CN109868294A - 一种连续发酵生产长链二元酸的方法 - Google Patents

一种连续发酵生产长链二元酸的方法 Download PDF

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徐敏
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Abstract

本发明公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法，在发酵100‑150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。本发明的方法在不增加任何设备的基础上保证菌体长期活性，从而保证长链二元酸的持续生产，使得长链二元酸产率大幅度增加，得率也有所增加。

Description

一种连续发酵生产长链二元酸的方法
技术领域
本发明涉及一种连续发酵生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸(LDCA，HOOC(CH2)nCOOH，n≥7)应用领域广泛，以其为原料可以合成特种尼龙(聚酰胺)、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。
一般而言，长链二元酸可以用化学合成法或生物发酵法生产得到。化学合成方法合成路线长，反应条件严格，需要在高温高压条件下进行，并且对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上，以化学法合成的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。生物发酵法以长链烷烃为底物，通过微生物发酵转化得到长链二元酸；其生产过程在常温、常压条件下进行，并且可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。因此，长链二元酸的生物发酵法生产相较于化学合成法而言，其优势是不言而喻的。
目前，针对生物发酵法生产长链二元酸已经有一定的研究基础。例如，研究初期，通过对油田中筛选得到的生产长链二元酸的菌株进行诱变来提高长链二元酸的产率；再例如，通过对长链二元酸合成过程中的关键酶(例如P450单加氧酶、FAO醇氧化酶、FaldDH醛脱氢酶等)的研究来提高长链二元酸的产率。国外对长链二元酸菌株的研究大多集中在对菌株进行基因改造，通过阻断或者弱化脂肪酸β氧化相关酶系，强化脂肪酸α-ω氧化酶系来提高产品的产率。在专利报道方面，CN91109895.X、CN98121084.8、CN200310104982.0、CN200410018255.7，CN200610029784.6都提供了微生物发酵生产长链二元酸的方法。专利CN201410065873.0与CN201410067073.2公布了利用膜分离菌体进行偶联发酵生产长链二元酸的技术。还有一些报道公开了串罐操作发酵生产长链二元酸的方法等。专利CN201510802343.4虽然公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置，但是其发酵液不仅需要增加膜过滤装置而且与种子罐进行偶联，通过定期补新鲜的种子液实现连续发酵过程，不仅增加了成本，而且增加了染菌风险。
发明内容
本发明提供一种连续发酵生产长链二元酸的方法，本发明的方法在不增加任何设备的基础上保证菌体长期活性，从而保证长链二元酸的持续生产，使得长链二元酸产率大幅度增加，得率也有所增加。
本发明的目的之一，一种连续发酵生产长链二元酸的方法，在发酵100-150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。
以下对上述技术方案的进一步优选的技术方案，进行进一步说明。
本发明的一个优选的技术方案，所述流加底物前，控制所述发酵液中底物含量为2％(v/v)以上，所述百分比为所述底物占发酵液的体积百分比。
长链二元酸连续发酵的难点之一在于，如何保证在长时间的发酵过程中，保持菌体活性和持续产酸，并保证高的二元酸产酸速度、产量和得率。发明人经过大量研究，发现使用特定成分的含营养盐的溶液，能够实现很好的效果。由此得到本发明的一个优选的技术方案。
本发明的一个优选的技术方案，所述含营养盐的溶液包括以下各成分：葡萄糖0.0％-1.0％(w/v)、玉米浆0.05％-0.15％(w/v)、酵母膏0.0％-0.3％(w/v)、磷酸二氢钾0.005％-0.015％(w/v)、尿素0.005％-0.015％(w/v)和硫酸铵0.01％-0.15％(w/v)，其余为水；所述百分比为质量体积比，即：各成分占溶液的质量体积比，发酵领域技术人员均知道，该质量体积比为g/100mL。
另一方面，底物的流加速率和含营养盐的溶液的流加速率，对菌体活性、二元酸产酸速度、产量和得率等持续产酸的效果，也有积极的作用，保证二者达到一定平衡，能够实现优异的效果。
本发明的一个优选的技术方案，所述底物的流加速率和所述含营养盐的溶液的流加速率满足以下关系：
0.3*V(底物)+18.5≤V(含营养盐的溶液)≤0.5*V(底物)+46
其中，所述V(底物)为底物的流加速度，所述V(含营养盐的溶液)为含营养盐的溶液的流加速度。
本发明的一个优选的技术方案，所述底物的流加速率V(底物)为2-5mL/L/h。
本发明的一个优选的技术方案，所述含营养盐的溶液的流加速率V(含营养盐的溶液)为0.5-3mL/L/h。
进一步的，稀释率对菌体活性、二元酸产酸速度、产量和得率等持续产酸的效果，也有一定影响。在常规稀释率条件下，可以实现本发明的连续发酵生产长链二元酸的效果，如果对稀释率进行进一步的优化，则菌体活性和产酸量都会有更大的进步空间。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时的稀释率0.001-0.006h-1，优选0.0016-0.0054h-1。
进一步，菌体浓度是影响菌体活性、二元酸产酸速度、产量和得率等持续产酸的效果的另一个指标。在常规菌体浓度条件下，可以实现本发明的连续发酵生产长链二元酸的效果，如果对菌体浓度进行进一步的优化，则菌体活性和产酸量进一步增加。
本发明的一个优选的技术方案，所述发酵所使用的菌株为热带假丝酵母，例如可以为：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614，其保藏编号为CCTCC M2015303。
本发明的一个优选的技术方案，所述底物包括C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种。
本发明的一个优选的技术方案，所述长链二元酸包括：化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7，包括但不限于：壬二酸(HOOC(CH2)7COOH)、癸二酸(HOOC(CH2)8COOH)、十一碳二元酸(HOOC(CH2)9COOH，1,9-九碳二羧酸或1,11-十一碳二元酸，本发明中标记为“DC11”)、十二碳二元酸(HOOC(CH2)10COOH，1,10-十碳二羧酸或1,12-十二碳二元酸，本发明中标记为“DC12”)、十三碳二元酸(HOOC(CH2)11COOH，1,11-十一碳二羧酸或1,13-十三碳二元酸，本发明中标记为“DC13”)、十四碳二元酸(HOOC(CH2)12COOH，1,12-十二碳二羧酸或1,14-十四碳二元酸，本发明中标记为“DC14”)、十五碳二元酸(HOOC(CH2)13COOH，1,13-十三碳二羧酸或1,15-十五碳二元酸、本发明中标记为“DC15”)、十六碳二元酸(HOOC(CH2)14COOH，1,14-十四碳二羧酸或1,16-十六碳二元酸，本发明中标记为“DC16”)、十七碳二元酸(HOOC(CH2)15COOH，1,15-十五碳二羧酸或1,17-十七碳二元酸，本发明中标记为“DC17”)和十八碳二元酸(HOOC(CH2)16COOH，1,16-十六碳二羧酸或1,18-十八碳二元酸，本发明中标记为“DC18”)中的一种或多种。
本发明的一个优选的技术方案，所述连续发酵方法中发酵液体积为发酵罐体积的50-80％。例如：使用30L发酵罐进行连续发酵时，通过底物和含营养盐的溶液的进料速率，以及出料速率，维持发酵罐中发酵液体积为15-22L。
本发明的目的之二，一种长链二元酸的生产方法，所述生产方法包括如上所述的连续发酵生产长链二元酸的方法。
本发明的一个优选的技术方案，在连续发酵生产长链二元酸之前，还进行以下操作：
将种子液接种到发酵培养基中，进行间歇式补料发酵，在发酵开始10-100h，加入底物，保证发酵液中底物含量为2v/v％以上，所述百分比为所述底物占发酵液的体积百分比。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述接种后的起始体积为发酵罐体积的30％-50％(v/v)，所述百分比为培养基的体积占发酵罐体积的百分比。例如，当发酵罐为30L的发酵罐时，起始体积为10-15L。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的接种量为10％-30％(v/v)，所述百分比为相对于发酵起始体积的体积百分比。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时的菌体浓度OD620为9-24(稀释30倍的测得值为0.3-0.8)。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述加入底物可以为批次加入底物。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的温度为28-32℃。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的通风量为0.3-0.7vvm。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的罐压为0.05-0.14MPa，所述压力为表压。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵起始添加0-10％(v/v)的底物，所述百分比为相对于发酵起始体积的体积百分比。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵时进行搅拌。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的溶氧量为10％以上。
其中，本发明的一个优选的技术方案，所述发酵的pH值为7-8.5。
本发明的连续发酵生产长链二元酸的方法及包括其的长链二元酸的生产方法，在不增加任何设备的基础上保证菌体长期活性，从而保证长链二元酸的持续生产，使得长链二元酸产率大幅度增加，得率也有所增加。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细说明，以使本发明的特征和优点更清楚。但应该指出，实施例用于理解本发明的构思，本发明的范围并不仅仅局限于本文中所列出的实施例。
本发明中，测定培养液中的二元酸浓度，可以采用本领域技术人员熟知的技术，例如中国专利ZL95117436.3公开的测定方法。具体来说，用盐酸溶液调节发酵液的pH到3.0，然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸，再采用蒸发以去除乙醚，得到二元酸粉末；将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中，并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定，最终得到发酵液中的二元酸滴定量。
在本发明中，除非特别指出，在组分、反应条件、浓度等参数中使用“大约”来修正数值。因此在说明书和权利要求书中的数值参数是一个近似值，取决于本发明所期望的性能。至少，不应认为是对本发明权利要求保护的等同原则应用的限制。至少，每个参数的数值运用四舍五入，根据记载的有效数字的位数来确定。虽然在具体实施例中的数值尽可能做到准确，但是由于实验测试方法的系统误差必然导致任何数据都会有一定的误差。
1菌株
本发明所用菌株为一株热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614，其保藏编号为CCTCC M 2015303。
2培养基
本发明所用主要有三种培养基。
种子培养基：蔗糖1％-3％、玉米浆0.15％-1％、酵母膏0.2％-1.5％、KH2PO40.4％-1.5％、尿素0.05％-0.5％。
发酵培养基：葡萄糖1％-5％、玉米浆0.1％-0.9％、酵母膏0.1％-0.5％、硝酸钾0.05％-1.2％、磷酸二氢钾0.05％-1.0％、尿素0.05％-0.3％、硫酸铵0.05％-0.3％以及氯化钠0.05％-0.2％。
补料培养基：补料培养基有两种，一种为底物；一种为含营养盐的溶液(葡萄糖0.0％-1.0％，玉米浆0.05％-0.15％，酵母膏0.0％-0.3％，磷酸二氢钾0.005％-0.015％，尿素0.005％-0.015％，硫酸铵0.01％-0.15％，其余为水；百分比为质量体积比，g/100mL)。
培养基均在121℃下灭菌20min备用。
3培养方法
3.1摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量50-100mL)，初始pH为6.0-6.5，28-32℃下，200-250rpm摇床培养1-2天。
3.2种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5-8L)，接种量为10％-30％，28-32℃下，通风量0.3-0.7vvm，罐压0.05-0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养15-30h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.5-1.0。
4发酵方法
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为10-15L，接种量10％-30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加0-10％(v/v，相对发酵起始体积)的底物(例如可以为烷烃)，发酵过程控制温度28-32℃，通风量约为0.3-0.7vvm，罐压(表压)约为0.05-0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加10％-40％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为10-100h批次加入底物，控制发酵液中底物含量不低于2％。
在发酵100-150h后，开始连续流加底物，流加速率为2-5mL/L/h，同时开始流加含营养盐的溶液，流加速率为0.5-3mL/L/h，控制菌浓OD620在0.3-0.8之间(稀释30倍)，控制出料速率使得发酵液体积维持在15-22L。
实施例1
种子培养基：蔗糖3.0％、玉米浆0.60％、酵母膏1.0％、KH2PO41.2％、尿素0.30％。
发酵培养基：葡萄糖3.0％、玉米浆0.60％、酵母膏0.30％、硝酸钾1.1％、磷酸二氢钾0.80％、尿素0.20％、硫酸铵0.15％以及氯化钠0.10％。
补料培养基有两种：一种为碳十一烷烃；一种为含营养盐的溶液(葡萄糖0.2％，酵母膏0.1％，玉米浆0.15％，磷酸二氢钾0.012％，尿素0.015％，其余为水；百分比为质量体积比，g/100mL)。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量50mL)，初始pH为6.3，29℃下，220rpm摇床培养1.5天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量6L)，接种量为20％，补加25％的液碱控制pH为7.2，29℃下，通风量0.6vvm，罐压0.10MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养20h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.6。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为15L，接种量25％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加30％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为25h开始批次加入碳十一烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
在发酵125h开始连续流加碳十一烷烃，流加速率为1.6mL/L/h，同时开始流加含营养盐的溶液，流加速率为1.4mL/L/h，OD620控制为0.55(稀释30倍)，控制出料速率使得发酵液体积维持在18L，稀释率为0.003h-1。
连续发酵周期为300h，总发酵周期为425h，平均产酸速率为1.5g/L/h，总得率为93％(g/g)。
对比例1
种子培养基：蔗糖3.0％、玉米浆0.60％、酵母膏1.0％、KH2PO41.2％、尿素0.30％。
发酵培养基：葡萄糖3.0％、玉米浆0.60％、酵母膏0.30％、硝酸钾1.1％、磷酸二氢钾0.80％、尿素0.20％、硫酸铵0.15％以及氯化钠0.10％。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量50mL)，初始pH为6.3，29℃下，220rpm摇床培养1.5天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量6L)，接种量为20％，补加25％的液碱控制pH为7.2，29℃下，通风量0.6vvm，罐压0.10MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养20h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.6。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为15L，接种量25％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加5％(v/v，相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度29℃，通风量约为0.5vvm，罐压(表压)约为0.10MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加30％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为25h开始批次加入碳十一烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
发酵160h后，菌体活力大幅下降，在发酵165h时停罐，平均产酸速率为1.2g/L/h，总得率为89％(g/g)。
由实施例1和对比例1的对比可知：由于连续流加烷烃和营养盐，产酸速率从1.2g/L/h提高至1.5g/L/h，提高了25％，总得率从89％提高至93％。
实施例2
种子培养基：蔗糖1％、玉米浆0.30％、酵母膏0.6％、KH2PO40.8％、尿素0.25％。
发酵培养基：葡萄糖2.0％、玉米浆0.20％、酵母膏0.25％、硝酸钾0.05％、磷酸二氢钾0.07％、尿素0.15％、硫酸铵0.20％以及氯化钠0.12％。
补料培养基有两种：一种为碳十二烷烃；一种为含营养盐的溶液(酵母膏0.1％，硫酸铵0.05％，玉米浆0.05％，磷酸二氢钾0.008％，尿素0.01％，其余为水；百分比为质量体积比，g/100mL)。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量60mL)，初始pH为6.5，32℃下，250rpm摇床培养1天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5L)，接种量为10％，补加40％的液碱控制pH为7.5，32℃下，通风量0.5vvm，罐压0.05MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养15h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.8。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为10L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度32℃，通风量约为0.7vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加40％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为10h开始批次加入碳十二烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
在发酵100h开始连续流加碳十二烷烃，流加速率为2.5mL/L/h，同时开始流加含营养盐的溶液，流加速率为0.5mL/L/h，控制OD620为0.4(稀释30倍)，控制出料速率使得发酵液体积维持在20L，稀释率为0.003h-1。
连续发酵周期为400h，总发酵周期为500h，平均产酸速率为2.1g/L/h，总得率为100％(g/g)。
对比例2
种子培养基：蔗糖1％、玉米浆0.30％、酵母膏0.6％、KH2PO40.8％、尿素0.25％。
发酵培养基：葡萄糖2.0％、玉米浆0.20％、酵母膏0.25％、硝酸钾0.05％、磷酸二氢钾0.07％、尿素0.15％、硫酸铵0.20％以及氯化钠0.12％。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量60mL)，初始pH为6.5，32℃下，250rpm摇床培养1天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5L)，接种量为10％，补加40％的液碱控制pH为7.5，32℃下，通风量0.5vvm，罐压0.05MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养15h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.8。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为10L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加10％(v/v，相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度32℃，通风量约为0.7vvm，罐压(表压)约为0.05MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加40％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为10h开始批次加入碳十二烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
发酵170h后，菌体活力大幅下降，在发酵180h时停罐，平均产酸速率为1.5g/L/h，总得率为87％(g/g)。
由实施例2和对比例2的对比可知：由于连续流加烷烃和营养盐，产酸速率从1.5g/L/h提高至2.1g/L/h，提高了40％，总得率从87％提高至100％。
实施例3
种子培养基：蔗糖3％、玉米浆1％、酵母膏0.2％、KH2PO40.9％、尿素0.5％。
发酵培养基：葡萄糖5％、玉米浆0.7％、酵母膏0.3％、硝酸钾0.55％、磷酸二氢钾0.60％、尿素0.20％、硫酸铵0.20％以及氯化钠0.15％。
补料培养基有两种：一种为碳十三烷烃；一种为含营养盐的溶液(葡萄糖0.5％，硫酸铵0.15％，玉米浆0.10％，磷酸二氢钾0.008％，尿素0.007％，其余为水；百分比为质量体积比，g/100mL)。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量100mL)，初始pH为6.0，30℃下，200rpm摇床培养2天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量8L)，接种量为30％，补加10％的液碱控制pH为7.0，30℃下，通风量0.3vvm，罐压0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养30h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为1.0。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为15L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加3％(v/v，相对发酵起始体积)的碳十三烷烃，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.30vvm，罐压(表压)约为0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加10％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为80h开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
在发酵150h开始连续流加碳十三烷烃，流加速率为1.36mL/L/h，同时开始流加含营养盐的溶液，流加速率为1.36mL/L/h，控制菌体OD620为0.8，控制出料速率使得发酵液体积维持在22L，稀释率为0.0027h-1。
连续发酵周期为250h，总发酵周期为400h，平均产酸速率为1.6g/L/h，总得率为90％(g/g)。
对比例3
种子培养基：蔗糖3％、玉米浆1％、酵母膏0.2％、KH2PO40.9％、尿素0.5％。
发酵培养基：葡萄糖5％、玉米浆0.7％、酵母膏0.3％、硝酸钾0.55％、磷酸二氢钾0.60％、尿素0.20％、硫酸铵0.20％以及氯化钠0.15％。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量100mL)，初始pH为6.0，30℃下，200rpm摇床培养2天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量8L)，接种量为30％，补加10％的液碱控制pH为7.0，30℃下，通风量0.3vvm，罐压0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养30h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为1.0。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为15L，接种量10％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加3％(v/v，相对发酵起始体积)的碳十三烷烃，发酵过程控制温度30℃，通风量约为0.30vvm，罐压(表压)约为0.14MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加10％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为80h开始批次加入烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
发酵160h后，菌体活力大幅下降，在发酵175h时停罐，平均产酸速率为1.3g/L/h，总得率为85％(g/g)。
由实施例3和对比例3的对比可知：由于连续流加烷烃和营养盐，产酸速率从1.3g/L/h提高至1.6g/L/h，提高了23％，总得率从85％提高至90％。
实施例4
种子培养基：蔗糖1.3％、玉米浆0.35％、酵母膏0.45％、KH2PO41.1％、尿素0.5％。
发酵培养基：葡萄糖4.5％、玉米浆0.1％、酵母膏0.15％、硝酸钾1.2％、磷酸二氢钾0.75％、尿素0.3％、硫酸铵0.18％以及氯化钠0.09％。
补料培养基有两种：一种为碳十六烷烃；一种为含营养盐的溶液(硫酸铵0.15％，玉米浆0.15％，磷酸二氢钾0.015％，尿素0.015％，其余为水；百分比为质量体积比，g/100mL)。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量50mL)，初始pH为6.3，28℃下，240rpm摇床培养1.5天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5L)，接种量为30％，补加15％的液碱控制pH为7.4，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.08MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养28h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.9。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为13L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加2％(v/v，相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.08MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加15％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为60h开始批次加入碳十六烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
在发酵130h开始连续流加碳十六烷烃，流加速率为1.35mL/L/h，同时开始流加含营养盐的溶液，流加速率为1.47mL/L/h，控制菌体OD620为0.65(稀释30倍)，控制出料速率使得发酵液体积维持在17L，稀释率为0.0028h-1。
连续发酵周期为300h，总发酵周期为430h，平均产酸速率为1.7g/L/h，总得率为75％(g/g)。
对比例4
种子培养基：蔗糖1.3％、玉米浆0.35％、酵母膏0.45％、KH2PO41.1％、尿素0.5％。
发酵培养基：葡萄糖4.5％、玉米浆0.1％、酵母膏0.15％、硝酸钾1.2％、磷酸二氢钾0.75％、尿素0.3％、硫酸铵0.18％以及氯化钠0.09％。
摇瓶种子培养工艺为取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量50mL)，初始pH为6.3，28℃下，240rpm摇床培养1.5天。
种子罐培养工艺为取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5L)，接种量为30％，补加15％的液碱控制pH为7.4，28℃下，通风量0.6vvm，罐压0.08MPa，保持一定的搅拌速度，控制种子培养过程的DO10％以上，培养28h，培养成熟种子的标准为稀释30倍后OD620为0.9。
发酵工艺为将在种子罐培养的所得的种子液接种到含有发酵培养基的30L发酵罐中，接种后起始体积为13L，接种量30％(v/v，相对发酵起始体积)，发酵起始添加2％(v/v，相对发酵起始体积)的烷烃，发酵过程控制温度28℃，通风量约为0.6vvm，罐压(表压)约为0.08MPa，保持一定的搅拌速度，控制溶氧10％以上，补加15％的液碱控制发酵液的pH值为7-8.5；在发酵周期为60h开始批次加入碳十六烷烃，控制发酵液中烷烃含量为10％以上。
发酵150h后，菌体活力大幅下降，在发酵165h时停罐，平均产酸速率为1.3g/L/h，总得率为68％(g/g)。
由实施例4和对比例4的对比可知：由于连续流加烷烃和营养盐，产酸速率从1.3g/L/h提高至1.7g/L/h，提高了31％，总得率从68％提高至75％。

Claims (10)

1.一种连续发酵生产长链二元酸的方法，其特征在于：在发酵100-150h后，连续流加底物，同时连续流加含营养盐的溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流加底物前，所述发酵液中底物含量为2％(v/v)以上，所述百分比为所述底物占发酵液的体积百分比。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述含营养盐的溶液包括以下各成分：葡萄糖0.0％-1.0％(w/v)、玉米浆0.05％-0.15％(w/v)、酵母膏0.0％-0.3％(w/v)、磷酸二氢钾0.005％-0.015％(w/v)、尿素0.005％-0.015％(w/v)和硫酸铵0.01％-0.15％(w/v)，其余为水；所述百分比为质量体积比。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：所述底物的流加速率和所述含营养盐的溶液的流加速率满足以下关系：
0.3*V(底物)+18.5≤V(含营养盐的溶液)≤0.5*V(底物)+46
其中，所述V(底物)为底物的流加速度，所述V(含营养盐的溶液)为含营养盐的溶液的流加速度。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述底物的流加速率V(底物)为2-5mL/L/h；
和/或，所述含营养盐的溶液的流加速率V(含营养盐的溶液)为0.5-3mL/L/h；
和/或，所述发酵时的稀释率为0.001-0.006h-1，优选0.0016-0.0054h-1。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述底物包括C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选包括C11-C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；更优选为C11、C12、C13、C15、C14或C16的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种；
和/或，所述长链二元酸包括：化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸，其中n≥7，包括但不限于：壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸、十六碳二元酸、十七碳二元酸和十八碳二元酸中的一种或多种。
7.一种长链二元酸的生产方法，所述生产方法包括如权利要求1-6任一项所述的连续发酵生产长链二元酸的方法。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：在连续发酵生产长链二元酸之前，还进行以下操作：
将种子液接种到发酵培养基中，进行间歇式补料发酵，在发酵开始10-100h，加入底物，保证发酵液中底物含量为2％(v/v)以上，所述百分比为所述底物占发酵液的体积百分比。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述接种后的起始体积为发酵罐体积的30％-50％，所述百分比为培养基的体积占发酵罐体积的百分比；
和/或，所述发酵的接种量为10％-30％(v/v)，所述百分比为相对于发酵起始体积的体积百分比；
和/或，所述发酵时的菌体浓度OD620为9-24；
和/或，所述发酵的温度为28-32℃；
和/或，所述发酵的通风量为0.3-0.7vvm；
和/或，所述发酵的罐压为0.05-0.14MPa，所述压力为表压；
和/或，所述发酵的溶氧量为10％以上；
和/或，所述发酵的pH值为7-8.5。
10.一种含营养盐的溶液，其特征在于：所述含营养盐的溶液包括以下各成分：葡萄糖0.0％-1.0％(w/v)、玉米浆0.05％-0.15％(w/v)、酵母膏0.0％-0.3％(w/v)、磷酸二氢钾0.005％-0.015％(w/v)、尿素0.005％-0.015％(w/v)和硫酸铵0.01％-0.15％(w/v)，其余为水；所述百分比为质量体积比，g/100mL。
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