CN115678926A - 连续发酵生产长链二元酸的方法以及长链二元酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵技术领域,公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法以及长链二元酸的生产方法,该方法包括:在发酵80‑150h后,向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,所述底物的流加速度、所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足以下关系:0.005h‑1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.3h‑1*V(发酵液);0.001h‑1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.006h‑1*V(发酵液)。本发明通过使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足特定的计量关系,能够在较高稀释率的条件下保持菌体的代谢活性,从而保证长链二元酸的持续生产,显著提高长链二元酸的产率和得率。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域,具体涉及一种连续发酵生产长链二元酸的方法以及长链二元酸的生产方法。
背景技术
长链二元酸由于分子结构的独特性和反应性,在多个领域有广泛的应用,以其为原料可以合成特种尼龙(聚酰胺)、高级香料、高档热熔胶、耐寒增塑剂、高级润滑油、高级防锈剂、高级油漆和涂料等。
目前,长链二元酸的合成主要有化学合成法和生物发酵法两种方法,化学合成法技术成熟,合成路线长,但需要在高温高压条件下进行,对催化剂要求比较苛刻,仅限于合成特定链长的二元酸;生物发酵法以长链烷烃或脂肪酸为底物,通过微生物发酵转化得到长链二元酸,其生产过程在常温常压下进行,并且可以规模化生产如从C9到C18等多种长链二元酸。相较于化学合成法,生物发酵法在原料可得性、产品多样性、生产效率、生产成本、环境优势等方面具有更加明显的优势,在近20年的产业化发展中,化学合成法已逐渐被生物发酵法所替代。
CN106755146B公开了一种连续发酵生产长链二元酸的方法及装置,通过膜过滤装置与种子罐进行偶联,通过定期补充新鲜的种子液来实现连续发酵过程,不仅增加了膜分离的成本,而且也增加了染菌风险。
CN109868294A公开了一种较低稀释率(0.001-0.006h-1)连续发酵生产长链二元酸的方法,通过在发酵100-150h后,连续流加底物,同时连续流加含营养盐的溶液,从而保证长链二元酸的持续生产。但该方法由于稀释率较低,导致产酸浓度偏高,过高浓度的物料在输送过程中的困难较大,不利于产业化的应用,而且该方法得到的长链二元酸的产率和得率也有待进一步提高。
发明内容
本发明的目的是为了进一步提高长链二元酸发酵生产过程的产率和得率,并且为了解决现有连续发酵生产长链二元酸的方法中存在的由于稀释率较低,导致产酸浓度偏高,后期物料输送困难的问题,提供一种连续发酵生产长链二元酸的方法以及长链二元酸的生产方法。
为了实现上述目的,本发明第一方面提供一种连续发酵生产长链二元酸的方法,该方法包括:在发酵80-150h后,向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,所述底物的流加速度、所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足以下关系:
0.005h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.3h-1*V(发酵液);
0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.006h-1*V(发酵液);
其中,V(发酵液)表示所述发酵液的体积,Q(含营养盐的溶液)表示所述含营养盐的溶液的流加速度,Q(底物)表示所述底物的流加速度。
优选地,所述底物的流加速度与所述发酵液的体积满足:0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.004h-1*V(发酵液)。
优选地,所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足:0.006h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.15h-1*V(发酵液)。
优选地,所述发酵体系的稀释率D为0.007-0.3h-1,优选为0.007-0.15h-1。
本发明第二方面提供一种长链二元酸的生产方法,该方法包括本发明第一方面所述的连续发酵生产长链二元酸的方法。
优选地,在采用连续发酵的方法生产长链二元酸之前,该方法还包括:将发酵菌种接入发酵培养基中进行发酵,在发酵10-100h后,向发酵液中加入底物以保证发酵液中底物的含量在1v%以上。
通过上述技术方案,本发明通过向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,并使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足特定的计量关系,能够在较高稀释率的条件下保持菌体的代谢活性,从而保证长链二元酸的持续生产,显著提高长链二元酸发酵生产过程的产率和得率;同时高稀释率还能改善后期物料输送困难的问题,有利于产业化的应用。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
现有连续发酵生产长链二元酸的难点之一在于,在长时间的发酵过程中,如何保持菌体活性和持续产酸,并获得高的二元酸产率和得率。申请人经过大量研究发现,底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度对菌体活性、二元酸产率和得率有重要的影响,保证二者达到一定平衡,能够实现优异的效果。为此,通过向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,并进一步使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积之间满足特定的计量关系,能够在较高稀释率的条件下保持菌体的代谢活性,从而保证长链二元酸的持续生产,并显著提高长链二元酸发酵生产过程的产率和得率。
如前所述,本发明第一方面提供一种连续发酵生产长链二元酸的方法,该方法包括:在发酵80-150h后,向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,所述底物的流加速度、所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足以下关系:
0.005h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.3h-1*V(发酵液);
0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.006h-1*V(发酵液);
其中,V(发酵液)表示所述发酵液的体积,Q(含营养盐的溶液)表示所述含营养盐的溶液的流加速度,Q(底物)表示所述底物的流加速度。
在本发明的一些实施例中,优选地,所述底物的流加速度与所述发酵液的体积满足:0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.004h-1*V(发酵液),这样更有利于使底物的流加速度与发酵液的体积达到一定的平衡,从而保证长链二元酸的持续生产,并提高长链二元酸的产率和得率。
在本发明的一些实施例中,优选地,所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足:0.006h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.15h-1*V(发酵液)。在该种优选情况下,能够进一步保证长链二元酸的持续生产,提高长链二元酸的产率和得率。
根据本发明一种优选的实施方式,针对30L的发酵罐,所述底物的流加速度为15-150mL/h,更优选为15-100mL/h;所述含营养盐的溶液的流加速度为75-7500mL/h,更优选为75-3750mL/h。
在本发明的一些实施例中,稀释率D对菌体活性、二元酸的产率和得率也有一定的影响,本发明通过对稀释率进行优化,能够进一步改善菌体活性、二元酸的产率和得率;同时,相对于现有技术所采用的低稀释率,本申请通过采用高稀释率,能够有效改善产酸浓度,便于后期物料的输送,从而利于产业化的应用,优选地,所述发酵体系的稀释率D为0.007-0.3h-1,优选为0.007-0.15h-1。本发明中,所述稀释率D=[Q(含营养盐的溶液)+Q(底物)]/V(发酵液)。
在本发明的一些实施例中,具有特定成分的含营养盐的溶液,能够保证发酵体系菌体生长的活力和良好的发酵状态,从而实现更好的技术效果,优选地,所述含营养盐的溶液含有0-2.5(w/v)%的葡萄糖、0.05-2.0(w/v)%的玉米浆、0-1.0(w/v)%的酵母膏、0.005-0.5(w/v)%的磷酸二氢钾、0.005-0.05(w/v)%的尿素以及0.01-0.15(w/v)%的硫酸铵。本发明中,单位“(w/v)%”表示质量体积比,即各成分的质量与含营养盐的溶液的体积的比值,质量以g计,体积以100mL计。
本发明对所述底物的选择范围较宽,优选地,所述底物选自C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的至少一种,优选为C10-C16的正烷烃,例如包括但不限于碳十一烷烃、碳十二烷烃、碳十三烷烃、碳十六烷烃等。在该种优选情况下,能够进一步改善长链二元酸的产率和得率。
在本发明的一些实施例中,优选地,所述长链二元酸的表达式为HOOC(CH2)nCOOH,其中n≥7,更优选为壬二酸、癸二酸、1,11-十一碳二元酸、1,12-十二碳二元酸、1,13-十三碳二元酸、1,14-十四碳二元酸、1,15-十五碳二元酸、1,16-十六碳二元酸、1,17-十七碳二元酸和1,18-十八碳二元酸中的至少一种。
本发明对连续发酵生产长链二元酸所采用的设备没有特别的限定,可以为本领域的常规设备,优选在发酵罐中进行发酵。在本发明所述连续发酵的方法中,发酵液的体积优选为发酵罐体积的50-85%,例如当使用30L的发酵罐进行连续发酵时,通过控制底物和含营养盐的溶液的进料速率以及出料速率,使得发酵罐中发酵液体积维持在15-25L之间。
本发明第二方面提供一种长链二元酸的生产方法,该方法包括如前所述的连续发酵生产长链二元酸的方法。通过采用本发明所述的连续发酵生产长链二元酸的方法,能够保证长链二元酸的持续生产,并在较高稀释率的条件下提高长链二元酸的产率和得率。
在本发明的一些实施例中,优选地,在采用连续发酵的方法生产长链二元酸之前,该方法还包括:将发酵菌种接入发酵培养基中进行发酵,在发酵10-100h后,向发酵液中加入底物以保证发酵液中底物的含量在1v%以上。
本发明对所述加入底物的方式没有特别的限定,可以分批次加入,也可以一次性全部加入,本领域技术人员可以根据实际情况按需选择。
在本发明的一些实施例中,优选地,所述发酵在发酵罐中进行,所述发酵的起始体积为发酵罐总体积的30-70%,例如,当发酵罐的体积为30L时,所述发酵的起始体积为9-21L。本发明中,所述发酵的起始体积为接种后的发酵液的体积。
在本发明的一些实施例中,优选地,以所述发酵的起始体积为基准,所述发酵菌种的接种量为10-30v%。本领域技术人员应该理解的是,发酵菌种在被接种至发酵培养基中之前,先将发酵菌种经过种子罐培养,当测定菌体浓度OD620稀释30倍后为0.5-1.0时停止培养,将此时种子罐中的种子液称为成熟种子液,然后再将成熟种子液接入发酵培养基中。因此,本发明中,发酵菌种的接种量为10-30v%,指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的10-30%。
在本发明中,对种子液的培养方法没有特别的限定,可以采用本领域常规的种子液培养方法,例如包括但不限于采用以下方法进行培养:
(i)摇瓶种子培养工艺:取菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量为50-100mL),在温度为28-32℃以及可选的初始pH值为6.0-6.5的条件下,在200-250rpm的转速摇床培养1-2天;
(ii)种子罐培养工艺:取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5-8L),控制接种量为10-30v%,并控制温度为28-32℃、压力为0.05-0.14MPa、通风量为0.3-0.7vvm,并通过补加浓度为10-40(w/w)%的液碱控制pH值为3.0-7.5,保持一定的搅拌速度,以使得种子培养过程的溶氧量DO在10%以上,培养15-30h,使得菌体浓度OD620稀释30倍后为0.5-1.0,即为成熟种子液。
在本发明的一些实施例中,优选地,该方法还包括:在接种前向发酵培养基中添加底物,相对于发酵培养基的体积,所述底物的添加量为0-10v%,优选为1-5v%;或者
在接种后向发酵的起始体积中添加底物,相对于发酵的起始体积,所述底物的添加量为0-10v%,优选为1-5v%。
本发明对所述发酵的条件没有特别的限定,可以为本领域的常规选择,优选地,所述发酵的条件包括:温度为28-32℃、压力为0.05-0.14MPa、pH值为5.5-7.5、通风量为0.3-0.7vvm。本发明中,所述发酵过程在搅拌条件下进行,本发明对搅拌速率没有特别的限定,可以为本领域的常规选择,优选为500-700rpm。本发明中,所述压力为表压。本发明对调控发酵液的pH值的方式没有特别的限定,可以为本领域的常规选择,例如包括但不限于使用浓度为10-40(w/w)%的碱液进行调控。
在本发明的一些实施例中,优选地,所述发酵的溶氧量在10%以上。本发明中,所述发酵的溶氧量通过在线溶氧电极进行测定。
在本发明的一些实施例中,优选地,所述发酵的菌体浓度OD620为9-24,稀释30倍后为0.3-0.8。本发明中,所述菌体浓度通过分光光度计进行测定。
本发明对所述发酵菌种的选择范围较宽,优选为热带假丝酵母或维斯假丝酵母。例如,热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614,其保藏编号为CCTCC M2015303;维斯假丝酵母(Candida viswanathii)菌株CAES2113,保藏编号CCTCC M2020048。
在本发明中,主要使用种子培养基、发酵培养基和发酵补料培养基三种培养基,本发明对各个培养基的成分没有特别的限定,可以采用本领域常用的培养基成分,例如包括但不限于采用以下3种培养基:
种子培养基:蔗糖的含量为1-3(w/v)%、玉米浆的含量为0.15-1(w/v)%、酵母膏的含量为0.2-1.5(w/v)%、KH2PO4的含量为0.4-1.5(w/v)%、尿素的含量为0.05-0.5(w/v)%。
发酵培养基:葡萄糖的含量为1-5(w/v)%、玉米浆的含量为0.1-0.9(w/v)%、酵母膏的含量为0.1-0.5(w/v)%、硝酸钾的含量为0.05-1.2(w/v)%、磷酸二氢钾的含量为0.05-1.0(w/v)%、尿素的含量为0.05-0.3(w/v)%、硫酸铵的含量为0.05-0.3(w/v)%、氯化钠的含量为0.05-0.2(w/v)%。
补料培养基:包括底物和含营养盐的溶液,其中,含营养盐的溶液中含有0-2.5(w/v)%的葡萄糖、0.05-2.0(w/v)%的玉米浆、0-1.0(w/v)%的酵母膏、0.005-0.5(w/v)%的磷酸二氢钾、0.005-0.05(w/v)%的尿素以及0.01-0.15(w/v)%的硫酸铵。上述所有培养基均在121℃下灭菌20min后备用。
为了清楚地描述本发明所述长链二元酸的生产方法,以下提供一种优选的具体实施方式进行说明:
(1)将在种子罐培养的种子液接入含有发酵培养基的发酵罐中,发酵的起始体积占发酵罐体积的30-70%,以发酵的起始体积为基准,种子液的接种量为10-30v%,在接种前或接种后向其中添加底物,相对于发酵培养基的体积或者发酵的起始体积,所述底物的添加量为1-5v%,然后控制温度为28-32℃、压力为0.05-0.14MPa、通风量为0.3-0.7vvm,并通过补加浓度为10-40(w/w)%的液碱使得发酵液的pH值为5.5-7.5进行发酵,保持一定的搅拌速度,以控制发酵的溶氧量在10%以上,在发酵10-100h后,向发酵液中分批次加入底物以保证发酵液中底物的含量在1v%以上;
(2)在发酵80-150h后,向发酵液中连续流加底物和含营养盐的溶液,控制流加速度使得底物的流加速度与发酵液的体积满足:0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.004h-1*V(发酵液);含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足:0.006h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.15h-1*V(发酵液),且控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.3-0.8,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在15-25L。
本发明中,对发酵液中二元酸浓度的测定方法没有特别的限定,可以采用本领域技术人员所熟知的技术,例如可以采用中国专利ZL95117436.3公开的测定方法。具体为,用盐酸溶液调节发酵液的pH值为3.0,然后加100mL乙醚用于萃取发酵液中的二元酸,再采用蒸发以去除乙醚,得到二元酸粉末;将得到的二元酸粉末溶解在乙醇中,并用0.1mol/L的NaOH溶液滴定,最终得到发酵液中的二元酸滴定量。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实例中,在没有特别说明的情况下,使用的各种原料均可从商业渠道获得。
所述长链二元酸的产率=产生的酸量/发酵的起始体积/发酵周期,单位为g/L/h;
所述长链二元酸的得率=(产生的酸量/消耗的底物)×100%;
稀释率D=[Q(含营养盐的溶液)+Q(底物)]/V(发酵液),其中,V(发酵液)表示发酵液的体积,Q(含营养盐的溶液)表示含营养盐的溶液的流加速度,Q(底物)表示底物的流加速度。
实施例1
1菌株
一株热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614,保藏编号为CCTCC M2015303。
2培养基
种子培养基:蔗糖的含量为3.0(w/v)%、玉米浆的含量为0.6(w/v)%、酵母膏的含量为1.0(w/v)%、KH2PO4的含量为1.2(w/v)%、尿素的含量为0.30(w/v)%。
发酵培养基:葡萄糖的含量为3.0(w/v)%、玉米浆的含量为0.6(w/v)%、酵母膏的含量为0.3(w/v)%、硝酸钾的含量为1.1(w/v)%、磷酸二氢钾的含量为0.8(w/v)%、尿素的含量为0.2(w/v)%、硫酸铵的含量为0.15(w/v)%、氯化钠的含量为0.1(w/v)%。
补料培养基:包括底物和含营养盐的溶液,其中,底物为碳十一烷烃;含营养盐的溶液中含有0.2(w/v)%的葡萄糖、0.15(w/v)%的玉米浆、0.1(w/v)%的酵母膏、0.012(w/v)%的磷酸二氢钾、0.015(w/v)%的尿素以及0.015(w/v)%的硫酸铵。
3培养方法
(i)摇瓶种子培养工艺:取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量为50mL),在初始pH值为6.3,温度为29℃的条件下,在220rpm的转速摇床培养1.5天;
(ii)种子罐培养工艺:取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量6L),控制接种量为20v%,并控制温度为29℃、压力为0.10MPa、通风量为0.6vvm,并通过补加浓度为25(w/w)%的液碱控制pH值为5.7,保持一定的搅拌速度,以使得种子培养过程的溶氧量DO在10%以上,培养20h,使得菌体浓度OD620稀释30倍后为0.6,即为成熟种子液。
4生产长链二元酸的方法
(1)将在种子罐培养的种子液接入含有发酵培养基的30L发酵罐中,发酵的起始体积为15L,以发酵的起始体积为基准,种子液的接种量为25v%,在接种后向其中添加碳十一烷烃,相对于发酵的起始体积,碳十一烷烃的添加量为5v%,然后控制温度为29℃、压力为0.10MPa、通风量为0.5vvm,通过补加浓度为30(w/w)%的液碱使得发酵液的pH值为5.7进行发酵,保持搅拌转速为600rpm,以控制发酵的溶氧量在10%以上,在发酵25h后,分批次加入碳十一烷烃,以使得发酵液中碳十一烷烃的含量在10v%以上;
(2)在发酵125h后,以35.2mL/h的流加速度向发酵液中连续流加碳十一烷烃,同时以132mL/h的流加速度向发酵液中连续流加上述含营养盐的溶液,控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.65,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在22L,从而持续生产1,11-十一碳二元酸。
经记录或计算,连续发酵的周期为300h,总发酵周期为425h;1,11-十一碳二元酸的产率为1.6g/L/h,总得率为93%,稀释率D为0.0076h-1。
对比例1
按照与实施例1相同的方法生产长链二元酸,不同之处在于,没有补料培养基;在4生产长链二元酸的方法中,在步骤(1)中,在发酵25h后,向发酵液中分批次加入碳十一烷烃,以使得发酵液中碳十一烷烃的含量在2v%以上,且没有步骤(2);
即在发酵160h后,菌体活力大幅下降,在发酵165h时停罐,1,11-十一碳二元酸的产率为1.2g/L/h,总得率为89%。
从实施例1和对比例1可以看出:相对于现有技术,本发明通过向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,并使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足特定的计量关系,能够使产酸速率从1.2g/L/h提高至1.6g/L/h,提高了33%;总得率从89%提高至93%。
实施例2
1菌株
一株热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614,保藏编号为CCTCC M2015303。
2培养基
种子培养基:蔗糖的含量为1.0(w/v)%、玉米浆的含量为0.30(w/v)%、酵母膏的含量为0.6(w/v)%、KH2PO4的含量为0.8(w/v)%、尿素的含量为0.25(w/v)%。
发酵培养基:葡萄糖的含量为2.0(w/v)%、玉米浆的含量为0.20(w/v)%、酵母膏的含量为0.25(w/v)%、硝酸钾的含量为0.05(w/v)%、磷酸二氢钾的含量为0.07(w/v)%、尿素的含量为0.15(w/v)%、硫酸铵的含量为0.20(w/v)%、氯化钠的含量为0.12(w/v)%。
补料培养基:包括底物和含营养盐的溶液,其中,底物为碳十二烷烃;含营养盐的溶液中含有0.3(w/v)%的玉米浆、0.2(w/v)%的酵母膏、0.008(w/v)%的磷酸二氢钾、0.05(w/v)%的尿素以及0.05(w/v)%的硫酸铵。
3培养方法
(i)摇瓶种子培养工艺:取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量为60mL),在温度为32℃的条件下,在250rpm的转速摇床培养1天;
(ii)种子罐培养工艺:取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5L),控制接种量为10v%,并控制温度为32℃、压力为0.10MPa、通风量为0.5vvm,并通过补加浓度为40(w/w)%的液碱控制pH值为6.2,保持一定的搅拌速度,以使得种子培养过程的溶氧量DO在10%以上,培养15h,使得菌体浓度OD620稀释30倍后为0.8,即为成熟种子液。
4生产长链二元酸的方法
(1)将在种子罐培养的种子液接入含有发酵培养基的30L发酵罐中,发酵的起始体积为10L,以发酵的起始体积为基准,种子液的接种量为20v%,在接种前向其中添加碳十二烷烃,相对于发酵培养基的体积,碳十二烷烃的添加量为5v%,然后控制温度为32℃、压力为0.05MPa、通风量为0.7vvm,通过补加浓度为40(w/w)%的液碱使得发酵液的pH值为6.2进行发酵,保持搅拌转速为600rpm,以控制发酵的溶氧量在10%以上,在发酵10h时,向发酵液中分批次加入碳十二烷烃,以使得发酵液中碳十二烷烃的含量在5v%以上;
(2)在发酵100h后,以64mL/h的流加速度向发酵液中连续流加碳十二烷烃,同时以120mL/h的流加速度向发酵液中连续流加上述含营养盐的溶液,控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.55,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在20L,从而持续生产1,12-十二碳二元酸。
经记录或计算,连续发酵的周期为400h,总发酵周期为510h;1,12-十二碳二元酸的产率为2.3g/L/h,总得率为100%,稀释率D为0.009h-1。
对比例2
按照与实施例2相同的方法生产长链二元酸,不同之处在于,没有补料培养基;且在4生产长链二元酸的方法中,没有步骤(2);
即在发酵170h后,菌体活力逐渐下降,在发酵180h时停罐,经计算1,12-十二碳二元酸的产率为1.5g/L/h,总得率为87%。
从实施例2和对比例2可以看出:相对于现有技术,本发明通过向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,并使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足特定的计量关系,能够使产酸速率从1.5g/L/h提高至2.3g/L/h,提高了53%,总得率从87%提高至100%。
实施例3
1菌株
一株热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614,保藏编号为CCTCC M2015303。
2培养基
种子培养基:蔗糖的含量为3.0(w/v)%、玉米浆的含量为1.0(w/v)%、酵母膏的含量为0.2(w/v)%、KH2PO4的含量为0.9(w/v)%、尿素的含量为0.5(w/v)%。
发酵培养基:葡萄糖的含量为5.0(w/v)%、玉米浆的含量为0.7(w/v)%、酵母膏的含量为0.30(w/v)%、硝酸钾的含量为0.55(w/v)%、磷酸二氢钾的含量为0.60(w/v)%、尿素的含量为0.20(w/v)%、硫酸铵的含量为0.2(w/v)%、氯化钠的含量为0.15(w/v)%。
补料培养基:包括底物和含营养盐的溶液,其中,底物为碳十三烷烃;含营养盐的溶液中含有0.5(w/v)%的葡萄糖、0.10(w/v)%的玉米浆、0.008(w/v)%的磷酸二氢钾、0.007(w/v)%的尿素以及0.15(w/v)%的硫酸铵。
3培养方法
(i)摇瓶种子培养工艺:取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量为100mL),在初始pH值为6,温度为30℃的条件下,在200rpm的转速摇床培养1天;
(ii)种子罐培养工艺:取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量8L),控制接种量为30v%,并控制温度为30℃、压力为0.14MPa、通风量为0.3vvm,并通过补加浓度为10(w/w)%的液碱控制pH值为7,保持一定的搅拌速度,以使得种子培养过程的溶氧量DO在10%以上,培养30h,使得菌体浓度OD620稀释30倍后为1.0,即为成熟种子液。
4生产长链二元酸的方法
(1)将在种子罐培养的种子液接入含有发酵培养基的30L发酵罐中,发酵的起始体积为15L,以发酵的起始体积为基准,种子液的接种量为10v%;在接种前向其中添加碳十三烷烃,相对于发酵培养基的体积,碳十三烷烃的添加量为3v%,然后控制温度为30℃、压力为0.14Mpa、通风量为0.3vvm,并通过补加浓度为10(w/w)%的液碱使得发酵液的pH值为6.4,保持搅拌转速为600rpm,以控制发酵的溶氧量在10%以上,在发酵80h后,向发酵液中分批次加入碳十三烷烃,以使得发酵液中碳十三烷烃的含量在2v%以上;
(2)在发酵140h后,以39.2mL/h的流加速度向发酵液中连续流加碳十三烷烃,同时以198mL/h的流加速度向发酵液中连续流加上述含营养盐的溶液,控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.65,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在22L,从而持续生产1,13-十三碳二元酸。
经记录或计算,连续发酵的周期为250h,总发酵周期为400h;1,13-十三碳二元酸的产率为1.8g/L/h,总得率为90%,稀释率D为0.01h-1。
对比例3
按照与实施例3相同的方法生产长链二元酸,不同之处在于,没有补料培养基;且在4生产长链二元酸的方法中,没有步骤(2);
即在发酵160h后,菌体活力逐渐下降,在发酵175h时停罐,经计算1,13-十三碳二元酸的产率为1.3g/L/h,总得率为85%。
从实施例3和对比例3可以看出:相对于现有技术,本发明通过向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,并使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足特定的计量关系,能够使产酸速率从1.3g/L/h提高至1.8g/L/h,提高了38%,总得率从85%提高至90%。
实施例4
1菌株
一株热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)菌株CAT H1614,保藏编号为CCTCC M2015303。
2培养基
种子培养基:蔗糖的含量为1.3(w/v)%、玉米浆的含量为0.35(w/v)%、酵母膏的含量为0.45(w/v)%、KH2PO4的含量为1.1(w/v)%、尿素的含量为0.5(w/v)%。
发酵培养基:葡萄糖的含量为4.5(w/v)%、玉米浆的含量为0.1(w/v)%、酵母膏的含量为0.15(w/v)%、硝酸钾的含量为1.2(w/v)%、磷酸二氢钾的含量为0.75(w/v)%、尿素的含量为0.3(w/v)%、硫酸铵的含量为0.18(w/v)%、氯化钠的含量为0.09(w/v)%。
补料培养基:包括底物和含营养盐的溶液,其中,底物为碳十六烷烃;含营养盐的溶液中含有0.15(w/v)%的玉米浆、0.015(w/v)%的磷酸二氢钾、0.015(w/v)%的尿素以及0.15(w/v)%的硫酸铵。
3培养方法
(i)摇瓶种子培养工艺:取热带假丝酵母的甘油管菌种接种于装有种子培养基的500mL三角瓶中(装液量为50mL),在初始pH值为6.3,温度为28℃的条件下,在240rpm的转速摇床培养1.5天;
(ii)种子罐培养工艺:取摇瓶种子接入装有种子培养基的10L种子罐中(装液量5L),控制接种量为30v%,并控制温度为28℃、压力为0.08MPa、通风量为0.6vvm,并通过补加浓度为15(w/w)%的液碱控制pH值为7.4,保持一定的搅拌速度,以使得种子培养过程的溶氧量DO在10%以上,培养28h,使得菌体浓度OD620稀释30倍后为0.9,即为成熟种子液。
4生产长链二元酸的方法
(1)将在种子罐培养的种子液接入含有发酵培养基的30L发酵罐中,发酵的起始体积为13L,以发酵的起始体积为基准,种子液的接种量为30v%;在接种前向其中添加碳十六烷烃,相对于发酵培养基的体积,碳十六烷烃的添加量为2v%,然后控制温度为28℃、压力为0.08MPa、通风量为0.6vvm,并通过补加浓度为15(w/w)%的液碱使得发酵液的pH值为7.4进行发酵,保持搅拌转速为600rpm,以控制发酵的溶氧量在10%以上,在发酵60h后,向发酵液中分批次加入碳十六烷烃,以使得发酵液中碳十六烷烃的含量在3v%以上;
(2)在发酵130h后,以27.2mL/h的流加速度向发酵液中连续流加碳十六烷烃,同时以170mL/h的流加速度向发酵液中连续流加上述含营养盐的溶液,控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.65,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在17L,从而持续生产1,16-十六碳二元酸。
经记录或计算,连续发酵的周期为320h,总发酵周期为450h;1,16-十六碳二元酸的产率为1.85g/L/h,总得率为75%,稀释率D为0.012h-1。
对比例4
按照与实施例4相同的方法生产长链二元酸,不同之处在于,没有补料培养基;且在4生产长链二元酸的方法中,没有步骤(2);
即在发酵150h后,菌体活力逐渐下降,在发酵165h时停罐,经计算1,16-十六碳二元酸的产率为1.3g/L/h,总得率为68%。
从实施例4和对比例4可以看出:相对于现有技术,本发明通过向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,并使底物的流加速度、含营养盐的溶液的流加速度与发酵液的体积满足特定的计量关系,能够使产酸速率从1.3g/L/h提高至1.85g/L/h,提高了42%,总得率从68%提高至75%。
实施例5
按照与实施例2相同的方法生产长链二元酸,不同之处在于,在4生产长链二元酸的方法中,将步骤(2)改变为:在发酵140h后,以80.5mL/h的流加速度向发酵液中连续流加碳十二烷烃,同时以690mL/h的流加速度向发酵液中连续流加含营养盐的溶液,控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.65,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在23L,从而持续生产1,12-十二碳二元酸。
经记录或计算,连续发酵的周期为500h,总发酵周期为610h;1,12-十二碳二元酸的产率为2.4g/L/h,总得率为100%,稀释率D为0.033h-1。
同理,通过比较实施例5和对比例2可以看出:相对于现有技术,本发明能够使产酸速率从1.5g/L/h提高至2.4g/L/h,提高了60%,总得率从87%提高至100%。
实施例6
按照与实施例2相同的方法生产长链二元酸,不同之处在于,在4生产长链二元酸的方法中,将步骤(2)改变为:在发酵140h后,以85.1mL/h的流加速度向发酵液中连续流加碳十二烷烃,同时以3450mL/h的流加速度向发酵液中连续流加含营养盐的溶液,控制发酵的菌体浓度OD620稀释30倍后为0.68,并且通过控制出料速率使得发酵液体积维持在23L,从而持续生产1,12-十二碳二元酸。
经记录或计算,连续发酵的周期为500h,总发酵周期为610h;1,12-十二碳二元酸的产率为2.45g/L/h,总得率为99%,稀释率D为0.15h-1。
同理,通过比较实施例6和对比例2可以看出:相对于现有技术,本发明能够使1,12-十二碳二元酸的产酸速率从1.5g/L/h提高至2.45g/L/h,提高了63%,总得率从87%提高至99%。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种连续发酵生产长链二元酸的方法,其特征在于,该方法包括:在发酵80-150h后,向发酵液中连续流加底物以及含营养盐的溶液,所述底物的流加速度、所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足以下关系:
0.005h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.3h-1*V(发酵液);
0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.006h-1*V(发酵液);
其中,V(发酵液)表示所述发酵液的体积,Q(含营养盐的溶液)表示所述含营养盐的溶液的流加速度,Q(底物)表示所述底物的流加速度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述底物的流加速度与所述发酵液的体积满足:0.001h-1*V(发酵液)≤Q(底物)≤0.004h-1*V(发酵液);和/或
所述含营养盐的溶液的流加速度与所述发酵液的体积满足:0.006h-1*V(发酵液)≤Q(含营养盐的溶液)≤0.15h-1*V(发酵液)。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述发酵体系的稀释率D为0.007-0.3h-1,优选为0.007-0.15h-1。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法,其特征在于,所述含营养盐的溶液含有0-2.5(w/v)%的葡萄糖、0.05-2.0(w/v)%的玉米浆、0-1.0(w/v)%的酵母膏、0.005-0.5(w/v)%的磷酸二氢钾、0.005-0.05(w/v)%的尿素以及0.01-0.15(w/v)%的硫酸铵。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法,其特征在于,所述底物选自C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的至少一种,优选为C10-C16的正烷烃;和/或
所述长链二元酸的表达式为HOOC(CH2)nCOOH,其中n≥7,优选为壬二酸、癸二酸、1,11-十一碳二元酸、1,12-十二碳二元酸、1,13-十三碳二元酸、1,14-十四碳二元酸、1,15-十五碳二元酸、1,16-十六碳二元酸、1,17-十七碳二元酸和1,18-十八碳二元酸中的至少一种。
6.一种长链二元酸的生产方法,其特征在于,该方法包括如权利要求1-5中任意一项所述的连续发酵生产长链二元酸的方法。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,在采用连续发酵的方法生产长链二元酸之前,该方法还包括:将发酵菌种接入发酵培养基中进行发酵,在发酵10-100h后,向发酵液中加入底物以保证发酵液中底物的含量在1v%以上。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述发酵在发酵罐中进行,所述发酵的起始体积为发酵罐总体积的30-70%;和/或
以所述发酵的起始体积为基准,所述发酵菌种的接种量为10-30v%。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,该方法还包括:在接种前向发酵培养基中添加底物,相对于发酵培养基的体积,所述底物的添加量为0-10v%,优选为1-5v%;或者
在接种后向发酵的起始体积中添加底物,相对于发酵的起始体积,所述底物的添加量为0-10v%,优选为1-5v%。
10.根据权利要求7-9中任意一项所述的方法,其特征在于,所述发酵的条件包括:温度为28-32℃、压力为0.05-0.14MPa、pH值为5.5-7.5、通风量为0.3-0.7vvm;和/或
所述发酵的溶氧量在10%以上;和/或
所述发酵的菌体浓度OD620为9-24,稀释30倍后为0.3-0.8。
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