添加底物进行转化。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，发酵的底物包括烷烃，优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中菌株培养至菌体稀释三十倍后OD620为大于0.5，加入底物进行发酵转化。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个实施方式中，长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更有选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一个优选实施方式中，长链二元酸的生产过程可包含以下工艺过程：
种子瓶培养工艺：
取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有YPD液体培养基的种子瓶中，pH自然，28～32℃下，200～250rpm摇床培养1～2天。
种子罐培养工艺：
取摇瓶种子接入装有种子培养基的种子罐中，接种量为10％～30％，接种后发酵体系的起始pH值为6.0～6.8，28～32℃下，通风量0.3～0.7vvm，罐压0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO不低于10％，培养15～30h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为大于0.5，更优为OD620为0.5～1.0。
发酵转化工艺：
将在种子罐培养所得的种子液接种到含有发酵培养基的发酵罐中，接种后起始体积为4～6L，接种量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加0～10％(v/v，相对发酵起始体积，下同)的烷烃，发酵过程控制温度28～32℃，通风量约为0.3～0.7vvm，罐压(表压)约为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。控制发酵液的pH值，发酵起始pH约为5.0～6.8，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为4.0～6.8，优选5.0～6.5，直至发酵结束。在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％，总发酵周期约为100～180小时。可选地，发酵过程中通过补加糖水溶液控制发酵液糖浓度在0.1％～1％(w/v)。
或将种子罐培养所得的种子液离心，将菌体加入含有磷酸盐缓冲溶液的转化罐中，菌体加量10％～30％(v/v，相对发酵起始体积)，过程中批次加入烷烃，控制转化液中烷烃不超过10％，控制温度28～32℃，通风量约为0.3～0.7vvm，罐压(表压)约为0.05～0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧不低于10％。补加10％～40％的液碱控制转化液的pH值4.0～6.8，优选5.0～6.5，直至转化结束，总转化周期约为100～180小时。
本发明的生产方法使用的“种子培养基”是制备微生物种子所需要的培养基，微生物菌种接种于种子培养基，在一定的条件下进行培养，培养成熟后，可以作为进一步扩大培养、发酵所需要的种子。本发明实施例使用的种子培养基是一种水溶液培养基，包含如下成分：蔗糖1％～3％、玉米浆0.15％～1％、酵母膏0.2％～1.5％、KH2PO4 0.4％～1.5％、尿素0.05％～0.5％。
提取工艺：
将发酵液酸化，分离得固形物，再将固形物溶解在有机溶剂中，分离，得清液，结晶，得长链二元酸产品。
本发明所述的长链二元酸(LCDA)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7；优选地，20≥n≥7；更优选地，16≥n≥7。本发明所述的LCDA的实例包括：：壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)、癸二酸(HOOC(CH2)8COOH)、十一碳二元酸(HOOC(CH2)9COOH，1,9-九碳二羧酸或1,11-十一碳二元酸，本发明中标记为“DC11”)、十二碳二元酸(HOOC(CH2)10COOH，1,10-十碳二羧酸或1,12-十二碳二元酸，本发明中标记为“DC12”)、十三碳二元酸(HOOC(CH2)11COOH，1,11-十一碳二羧酸或1,13-十三碳二元酸，本发明中标记为“DC13”)、十四碳二元酸(HOOC(CH2)12COOH，1,12-十二碳二羧酸或1,14-十四碳二元酸，本发明中标记为“DC14”)、十五碳二元酸(HOOC(CH2)13COOH，1,13-十三碳二羧酸或1,15-十五碳二元酸、本发明中标记为“DC15”)、十六碳二元酸(HOOC(CH2)14COOH，1,14-十四碳二羧酸或1,16-十六碳二元酸，本发明中标记为“DC16”)、十七碳二元酸(HOOC(CH2)15COOH，1,15-十五碳二羧酸或1,17-十七碳二元酸，本发明中标记为“DC17”)、十八碳二元酸(HOOC(CH2)16COOH，1,16-十六碳二羧酸或1,18-十八碳二元酸，本发明中标记为“DC18”)等。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在10L发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少110mg/g的十一碳二元酸、至少150mg/g的十二碳二元酸、至少130mg/g的十三碳二元酸、至少150mg/g的十四碳二元酸、至少140mg/g的十五碳二元酸、或至少130mg/g的十六碳二元酸。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在10L发酵罐发酵工艺中，与传统工艺相比，可节约至少60％碱用量；另一些实施例中，可以节约90％左右的碱用量。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在10L发酵罐转化工艺中，可以产生产酸量至少150mg/g的十二碳二元酸，且达到92％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在200M3发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少150mg/g的十二碳二元酸，且达到92％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，可以通过补加二次碳源来提高发酵转化率，可以达到95％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在200M3发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少140mg/g的十三碳二元酸，且达到85％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
在根据本发明的长链二元酸的生产方法的一些实施例中，在450M3发酵罐发酵工艺中，可以产生产酸量至少150mg/g的十二碳二元酸，且达到90％以上的重量转化率(w/w，烷烃转换为二元酸的重量百分比)。
下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
如没有特别说明，实施例所述的浓度均为质量百分比浓度。
本发明实施例采用本领域技术人员熟知的技术，例如中国专利ZL95117436.3公开的测定方法测定发酵液中的二元酸浓度，具体测定过程为：用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉末，将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。
实施例1～6热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在10L发酵罐中发酵生产不同二元酸
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有30mlYPD液体培养基(葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％)的种子瓶中，pH自然，29℃下，220rpm摇床培养1天。取摇瓶种子接入装有5L种子培养基(蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.8％，尿素0.3％)的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.0，29℃下，通风量0.4vvm，罐压0.08MPa，培养18h，培养过程中pH自然下降至3，OD620长至0.7时接种到含有发酵培养基1(葡萄糖4％、玉米浆0.5％、酵母膏0.4％、硝酸钾1％、磷酸二氢钾0.1％、尿素0.12％、硫酸铵0.06％以及氯化钠0.1％)的发酵罐中，接种后起始体积为5L，接种量20％，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.12MPa，控制溶氧不低于20％。补加30％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为5.0，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％，总发酵周期为155小时。
实施例1～6分别为：按上述发酵工艺将十一碳烷烃(实施例1)、十二碳烷烃(实施例2)、十三碳烷烃(实施例3)、十四碳烷烃(实施例4)、十五碳烷烃(实施例5)、十六碳烷烃(实施例6)进行发酵制得相应的长链二元酸，产量结果如表1。
表1热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT H1614的发酵结果
由表1结果可知，本发明的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在低pH值下发酵长链烷烃可制备相应的长链二元酸，且产量较高。
实施例7热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在10L发酵罐中发酵生产长链二元酸
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有25mLYPD液体培养基(葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％)的种子瓶中，pH自然，30℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有6L种子培养基(蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.8％，尿素0.3％)的10L种子罐中，接种量为20％，接种后体系的起始pH值为6.2，30℃下，通风量0.5vvm，罐压0.1MPa，培养20h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.6时接种到含有发酵培养基1(葡萄糖2％、玉米浆0.2％、酵母膏0.2％、硝酸钾0.08％、磷酸二氢钾0.3％、尿素0.2％、硫酸铵0.1％以及氯化钠0.1％)的发酵罐中，接种后起始体积为6L，接种量15％，发酵起始添加6％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.11MPa，控制溶氧不低于20％，补加32％的液碱控制发酵液的pH值。发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.6，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH 5.5，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。发酵周期135h，产酸162mg/g，转化率92％。
对比例1热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在10L发酵罐中，采用传统工艺发酵生产长链二元酸
种子罐培养成熟的热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614种子接种到含发酵培养基(葡萄糖3％、磷酸二氢钾0.5％、酵母膏0.2％、玉米浆0.15％、尿素0.25％、氯化钠0.2％、硝酸钾0.7％)的发酵罐中，C12烷烃和补料糖分消。于29℃通气量0.5vvm、罐压0.1Mpa条件下培养。发酵前20小时pH自然，以菌体生长为主，当菌体生长光密度(OD)大于0.6，开始批式补加C12烷烃，此后每8小时补加一次，控制发酵液中烷烃浓度维持在5％(V:V)左右，同时调节pH至6.5，48小时以后，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.0，48～72小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.5，72～120小时，每4小时用NaOH溶液调节pH至7.8，120小时至放罐，每4小时用NaOH溶液调节pH至8.0。发酵至24、48、72小时批式补加1％(W:V)的葡萄糖。发酵周期170h，产酸102mg/g，转化率55％。
实施例8热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145在10L发酵罐中发酵生产长链二元酸
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CATN145的甘油管菌种接种于装有25mLYPD液体培养基(葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％)的种子瓶中，pH自然，30℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有6L种子培养基(蔗糖2％，玉米浆0.3％，酵母膏0.5％，KH2PO4 0.8％，尿素0.3％)的10L种子罐中，接种量为20％，接种后体系的起始pH值为6.2，30℃下，通风量0.5vvm，罐压0.1MPa，培养20h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.6时接种到含有发酵培养基1(葡萄糖2％、玉米浆0.2％、酵母膏0.2％、硝酸钾0.08％、磷酸二氢钾0.3％、尿素0.2％、硫酸铵0.1％以及氯化钠0.1％)的发酵罐中，接种后起始体积为6L，接种量15％，发酵起始添加6％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.4vvm，罐压(表压)约为0.11MPa，控制溶氧不低于20％，补加32％的液碱控制发酵液的pH值。发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.6，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH 5.5，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。发酵周期143h，产酸151mg/g，转化率91％。
取实施例7和对比例1中的发酵液离心或过滤，去除固形物，得上清液，取上清液，置于烘干恒重后的玻璃蒸发皿中，水浴蒸干。如果残渣有颜色，滴加过氧化氢至气泡消失，再水浴蒸干，反复处理几次，直至颜色变白或颜色稳定不变为止。将蒸干的蒸发皿烘干至恒重，称重。计算发酵液中的盐含量。
取实施例7和对比例1中的发酵液，加硫酸调pH至3.0，去除固形物后，得清液为发酵处理液，取发酵处理液于烘干恒重后的玻璃蒸发皿中，水浴蒸干。如果残渣有颜色，滴加过氧化氢至气泡消失，再水浴蒸干，反复处理几次，直至颜色变白或颜色稳定不变为止。将蒸干的蒸发皿烘干至恒重，称重。计算发酵处理液中的盐含量。结果如表3所示。
表3不同工艺下发酵的发酵液和发酵处理液中的盐含量
工艺 发酵液中盐含量(％) 发酵处理液中盐含量(ppm)
实施例7 8.8 6100
对比例1 / 68750
实施例7中，发酵液中的盐主要是无机盐，其相对于长链二元酸的含量很低；对比例1中，发酵液中的盐主要是长链二元酸的盐，其相对于长链二元酸的量为大于100％，需要得到长链二元酸，必须进行酸化结晶，因此需要加入大量无机盐，导致发酵处理液中盐含量远大于本发明的发酵处理液中盐含量。发酵液中盐含量为相对于长链二元酸的质量百分比。
发酵处理液中盐含量为盐占长链二元酸发酵处理液的质量百万分比。
由表3结果可知，本发明在酸性条件下发酵，所得发酵液和发酵处理液中中盐含量有非常明显的下降，可显著减轻后续的纯化工艺，由此带来生产成本和环境压力的降低。
实施例9热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在10L罐中烷烃转化实验
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，pH自然，29℃下，230rpm摇床培养1天。取摇瓶种子接入装有种子培养基(蔗糖2％、玉米浆0.3％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.8％、尿素0.3％)的种子罐中，接种量为20％，接种后发酵体系的起始pH值为6.4，29℃下，通风量0.4vvm，罐压0.09MPa，控制种子培养过程的DO不低于10％，培养15～30h。OD620长至0.8时，将种子液离心，将菌体加入含有5LpH 6.2磷酸盐缓冲溶液的转化罐中，菌体加量25％(v/v，相对发酵起始体积)，过程中批次加入烷烃，控制转化液中烷烃不超过10％，控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.12MPa，控制溶氧不低于10％，补加28％的液碱控制转化液的pH值6.2，直至转化结束，总转化周期为134小时，产酸152mg/g，二元酸对烷烃重量转化率92.4％。
实施例10热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在200M3发酵罐中发酵DC12
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基(蔗糖2％、玉米浆0.3％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.8％、尿素0.3％)的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.3，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖4％、硝酸钾0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸铵0.1％以及硫酸镁0.1％)的发酵罐中，接种量22％，发酵起始添加4％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为33％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.7，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.0，开始流加浓度为25％的糖溶液，控制发酵液糖浓度0.5％。在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期122h，产酸182.3mg/g，二元酸对烷烃重量转化率100.4％。
实施例11热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在200M3发酵罐中发酵DC13
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基(蔗糖2％、玉米浆0.3％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.8％、尿素0.3％)的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.5，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖3.8％、硝酸钾0.12％、磷酸二氢钾0.12％、硫酸铵0.12％以及硫酸镁0.12％)的发酵罐中，接种量25％，发酵起始添加4％(v/v，相对发酵起始体积)的十三碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为30％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.6，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.5，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期132h，产酸147.3mg/g，二元酸对烷烃重量转化率85.4％。
实施例12热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614在450M3发酵罐中发酵DC12
取热带假丝酵母(Candida Tropicalis)CAT H1614的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基(蔗糖2％、玉米浆0.3％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.8％、尿素0.3％)的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.2，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖3.3％、硝酸钾0.15％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸铵0.15％以及硫酸镁0.15％)的发酵罐中，接种量23％，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为33％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.2，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期142h，产酸160.8mg/g，二元酸对烷烃重量转化率90.8％。
实施例13清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430在10L发酵罐中发酵DC12
取清酒假丝酵母(Candidasake)CATH430的甘油管菌种接种于装有YPD培养基的种子瓶中，pH自然，28℃下，230rpm摇床培养2天。取摇瓶种子接入装有种子培养基(蔗糖2％、玉米浆0.3％、酵母膏0.5％、KH2PO4 0.8％、尿素0.3％)的种子罐中，接种量为10％，接种后体系的起始pH值为6.2，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.11MPa，培养25h，培养过程中pH自然下降至3。OD620长至0.8时接种到含有发酵培养基2(葡萄糖3.3％、硝酸钾0.15％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸铵0.15％以及硫酸镁0.15％)的发酵罐中，接种量23％，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的十二碳烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，控制溶氧不低于20％。补加浓度为33％的液碱控制发酵液的pH值，发酵前期主要以菌体生长为主，发酵起始pH约为6.5，随着微生物的生长，发酵液的pH逐步下降，控制pH不低于3.0，待菌体光密度(OD620)大于0.5(稀释30倍)时，控制pH约为6.2，直至发酵结束，在发酵周期为10～20小时时开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量不超过10％。总发酵周期141h，产酸160.4mg/g，二元酸对烷烃重量转化率90.2％。
实施例14
长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
将实施例11制得的发酵液，硫酸调节pH至pH3，进行酸化，离心分离得固形物，再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在90℃条件下脱色60min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1.5h，再降温至30℃，结晶；离心分离得二元酸产品。
实施例15
长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
将实施例12制得的发酵液，硫酸调节pH至pH3.5，进行酸化，离心分离得固形物，再将固形物溶解在乙醇中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在95℃条件下脱色75min，过滤分离得清液，将清液降温至80℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得二元酸产品。
实施例16
长链二元酸的制备方法，包括以下步骤：
将实施例13制得的发酵液，硫酸调节pH至pH3.2，进行酸化，过滤得固形物，再将固形物溶解在醋酸中，加入不超过清液体积5％的活性炭，在85℃条件下脱色70min，过滤分离得清液，将清液降温至65℃保温1h，再降温至35℃，结晶；离心分离得二元酸产品。
对比例4热带假丝酵母H5343ALK2-1发酵生产DC13
培养基(包括：葡萄糖27.0g/L，硫酸铵7.0g/L，磷酸二氢钾5.1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸0.06g/L，三氯化铁0.023g/L，生物素0.0002g/L，痕量金属：硼酸0.0009g/L，硫酸铜0.00007g/L，碘化钾0.00018g/L，三氯化铁0.00036g/L，硫酸锰0.00072g/L，钼酸钠0.00036g/L，硫酸锌0.00072g/L，SAG471抗泡剂0.8ml，水余量)以适当的方式进行加热灭菌以便避免发生沉淀反应，冷却后被加到灭菌的发酵罐中。未接种的完全培养基被发现非常清澄且是浅稻草色，没有强烈的气味。加入抗泡剂后产生轻微的浑浊。在无菌条件下利用上述培养基，通过对初始液体体积为12L的发酵罐进行搅拌、通气来培养热带假丝酵母H5343ALK2-1。所述无菌培养基被接种5％的热带假丝酵母H5343ALK2-1的接种物并在35℃，pH5.8和通气速率足以使溶氧保持在20％以上的条件下搅拌培养大约10小时。当所述培养物终止指数生长时，溶氧开始上升，转化期通过以下方式来启动：以0.7g/L/小时的速率开始连续补加Exxon DevelopmentalFluid137的原料流(一种含有约94.4％十三烷的碳氢化合物、其余主要是十二烷)，该原料流与发酵辅助成分1.25％Emersol 267(一种技术等级的油酸)和1.25％Emery 2203(一种技术等级的甲基油脂(tallowate))混合。与此同时，发酵罐中的温度由35℃降至30℃，通气速率降至0.4vvm，以及对罐施加了0.4巴的反压力。在生长期和转化期利用6N的KOH将PH维持在5.8-5.9之间。当生物物质浓度达到约10g/L时，开始以1.58g葡萄糖/L/小时的速率向发酵罐连续补加葡萄糖。根据每天显微镜的观察结果和对酵母细胞内积累的贮存泡的评估，将转化期中所述葡萄糖的补加速率降低到0-15％。在转化期中向发酵罐加入7ml的PPG(聚丙二醇)抗泡剂来控制轻微的泡沫。转化期进行50小时后，发酵罐中的全部发酵液中含有41.5g/Kg(即：41.5mg/g)的1，13-十三烷二酸(1，13-tridecanedioicacid)。
对比例5热带假丝酵母H5343HDC23-3发酵生产混合长链二元酸
培养基(包括：葡萄糖27.0g/L，磷酸二氢钾4.9g/L，硫酸镁0.6g/L，氯化钙0.1g/L，柠檬酸0.06g/L，三氯化铁0.023g/L，生物素0.000012g/L，微量金属：硫酸铜0.00007g/L，硫酸锰0.00432g/L，硫酸锌0.00072g/L，柠檬酸盐0.00708g/L，SAG471抗泡剂0.6ml，水余量)以适当的方式进行灭菌以便避免发生任何沉淀反应，然后被加到灭菌的发酵罐中。未接种的完全培养基被发现非常清澄且是浅稻草色，没有强烈的气味。在无菌条件下利用上述培养基，通过对初始液体体积为12L的发酵罐进行搅拌、通气来培养热带假丝酵母H5343HDC23-3。所述无菌培养基被接种上3％的热带假丝酵母H5343HDC23-3的接种物并在35℃和通气速率足以使溶氧保持在20％以上的条件下搅拌培养大约12小时。通过添加6N的NH4OH将生长期的pH调节和维持在5.8-5.9，所述NH4OH也是培养基中的无机氮源。当所述培养物终止指数生长时，溶氧开始上升，转化期通过添加一种诱导物质启动并且同时开始以2.0g/L/小时的速率连续补加油含量高的向日葵脂肪酸的原料流(含有84.4％油酸，5.2％亚油酸，4.7％硬脂酸，3.9％棕榈酸，以及含有少量的二十烷酸(20∶0)，eicosaenoicacid(20∶1)，十五烷酸，月硅酸，十四烷酸的其余物质)。与此同时，发酵罐中的温度由35℃降至30℃，通气速率降至0.4vvm，以及将pH调控试剂NH4OH换成NaOH。利用6NNaOH将转化期的pH调节和维持在5.8-5.9。当生物物质浓度达到约10g/L时，开始以1.22g葡萄糖/L/小时的速率向发酵罐连续补加葡萄糖。根据每天显微镜的观察结果和对酵母细胞内积累的贮存泡的评估，将转化期中所述葡萄糖的补加速率降低到0-45％。在转化期中不添加抗泡剂。转化期进行50小时后，发酵罐中的全部发酵液中含有71g/Kg(即：71mg/g)的总二羧酸。
基于前述实施例可知，相对于现有发酵工艺，本发明提供的假丝酵母菌用于长链二元酸发酵时，发酵时间短，二元酸产量高，减少了物料消耗，能从整体上大幅降低长链二元酸的生产成本，且环境友好。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的范围和精神的前提下，可对其进行各种修改和变动，上述各项技术特征之间的组合及根据上述内容所完成的其它技术方案改变均属本发明范围。

Claims (10)

1.一种发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于：所述发酵在以下条件下进行：所述发酵的温度为28～32℃，所述发酵的风量为0.3～0.7vvm，所述发酵的压力为0.05～0.14MPa，所述发酵的菌体生长期的pH为3.0以上，优选3.5～6.5，所述发酵的转化期的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选5.0～6.5。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述发酵过程中，当稀释30倍后的菌体光密度OD620为0.5以上时，控制所述发酵体系的pH为7.0以下，优选4.0～6.8，更优选为5.0～6.5。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵的菌种包括：热带假丝酵母(Candida Tropicalis)或清酒假丝酵母(Candidasake)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵的培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐；其中，所述碳源包括：葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；所述碳源的添加量优选1％～10％(w/v)；所述氮源包括：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；所述氮源的总添加量优选0.1％～3％(w/v)；所述无机盐包括：磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；所述无机盐的总添加量优选0.1％～1.5％(w/v)；所述营养因子包括：维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；所述营养因子的总添加量优选0～1％(w/v)。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基优选包括以下成分：葡萄糖1％～5％、玉米浆0.1％～0.9％、酵母膏0.1％～0.5％、硝酸钾0.05％～1.2％、磷酸二氢钾0.05％～1.0％、尿素0.05％～0.3％、硫酸铵0.05％～0.3％以及氯化钠0.05％～0.2％(w/v)；
或者所述发酵培养基优选包括以下成分：葡萄糖1％～5％、硝酸钾0.05％～0.6％、磷酸二氢钾0.02％～0.6％、硫酸铵0.05％～0.3％以及硫酸镁0.05％～0.3％(w/v)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵的底物包括烷烃，优选C9～C22的正烷烃，更优选包括C9～C18的正烷烃，最优选包括C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16的正烷烃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述长链二元酸包括C9～C22的长链二元酸，优选包括C9～C18的长链二元酸，更有选包括癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸中的一种或多种。
8.一种长链二元酸的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)按照如权利要求1～7任一项所述的发酵生产长链二元酸的方法，得到长链二元酸发酵液；
(2)步骤(1)得到的发酵液酸化，分离得固形物，再将固形物溶解在有机溶剂中，分离得清液，结晶，得长链二元酸产品。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述酸化的pH优选2.5～5，更优选3～4；
和/或，所述分离的方法为离心或过滤；
和/或，所述有机溶剂包括：醇、酸、酮类和酯的一种多种；其中，所述醇包括甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇中的一种或多种；所述酸包括乙酸；所述酮包括丙酮；所述酯包括乙酸乙酯和/或乙酸丁酯；
和/或，所述溶解在有机溶剂后，脱色，再分离得清液；所述脱色的方法优选活性炭脱色；所述活性炭的添加量为不超过清液体积5％；所述脱色的温度为85～100℃；所述脱色的时间为15～165min；
和/或，所述结晶为降温结晶；所述降温结晶包括以下步骤：降温至65～80℃，保温1～2小时后，再降温至25～35℃，结晶；
和/或，所述结晶后，分离，得二元酸产品；所述分离的方法为离心分离。
10.如权利要求8或9所述的制备方法制得的长链二元酸。
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