CN115125177B - 一种发酵方法及发酵生产辅酶q10的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种发酵方法及发酵生产辅酶Q10的方法，包括以下步骤，前发酵：在前发酵罐中进行前发酵，其中，前发酵的初始发酵液体积是前发酵罐容积的45％‑70％；当前发酵进行到(0.4n‑0.6n)小时，前发酵罐中的发酵液体积因补料增加至前发酵罐容积的75％‑85％时，进行分罐操作，其中n(小时)为发酵周期；分罐：将前发酵罐中发酵液体积的40％‑60％转入后发酵罐；后发酵：分罐后，前、后发酵罐分别进行后发酵，当发酵液的体积因补料增加至前、后发酵罐容积的75％‑85％时，停止发酵，放罐。采用上述方法发酵生产辅酶Q10，能够提高发酵罐的设备利用率并提高发酵产量33％。

Description

一种发酵方法及发酵生产辅酶Q10的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种发酵方法及发酵生产辅酶Q10的方法。
背景技术
辅酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)又名泛醌，广泛存在于动植物及微生物体内，是生物细胞呼吸链中不可或缺的递氢体，也是细胞自身产生的天然抗氧化剂和细胞代谢调节剂。由于辅酶Q10具有醌环结构，能够起到保护生物膜结构、稳定细胞膜电位和增强免疫力的作用，近年来已被广泛应用于心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病的治疗，并可预防动脉硬化、中风和高血压，对心脏、肝脏和肾脏具有良好的保健作用。此外，辅酶Q10还具有优异的抗衰老作用，在化妆品和保健品等领域有广泛的应用。
微生物发酵法生产辅酶Q10具有产物活性高、原料成本低等优势，是目前研究和开发的热点。辅酶Q10发酵的耗糖量很大，为了满足菌种的生长条件，需要在整个发酵过程中持续大量补料，发酵全程需要另外补入初始发酵液体积的1.6倍以上的物料，补料量较大，在发酵之初就需要为后续的补料预留空间。现有技术通常采用分批补料发酵、倒种再培养等发酵方法。
在传统的分批补料发酵工艺中，例如专利文献CN104561154B公开了一种辅酶Q10发酵工艺及控制策略，采用分批补料发酵的方式进行发酵，根据其所述发酵工艺推算，为了给后续的补料培养基预留空间，初始发酵液的体积较小，仅占发酵罐容积的30-35％，在发酵前期浪费了发酵罐的大量上部空间，降低了发酵罐的利用率。
专利文献CN111763636A公开了一种工业发酵生产辅酶Q10的方法，采用了倒种再培养的发酵方法，将1批或1批以上给出罐发酵液转入同一个接收罐中继续培养，该方法没有考虑生产过程的连续性，造成接收罐有大量闲置时间，无法最大化的利用发酵设备。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供了一种发酵方法，该方法显著提升了发酵罐的空间利用率，且有效实现了生产过程的连续性，进而提高了发酵生产的效率。
本发明还提供了一种发酵生产辅酶Q10的方法，采用上述发酵方法生产辅酶Q10，充分利用了发酵罐的空间，能够实现连续发酵生产，提高生产效率和发酵产量。
本发明的一方面，提供一种发酵生产的方法，包括以下步骤：
前发酵：先在前发酵罐中进行常规的分批补料发酵，称之为前发酵阶段，在前发酵阶段，控制前发酵罐的初始发酵液体积为发酵罐容积的45％-70％，随着前发酵过程的进行，持续不断的补入补料培养基，发酵液的体积会不断增加。当前发酵进行到(0.4n-0.6n)小时，发酵液体积增加至前发酵罐容积的75％-85％时，前发酵罐已经没有空间容纳更多的补料培养基，此时进行分罐操作。
分罐：在分罐操作中，将前发酵罐中发酵液体积的40％-60％转入后发酵罐，优选地，将前发酵罐中发酵液体积的50％转入后发酵罐。
后发酵：分罐操作后，前发酵罐和后发酵罐中的发酵液体积各占发酵罐总容积的40％左右，均有了充足的空间继续进行补料发酵培养，当前发酵罐和后发酵罐中的发酵液体积因补料增加至发酵罐容积的75％-85％时，停止发酵，放罐。
本发明中，对放罐发酵液中的目标产物进行提取精制的过程中，可以根据目标产物的类别选用本领域常规的分离纯化方法。
本发明提供的发酵生产方法可以进行循环连续生产。为了实现循环连续生产，可以采用三个发酵罐的搭配组合，前发酵罐的数量为两个，后发酵罐的数量为一个。每批前发酵罐都完整经历了前发酵阶段和后发酵阶段，具有完整的发酵周期n小时，每批后发酵罐仅有后发酵阶段，后发酵罐的发酵周期为(0.4n-0.6n)小时。两个前发酵罐以(0.4n-0.6n)小时的时间间隔交替进行连续发酵生产，一个后发酵罐能够交替承接两个前发酵罐的分罐操作和后发酵阶段，这样进行循环连续生产，可以大幅度提高发酵罐利用率，提高发酵产量。
本发明提供的发酵生产方法尤其适用于生产补料量较大的发酵类产品，具体是指补料量为初始发酵液体积的1.2倍-2.8倍的发酵类产品，例如辅酶Q10，辅酶Q10的发酵过程中需要补入葡萄糖、氨水和磷元素等物料，补料量为初始发酵液体积的1.8倍左右。
本发明提供的生产辅酶Q10的方法，采用上述的发酵生产方法生产，具有发酵产量大、空间利用率高、制备工艺简单、易操作等优点。
以上技术方案应用到辅酶Q10的发酵生产中，具体步骤为：
(1)种子摇瓶培养：
本发明所用的发酵生产辅酶Q10的菌种包括但不限于类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)ATCC 21286。种子摇瓶的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，玉米浆干粉0.5g/L，味精0.5g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠2.0g/L，氯化钴1.0mg/L，碳酸钙4.0g/L，pH 6.5-7.1。
种子摇瓶的培养条件为：将保藏的类球红细菌冻存管菌种按照0.1-0.2％的接种量接入到种子摇瓶中，种子摇瓶在温度30-34℃，转速200-250rpm的摇床上培养22-28h，要求培养好的摇瓶种子液的OD600达到4.0-6.0，得到合格的摇瓶种子。
(2)一级种子罐培养：
一级种子罐的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，玉米浆干粉0.5g/L，味精0.5g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠2.0g/L，氯化钴1.0mg/L，碳酸钙4.0g/L，pH 6.5-7.1。
一级种子罐的培养条件为：摇瓶种子按照0.1-0.2％的接种量接入一级种子罐，一级种子罐在温度30-34℃，罐压0.03-0.06Mpa，通气量0.5-1.0vvm，搅拌转速150-250rpm的条件下培养24-36h，要求培养好的一级种子液的OD600达到4.0-6.0，得到合格的一级种子液。
(3)二级种子罐培养：
二级种子罐的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，玉米浆干粉0.5g/L，味精0.5g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠2.0g/L，氯化钴1.0mg/L，碳酸钙4.0g/L，pH 6.5-7.1。
二级种子罐的培养条件为：一级种子液按照2-15％的接种量接入二级种子罐，二级种子罐在温度30-34℃，罐压0.03-0.06Mpa，通气量0.6-1.2vvm，搅拌转速100-200rpm的条件下培养16-28h，要求培养好的二级种子液的OD600达到9.0-11.0，得到合格的二级种子液。
(4)前发酵培养：
前发酵罐的培养基配方为：葡萄糖20g/L，玉米浆干粉4.5g/L，味精3.5g/L，硫酸镁15g/L，硫酸铵3.6g/L，硫酸亚铁1.5g/L，硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化钠3.0g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钴3.0mg/L，氯化胆碱2.5mg/L，盐酸硫铵7.5mg/L，烟酸10mg/L，生物素0.2mg/L，pH 6.5-7.1。
前发酵的培养条件为：二级种子液按照10-30％的接种量接入前发酵罐，接种后，前发酵罐中初始发酵液的体积为发酵罐容积的45-70％，初始发酵液在温度30-34℃，罐压0.03-0.06Mpa，通气量0.5-1.0vvm，搅拌转速60-150rpm的条件下进行发酵培养；在前发酵培养过程中，持续补入浓度为45％-65％的葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度为5-20g/L；在前发酵培养过程中，持续补入浓度为10-20％的磷酸二氢钾溶液，维持发酵液中磷含量为60-140ppm；在前发酵培养过程中，持续补入浓度为22-28％的氨水，维持发酵液的PH在6.5-7.1之间。
随着前发酵过程的进行，持续不断的补入葡萄糖溶液、氨水、磷酸二氢钾溶液，发酵液体积不断增加，每小时约增加现有发酵液体积的1％。当前发酵罐发酵至40-48h时，发酵液体积就会增加至发酵罐总容积的75％-85％左右，此时前发酵罐已经没有空间容纳更多的补料培养基，于是进行分罐操作。
(5)分罐：
执行分罐操作时，将前发酵罐中发酵液体积的40-60％放至后发酵罐，优选的，将前发酵罐中发酵液体积的50％放至后发酵罐。
(6)后发酵培养：
进行分罐操作后，前发酵罐和后发酵罐中的发酵液体积各占发酵罐容积的40％左右，就又有了充足的空间继续进行补料发酵培养。
后发酵的培养条件：在分罐后，前发酵罐和后发酵罐分别在温度30-34℃，罐压0.03-0.06Mpa，通气量0.5-1.0vvm，搅拌转速60-150rpm的条件下进行发酵培养；在后发酵培养过程中，持续补入浓度为45％-65％的葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度为5-20g/L，放罐前两小时停止补糖；在后发酵培养过程中，持续补入浓度为10-20％的磷酸二氢钾溶液，维持发酵液中磷含量为60-140ppm；在后发酵培养过程中，持续补入浓度为22-28％的氨水，维持发酵液的PH在6.5-7.1之间。
前、后发酵罐的后发酵阶段持续进行54-66h，发酵液体积又会因补料增加至发酵罐容积的80％左右，此时菌体已经基本老化，发酵单位增长缓慢，于是停止补糖，再继续培养两个小时，将发酵液中的残糖耗完，就可以结束发酵放罐了。
(7)两前一后：
采用本发明的发酵工艺进行辅酶Q10发酵，每个前发酵罐的发酵周期包括前发酵阶段和后发酵阶段，总共为94-114h，再加上放罐、清洗、进罐、灭菌、接种的时间，一个前发酵罐的生产周期为六天，与传统的单罐分批补料发酵生产周期相同；而每个后发酵罐的发酵周期仅有后发酵阶段，为54-66h，再加上放罐、清洗、空消的时间，一个后发酵罐的生产周期为三天；将两个前发酵罐和一个后发酵罐组成一组，两个前发酵罐以三天的时间间隔交替进行连续发酵生产，一个后发酵罐交替承接两个前发酵罐的分罐操作和后发酵阶段，这样进行循环连续生产，可以大幅度提高设备利用率。
本发明的有益效果：提高了发酵罐的利用率和生产效率。比如在辅酶Q10的发酵生产中，同样的三个发酵罐，如果用传统的单罐分批补料发酵方法，一个生产周期六天内，只能放出三罐发酵液；而采用本发明中的方法，将三个发酵罐搭配组合为两前一后进行连续生产，则平均一个生产周期六天内，可以放出四罐发酵液，设备利用率提高了33％。
本发明提供的发酵生产方法适用于补料量较大的(补料量为1.2-2.8倍发酵液初始体积)发酵类产品，例如辅酶Q10(补料量约为1.8倍发酵液初始体积)，采用上述发酵生产方法生产辅酶Q10，具有连续生产、发酵产量大、设备利用率高、发酵工艺简单、易操作等优点。
附图说明
图1是本发明实施例3的发酵设备示意图。
具体实施方式
以下所列举具体实施方式只是对本发明的原理和特征进行描述，所举实例仅用于解释本发明，并非限定本发明的范围。基于本发明实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。本发明提供的发酵生产方法适用于补料量较大的(补料量为1.2-2.8倍发酵液初始体积)发酵类产品，例如辅酶Q10，下述各实施例均以辅酶Q10的发酵生产为例。
本发明对发酵所用的菌种及菌种扩大培养阶段的工艺都没有特殊限制，沿用分批补料发酵工艺中的菌种扩大培养工艺即可。辅酶Q10发酵所用的菌种包括但不限于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)ATCC 21286。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明的实施例和对比例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例和对比例所用的菌种为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)来源于美国标准菌种保藏中心(ATCC)，保藏编号为ATCC 21286，具体为自上海一研生物科技有限公司代理购买获得。
本发明的辅酶Q10发酵实施例和对比例所用的培养基配方为：
种子摇瓶的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，玉米浆干粉0.5g/L，味精0.5g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠2.0g/L，氯化钴1.0mg/L，碳酸钙4.0g/L，pH6.5-7.1。
一级种子罐的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，玉米浆干粉0.5g/L，味精0.5g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠2.0g/L，氯化钴1.0mg/L，碳酸钙4.0g/L，pH为6.5-7.1。
二级种子罐的培养基配方为：葡萄糖5.0g/L，酵母浸粉1.0g/L，玉米浆干粉0.5g/L，味精0.5g/L，硫酸铵2.5g/L，硫酸镁2.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.03g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钠2.0g/L，氯化钴1.0mg/L，碳酸钙4.0g/L，pH为6.5-7.1。
发酵罐的培养基配方为：葡萄糖20g/L，玉米浆干粉4.5g/L，味精3.5g/L，硫酸镁15g/L，硫酸铵3.6g/L，硫酸亚铁1.5g/L，硫酸锰0.05g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，氯化钠3.0g/L，氯化钙0.1g/L，氯化钴3.0mg/L，氯化胆碱2.5mg/L，盐酸硫铵7.5mg/L，烟酸10mg/L，生物素0.2mg/L，pH为6.5-7.1。
实施例1：辅酶Q10的发酵工艺小试
本实施例所用到的发酵设备规格如下：种子瓶为250mL三角瓶，一级种子罐容积为5L，二级种子罐容积为15L，前发酵罐容积为50L，后发酵罐容积为50L；
辅酶Q10的发酵工艺小试包括以下步骤：
(1)种子摇瓶培养：
按照0.2％(0.1mL)的接种量将保藏的类球红细菌菌种接入种子摇瓶，与种子摇瓶中的培养基形成50mL的培养液，接种后的种子摇瓶在温度32℃，转速250rpm的摇床上培养24h，培养得到摇瓶种子液的OD600为5.3；
(2)一级种子扩大培养：
按照0.2％(6mL)的接种量将步骤(1)得到的摇瓶种子液接种到一级种子罐，与一级种子罐中的培养基形成3L的培养液，接种后进行培养，培养温度32℃，罐压0.05Mpa，通气量1.0vvm，搅拌转速为250rpm，培养时间为33h，培养得到的一级种子液的OD600值为5.1。
(3)二级种子扩大培养
按照10％(1000mL)的接种量将步骤(2)的一级种子液接种到二级种子罐，与二级种子罐中的培养基形成10L的培养液，接种后进行培养，培养温度为32℃，罐压为0.05Mpa，通气量为1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养时间为16h，培养得到的二级种子液OD600值为9.8；
(4)前发酵
按照20％(5.6L)的接种量将步骤(3)得到的二级种子液接入前发酵罐中，与前发酵罐的培养基形成28L的初始发酵液，然后在温度33℃，罐压0.05Mpa，通气量0.5vvm-1.0vvm，搅拌转速100rpm-150rpm的条件下进行前发酵；
在前发酵过程中，向发酵液中连续补料浓度为50％的葡萄糖溶液、浓度为20％的磷酸二氢钾溶液、浓度为22％-28％的氨水，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L、磷含量为60ppm-140ppm、pH在6.5-7.1之间；
每4个小时取样测发酵液中葡萄糖浓度、磷含量，调整补料速度；
(5)分罐
当前发酵至45h时，发酵液的体积增长至40L，此时进行分罐，通过无菌操作利用压差将部分发酵液(20L)经管路转入后发酵罐中。
在分罐过程中，前发酵罐始终正常补料培养，开启后发酵罐的空气和搅拌系统，调整后发酵罐的罐压为0.02MPa；在分罐过程中，由于后发酵罐中发酵液的体积还较小，不能淹没温度和pH电极，暂时不补料不控温；分罐后，调整后发酵罐的罐压为0.05MPa，开启温控系统和补料系统，其中分罐过程耗时约15min。
(6)后发酵培养
分罐后，前发酵罐和后发酵罐中的发酵液的体积均为20L，可视为两个独立的发酵罐，分别继续进行补料发酵培养，培养条件为：温度33℃，罐压0.05Mpa，通气量0.5-1.0vvm，搅拌转速100-150rpm；在培养过程中，向发酵液中补料浓度为50％的葡萄糖溶液、浓度为20％的磷酸二氢钾溶液、浓度为22％-28％的氨水，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L、磷含量为60ppm-140ppm、pH在6.5-7.1之间；
在发酵至第24h时，对前发酵罐开始每8小时取样测发酵单位；分罐后，后发酵罐与前发酵罐同步取样测发酵单位，发酵至第88h时开始每4小时取样测发酵单位；发酵至第92h后，当前后两次4小时测得的发酵单位的增长幅度低于80mg/L时，停止补糖，继续培养两个小时耗尽残糖后放罐；其中，发酵周期从前发酵罐开始发酵为起始点计算；
发酵至第106h，前发酵罐和后发酵罐均停止发酵放罐，前发酵罐中发酵液的体积为39L，发酵单位为3578mg/L；后发酵罐中发酵液的体积为38L，发酵单位为3525mg/L。
实施例2：辅酶Q10的单批发酵生产
本实施例中所用到的发酵设备规格如下：种子摇瓶为500mL三角瓶，一级种子罐容积为2.5m3，二级种子罐容积为15m3，前发酵罐容积为125m3，后发酵罐容积为125m3；
应用本发明的方法，进行的辅酶Q10某一批发酵生产，包括以下步骤：
(1)种子摇瓶接种培养：
按照0.2％(0.2mL)的接种量将保藏的类球红细菌菌种接入种子摇瓶，与种子摇瓶中的培养基形成100mL的培养液，接种后的种子摇瓶在温度32℃，转速250rpm的摇床上培养24h，培养得到摇瓶种子液的OD600为5.1；
(2)一级种子扩大培养：
按照0.1％(1200mL)的接种量将步骤(1)得到的摇瓶种子液接种到一级种子罐，与一级种子罐中的培养基形成1.2m3的培养液，接种后进行培养，培养温度32℃，罐压0.05Mpa，通气量1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养时间为35h，培养得到的一级种子液的OD600值为4.7；
(3)二级种子扩大培养
按照10％(1.2m3)的接种量将步骤(2)的一级种子液接种到二级种子罐，与二级种子罐中的培养基形成12m3的培养液，接种后进行培养，培养温度为32℃，罐压为0.05Mpa，通气量为1.0vvm，搅拌转速为150rpm，培养时间为18h，二级种子液OD600值为10.4；
(4)前发酵
按照20％(12m3)的接种量将步骤(3)得到的二级种子液接入前发酵罐中，与前发酵罐中的培养基形成60m3的初始发酵液，然后在温度33℃，罐压0.05Mpa，通气量0.5vvm-1.0vvm，搅拌转速100rpm-150rpm的条件下进行前发酵；
在前发酵过程中，向发酵液中连续补料浓度为50％的葡萄糖溶液、浓度为20％的磷酸二氢钾溶液、浓度为22％-28％的氨水，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L、磷含量为60ppm-140ppm、pH在6.5-7.1之间；
每4个小时取样测发酵液中葡萄糖浓度、磷含量，调整补料速度；
(5)分罐
当发酵至46h时，前发酵罐中的发酵液的体积增长至100m3，此时进行分罐，通过无菌操作利用压差将部分发酵液(50m3)经管路转入后发酵罐中。
在分罐过程中，前发酵罐始终正常补料培养，开启后发酵罐的空气和搅拌系统，调整后发酵罐的罐压为0.02MPa；在分罐过程中，由于后发酵罐中发酵液的体积还较小，不能淹没温度和pH电极，暂时不补料不控温；分罐后，调整后发酵罐的罐压为0.05MPa，开启温控系统和补料系统，其中分罐过程耗时约40min；
(6)后发酵培养
分罐后，前发酵罐和后发酵罐中的发酵液的体积均为50m3，可视为两个独立的发酵罐，分别继续进行补料发酵培养，培养条件为：温度33℃，罐压0.05Mpa，通气量0.5-1.0vvm，搅拌转速100-150rpm；在培养过程中，向发酵液中连续补料浓度为50％的葡萄糖溶液、浓度为20％的磷酸二氢钾溶液、浓度为22％-28％的氨水，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L、磷含量为60ppm-140ppm、pH在6.5-7.1之间；
在发酵至第24h时，对前发酵罐开始每8小时取样测发酵单位；分罐后，后发酵罐与前发酵罐同步取样测发酵单位，发酵至第88h时开始每4小时取样测发酵单位；发酵至第92h后，当前后两次4小时测得的发酵单位的增长幅度低于80mg/L时，停止补糖，继续培养两个小时耗尽残糖后放罐；其中，发酵周期从前发酵罐开始发酵为起始点计算；
发酵至第106h，前发酵罐和后发酵罐均停止发酵放罐，最终前发酵罐中发酵液体积为104m3，发酵单位为3372mg/L；最终后发酵罐中发酵液体积为101m3，发酵单位为3277mg/L，两个罐的放罐总亿共计681.7kg。
实施例3：辅酶Q10的“两前一后”连续发酵生产
本实施例中每一个批次的发酵生产的实施方法同实施例2，采用两前一后的三罐搭配组合，连续进行生产；
其中，如图1所示，采用以下发酵设备进行发酵：将发酵罐301、发酵罐302、发酵罐303这三个相同规格的发酵罐组成一组，其中第一前发酵罐301和第二前发酵罐303作为前发酵罐，后发酵罐302作为后发酵罐，进行连续发酵生产；在连续发酵生产中，第一前发酵罐301和第二前发酵罐303间隔三天循环进罐发酵，后发酵罐302交替承接第一前发酵罐301和第二前发酵罐303的分罐操作和后发酵阶段发酵；
第一前发酵罐301和后发酵罐302之间通过可灭菌的分罐管路连通，第二前发酵罐303和后发酵罐302之间通过可灭菌的分罐管路连通；
本实施例通过两前一后的三罐搭配组合，在连续生产的一个月期间，第一前发酵罐301和第二前发酵罐303共放罐10批，后发酵罐302放罐10批，这一组合共放罐20个批次。
对比例1：辅酶Q10的分批补料发酵小试
对比例1采用与实施例1相同的发酵设备，发酵方法为辅酶Q10的分批补料发酵，具体包括以下步骤：
(1)种子摇瓶培养：
按照0.2％(0.1mL)的接种量将保藏的类球红细菌菌种接入种子摇瓶中，与种子摇瓶中的培养基形成50mL的种子液，接种后的种子摇瓶在温度32℃，转速250rpm的摇床上培养24h，培养得到摇瓶种子液的OD600为5.1；
(2)一级种子扩大培养：
按照0.2％(6mL)的接种量将步骤(1)得到的摇瓶种子液接种到一级种子罐中，与一级种子罐中的培养基形成3L的培养液，接种后进行培养，培养温度32℃，罐压0.05Mpa，通气量1.0vvm，搅拌转速为250rpm，培养时间为32h，培养得到的一级种子液的OD600值为4.8。
(3)二级种子扩大培养
按照10％(1000mL)的接种量将步骤(2)得到的一级种子液接种到二级种子罐中，与二级种子罐中的培养基形成10L的培养液，接种后进行培养，培养温度为32℃，罐压为0.05Mpa，通气量为1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养时间为17h，培养得到的二级种子液OD600值为10.3；
(4)发酵罐分批补料发酵
按照20％(4L)的接种量将步骤(3)得到的二级种子液接入发酵罐中，与发酵罐中的培养基形成20L的初始发酵液，然后在温度33℃，罐压0.05Mpa，通气量0.5vvm-1.0vvm，搅拌转速100rpm-150rpm的条件下进行发酵；
在发酵过程中，向发酵液中连续补料浓度为50％的葡萄糖溶液、浓度为20％的磷酸二氢钾溶液、浓度为22％-28％的氨水，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L、磷含量为60ppm-140ppm、pH在6.5-7.1之间；
每4个小时取样测发酵液中葡萄糖浓度、磷含量，调整补料速度；
在发酵至第24h时，对发酵罐开始每8小时取样测发酵单位；发酵至第88h时开始每4小时取样测发酵单位；发酵至第92h后，当前后两次4小时测得的发酵单位的增长幅度低于80mg/L时，停止补糖，继续培养两个小时耗尽残糖后放罐；其中，发酵从前发酵罐开始发酵为起始点计算；
随着发酵的进行，发酵液的体积越来越大，发酵至72h时，发酵液的体积增长到41L，发酵罐已经没有空间容纳更多的补料培养基，但是此时，发酵单位还在快速增长中，为了能够继续发酵，发酵至72h时放料5L，之后每过8h，再放料5L，将发酵液的体积维持在35L-40L之间，直至发酵结束；
对比例1发酵到102h后发酵结束，最终罐中的发酵液体积为36L，发酵单位达到3450mg/L，对比例1发酵单位的增长情况和放料情况如表1所示：
发酵时间 72h 80h 88h 92h 96h 100h 102h
发酵单位(mg/L) 2279 2638 2966 3180 3357 3415 3450
放料体积 5L 5L 5L / 5L / 36L
根据表1可以看出，在发酵过程的后半段，为了腾出空间继续补料，间歇性的放料四次，这种操作在发酵工业中俗称“带放”，共带放了20L的发酵液，但是这带放的20L发酵液由于放罐时间较早，远未达到最高发酵单位，浪费了菌种的发酵潜力；另外由于带放是在常规的发酵过程中进行的，带放的发酵液中葡萄糖等营养物质还未消耗完，一方面造成了原料的浪费，另一方面残留过多的营养物质给后提取工艺也带来不利影响；此外如果在生产车间采用带放工艺，还需要占用一个发酵罐或储罐用来专门暂存带放的发酵液，降低了发酵设备的利用率。
对比例2：辅酶Q10的分批补料发酵生产
对比例2所用到的发酵设备规格与实施例2相同，发酵方法为辅酶Q10的分批补料发酵工艺，具体包括以下步骤：
(1)种子摇瓶培养：
按照0.2％(0.1mL)的接种量将保藏的类球红细菌菌种接入种子摇瓶中，与种子摇瓶中的培养基形成100mL的培养液，接种后的种子摇瓶在温度32℃，转速250rpm的摇床上培养24h，培养得到摇瓶种子液的OD600为5.1；
(2)一级种子扩大培养：
按照0.1％(1000mL)的接种量将步骤(1)得到的摇瓶种子液接种到一级种子罐中，与一级种子罐中的培养基形成1m3的培养液，接种后进行培养，培养温度32℃，罐压0.05Mpa，通气量1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养时间为36h，培养得到的一级种子液的OD600值为4.9；
(3)二级种子扩大培养
按照10％(1000L)的接种量将步骤(2)的一级种子液接种到二级种子罐中，与二级种子罐中的培养基形成10m3的培养液，接种后进行培养，培养温度为32℃，罐压为0.05Mpa，通气量为1.0vvm，搅拌转速为150rpm，培养时间为17h，二级种子液OD600值为10.5；
(4)分批补料发酵
按照20％(8m3)的接种量将步骤(3)得到的二级种子液接入发酵罐中，与发酵罐中的培养基形成40m3的初始发酵液，然后在温度33℃，罐压0.05Mpa，通气量0.5vvm-1.0vvm，搅拌转速100rpm-150rpm的条件下进行发酵；
在发酵过程中，向发酵液中连续补料浓度为50％的葡萄糖溶液、浓度为20％的磷酸二氢钾溶液、浓度为22％-28％的氨水，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L、磷含量为60ppm-140ppm、pH在6.5-7.1之间；
每4个小时取样测发酵液中葡萄糖浓度、磷含量，调整补料速度；
在发酵至第24h时，对发酵罐开始每8小时取样测发酵单位；发酵至第88h时开始每4小时取样测发酵单位；发酵至第92h后，当前后两次4小时测得的发酵单位的增长幅度低于80mg/L时，停止补糖，继续培养两个小时耗尽残糖后放罐；其中，发酵从前发酵罐开始发酵为起始点计算；
对比例2中发酵罐发酵至106h停止发酵放罐，最终罐中发酵液体积为105m3，发酵单位达到3360mg/L，放罐总亿为352.8kg。
对比例2中，为了给后续的补料培养基留出容纳空间，发酵液的初始体积较低，仅为40m3，发酵前期浪费了大量的发酵罐空间。考虑到连续生产的情况，在每一个生产批次中，发酵罐要经历投料进罐、灭菌、接种、发酵、放罐、清洗的过程，则一个生产批次需要六天时间，连续生产一个月后，每个发酵罐可以生产五个批次，若3个发酵罐各自采用分批补料发酵工艺进行发酵生产，连续生产一个月，共可放罐15个批次。
根据实施1-3和对比例1-2可以看出，本发明提供的发酵生产方法能够应用于生产辅酶Q10中，实现循环连续生产，还能提高发酵罐的空间利用率，进而提高生产效率，提高发酵产量，尤其是相对于对比例2，实施例3的方法每罐放罐总亿与对比例2相当，考虑到连续生产的情况，实施例3能够将设备利用率提高33％，发酵产量也提高了33％。
本发明提供的发酵方法及生产辅酶Q10的方法，能够实现连续生产，充分利用了发酵设备的空间，提高发酵设备的空间利用率，还能够充分利用发酵原料，避免了营养物质的浪费，消除了对后提取工艺的不利影响。本发明提供的发酵生产方法还具有发酵产量大、工艺简单、易操作等优点。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例以及试验验证。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种发酵生产辅酶Q10的方法，其特征在于，包括以下步骤：
前发酵：在前发酵罐中进行前发酵，其中，前发酵的初始发酵液体积是前发酵罐容积的45%-70%；当前发酵进行到0.4n-0.6n小时，前发酵罐中的发酵液体积因补料增加至前发酵罐容积的75%-85%时，进行分罐操作，其中n为发酵周期，发酵周期的单位为小时；
分罐：将前发酵罐中发酵液体积的40%-60%转入后发酵罐；
后发酵：分罐后，前、后发酵罐分别进行后发酵，当发酵液的体积因补料增加至前、后发酵罐容积的75%-85%时，停止发酵，放罐；
将三个发酵罐搭配为一组，所述前发酵罐的数量为两个，所述后发酵罐的数量为一个，两个前发酵罐以间隔时间为0.4n-0.6n小时交替连续进行所述前发酵，一个后发酵罐交替承接两个前发酵罐的分罐操作；
在分罐阶段，将前发酵罐中发酵液体积的50%转入后发酵罐；
前发酵阶段和后发酵阶段均进行补料发酵培养，包括：
向发酵液中持续补加葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度为5g/L-20g/L，所述葡萄糖溶液的浓度为45%-65%；
向发酵液中持续补加氨水，维持发酵液pH为6.5-7.1，所述氨水的浓度为22%-28%；
向发酵液中持续补加磷酸二氢钾溶液，维持发酵液的磷含量为60ppm-140ppm，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为10%-20%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，前发酵、后发酵阶段的发酵参数均为：温度30℃-34℃，罐压0.03Mpa-0.06Mpa，通气量0.5vvm-1.0vvm，搅拌转速60 rpm -150rpm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在前发酵之前，还包括种子扩大培养，所述种子扩大培养包括种子摇瓶培养、一级种子罐扩大培养和二级种子罐扩大培养；
所述种子摇瓶培养包括以下步骤：
按照0.1%-0.2%的接种量将菌种接入到种子摇瓶中进行培养，培养温度为30℃-34℃，转速为200rpm-250rpm，培养时间为22h -28h，得到摇瓶种子液；
所述一级种子罐扩大培养包括以下步骤：
按照0.1%-0.2%的接种量将摇瓶种子液接入一级种子罐中进行培养，培养温度为30℃-34℃， 通气量为0.5vvm-1vvm， 罐压为0.03 Mpa -0.06Mpa， 转速为150 rpm -250rpm， 培养时间为24h-36h，得到一级种子液；
所述二级种子罐扩大培养包括以下步骤：
按照2%-15%的接种量将一级种子罐的一级种子液接入二级种子罐中进行培养，培养温度为30-34℃，通气量为0.6vvm-1.2vvm， 罐压为0.03Mpa -0.06Mpa， 转速为100rpm-200rpm， 培养时间为16h -28h，得到二级种子液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，控制所述摇瓶种子液的OD600为4-6；和/或，
控制所述一级种子液的OD600为4-6；和/或，
控制所述二级种子液的OD600为9-11。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，按照10%-30%的接种量将所述二级种子液接入所述前发酵罐中进行前发酵。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，采用的发酵菌种为类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）ATCC 21286。
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