CN108060192B

CN108060192B - 用于提高麦白霉素发酵水平的发酵培养基及补料方法

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Publication number: CN108060192B
Application number: CN201610986026.7A
Authority: CN
Inventors: 吴峰; 张葵; 周镪
Original assignee: CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL CO LTD; Peking University Founder Group Co Ltd; PKU Healthcare Industry Group
Current assignee: CHONGQING DAXIN PHARMACEUTICAL CO LTD; New Founder Holdings Development Co ltd; Peking University Medical Management Co ltd
Priority date: 2016-11-09
Filing date: 2016-11-09
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2036-11-09
Also published as: CN108060192A

Abstract

本发明提供一种用于提高麦白霉素发酵水平的发酵培养基，包括葡萄糖1.5‑3.0％、黄豆粉2‑5％、酵母粉0.1‑0.3％、鱼粉0.1‑0.5％、磷酸二氢钾0.05‑0.2％、硫酸镁0.05‑0.2％和油1‑10％。本发明还提供一种提高麦白霉素发酵水平的方法，利用上述培养基，以生米卡链霉菌作为发酵菌种，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，通过补加葡萄糖溶液，从而提高麦白霉素的发酵水平以及吉他霉素的比例。本发明简单易行，利用本发明方法发酵生产麦白霉素，含量可达3400‑4000mg/L，麦迪霉素A1所占重量比约为58.38‑59.75％，吉他霉素A6所占重量比可达24.72‑29.72％；而发酵后麦白霉素的罐产是没有补加葡萄糖溶液对照的约1.2倍以上，A6组分可提高约25％以上。

Description

用于提高麦白霉素发酵水平的发酵培养基及补料方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵及生物制药技术领域，具体地说，涉及一种用于提高麦白霉素发酵水平的发酵培养基及补料方法。

背景技术

麦白霉素(Meleumycin，MLM)是由我国科研工作者相继从四川、广东土壤中分离出的链霉菌(S.mycarofaciens10204及1748)，经发酵提炼而得。麦白霉素对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化脓性链球菌和肺炎球菌中的红霉素敏感菌有较好的抗菌作用，对细小的链球菌和淋病奈瑟氏球菌等其它常见临床致病菌有一定的抗菌活性。

2005版药典对麦迪霉素的要求是含麦迪霉素A1不得低于35.0％。随着药典的改版，对麦白霉素的要求进一步提高。2010年版药典二部规定麦白霉素中麦迪霉素A1应不低于48％，吉他霉素A6应不低于12％，A1、A2、A4、A6、A8总和应不低于70％。然而，目前在科研和实际生产中，麦白霉素产生菌发酵所产生的吉他霉素A6所占比例偏低，产品存在不合格的风险较大。

实验过程中发现麦白霉素发酵菌体对氧的需求量较高，当菌体浓度过高造成发酵过程氧供应不足，影响产量。如果菌体浓度过低，产麦白霉素速度较慢，发酵周期过长，菌体老化，同样达不到理想的效果。因此改善发酵液的溶氧是解决上述问题，提高发酵水平的有效途径。同时，麦白霉素在发酵过程中对代谢pH的要求比较高，代谢过程中pH在5-6时，A6组分的增长最佳。一旦代谢过程pH升高，溶氧降低速度会增快，A6组分的增长也会减缓甚至停止，同时菌种会更容易自溶导致发酵液起泡，不仅影响发酵产量还影响提炼压滤。尝试补酸只能短暂地控制pH的升高，很快pH又会快速上升，同时通过补酸来调控发酵代谢环境，对菌种的刺激作用大，并不能解决A6组分增长减缓甚至停滞的问题。

发明内容

本发明旨在解决现有麦白霉素发酵生产工艺中出现代谢pH升高同时伴随溶氧不足，最终导致吉他霉素滞涨以及菌体自溶的问题，提供一种用于提高麦白霉素发酵水平的补料方法。

本发明的另一目的是提供一种用于提高麦白霉素发酵水平的发酵培养基。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种麦白霉素发酵用培养基，所述培养基中含有以下各组分：葡萄糖1.5-3.0％、黄豆粉2-5％、酵母粉0.1-0.3％、鱼粉0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.05-0.2％和玉米油1-10％。

上述培养基中，葡萄糖为碳源，此外，植物油、糖蜜、蔗糖、糊精、麦芽糊精、淀粉等也可作为碳源；黄豆粉、酵母粉和鱼粉为氮源，此外，豆粕粉、蛋白胨、花生饼粉等也可作为氮源；无机盐还可以包括磷酸氢二钾、氯化钠等。由以上碳源、氮源及无机盐组成的培养基均属于本发明保护范围。

优选地，所述培养基中含有以下各组分：葡萄糖2％、黄豆粉4％、酵母粉0.2％、鱼粉0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％和玉米油8％。

本发明提供一种提高麦白霉素发酵水平的方法，利用上述麦白霉素发酵用培养基，以生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)作为发酵菌种，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，通过补加葡萄糖溶液，在改善发酵液中的溶氧量的同时有效调节了发酵代谢过程料液pH，从而提高麦白霉素的发酵水平，以及提高吉他霉素组分含量(即提高A6比例)。

前述方法中，补加葡萄糖溶液的浓度为5％-10％，用量为发酵液体积的2％-10％。优选地，葡萄糖溶液的用量为发酵液体积的4％-7％。更优选地，所补加的葡萄糖溶液的温度为26-28℃。

前述方法中，葡萄糖溶液的补加方式为一次性流动补加，流加速率为200ml/h。

前述方法包括以下步骤：

1)种子液的制备：制得的种子液中活菌量为1×10⁷-1×10⁸CFU/mL；

2)麦白霉素的发酵生产：按8-10％的接种量(优选10％)，将步骤1)制备的种子液接入装有30L麦白霉素发酵用培养基的容积为50L的发酵罐中，于26-28℃，搅拌转速100-300rpm，空气流量600L/h的条件下进行发酵培养，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，补加葡萄糖溶液，发酵周期为5-8天。

本发明发酵所用菌株为S.mycarofaciens var.Sichuansis。其它可以用于麦白霉素发酵生产的菌株也属于本发明保护范围。

其中，所述种子液的制备方法如下：将生米卡链霉菌接入高氏一号固体斜面培养基，于28℃培养5天；然后将斜面培养基上的菌种接入装有液体种子培养基的摇瓶中，装液量100mL/750mL，于28℃，搅拌转速220rpm，振荡培养30小时，即得种子液。

所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖1-2％、淀粉1-3％、黄豆粉2-4％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、硫酸铵0.2-0.5％和碳酸钙0.1-0.3％。

利用本发明方法发酵生产的麦白霉素，含量可达3400-4000mg/L，麦迪霉素A1占麦白霉素的重量比约为58.38-59.75％，吉他霉素A6占麦白霉素的重量比可达24.72-29.72％；而发酵后麦白霉素的罐产是没有补加葡萄糖溶液对照的约1.2倍以上，A6组分可提高约25％以上。发酵液质量的提高为最终成品质量奠定了基础，使之符合并高于药典要求，降低了不合格产品产生的风险，对实际生产具有重要意义。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例所用菌株为S.mycarofaciens var.Sichuansis。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1用于提高麦白霉素发酵水平的补料方法

本实施例提供的麦白霉素发酵用培养基含有以下各组分：葡萄糖2％、黄豆粉4％、酵母粉0.2％、鱼粉0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％和玉米油8％。发酵方法如下：

1、种子液的制备：将生米卡链霉菌接入高氏一号固体斜面培养基，于28℃培养5天；然后将斜面培养基上的菌种接入装有液体种子培养基的摇瓶中，装液量100mL/750mL，于28℃，搅拌转速220rpm，振荡培养30小时，即得种子液。所得种子液中活菌量约为6×10⁷CFU/mL。

所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖1％、淀粉2％、黄豆粉3％、磷酸二氢钾0.03％、硫酸铵0.3％和碳酸钙0.2％。

2、麦白霉素的发酵生产：按10％的接种量，将步骤1制备的种子液接入装有30L麦白霉素发酵用培养基的容积为50L的发酵罐中，于28℃，搅拌转速200rpm，空气流量600L/h的条件下进行发酵培养，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，一次性流动补加浓度6％的葡萄糖溶液1.5L，流加速率为200ml/h，发酵周期为6天。发酵结束，放罐，发酵液pH为5.68，放罐体积28.5L。

用高效液相色谱法检测麦白霉素的各组分，采用抗生素微生物检定法测定麦白霉素含量，检测方法参见2010版药典。

本实施例中麦白霉素含量为4030mg/L，麦迪霉素A1占麦白霉素的重量比为59.78％，吉他霉素A6占麦白霉素的重量比为29.72％。而没有添加葡萄糖溶液的对照组(其它工艺步骤和配料同上)，发酵液麦白霉素含量3100mg/L,发酵结束后测得麦白霉素中A1的重量比为56.45％，A6的重量比为19.58％，放罐体积27L。补加葡萄糖溶液后发酵产生的麦白霉素放罐体积比对照组高出约5％。总量是没有添加葡萄糖溶液的对照组产生麦白霉素罐产的约1.37倍。

实施例2用于提高麦白霉素发酵水平的补料方法

本实施例提供的麦白霉素发酵用培养基含有以下各组分：葡萄糖1.5％、黄豆粉5％、酵母粉0.1％、鱼粉0.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁0.2％和玉米油1％。

发酵方法同实施例1所述，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，一次性流动补加浓度3％葡萄糖溶液3L，流加速率为200ml/h，发酵周期为5天。发酵结束，放罐，发酵液pH为5.82，放罐体积30L。

本实施例中麦白霉素含量为3410mg/L，麦迪霉素A1占麦白霉素的重量比为58.35％，吉他霉素A6占麦白霉素的重量比为25.46％。补加葡萄糖溶液后发酵产生的麦白霉素放罐体积比对照组高出约10％。总量是没有添加葡萄糖溶液的对照组产生麦白霉素罐产的约1.21倍。

实施例3用于提高麦白霉素发酵水平的补料方法

本实施例提供的麦白霉素发酵用培养基含有以下各组分：葡萄糖3％、黄豆粉2％、酵母粉0.3％、鱼粉0.1％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％和玉米油10％。

发酵方法同实施例1所述，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，一次性流动补加浓度15％葡萄糖溶液0.6L，流加速率为200ml/h，发酵周期为8天。发酵结束，放罐，发酵液pH为5.58，放罐体积27.6L。

本实施例中麦白霉素含量为3720mg/L，麦迪霉素A1占麦白霉素的重量比为58.78％，吉他霉素A6占麦白霉素的重量比为24.72％。补加葡萄糖溶液后发酵产生的麦白霉素放罐体积比对照组高出约2％。总量是没有添加葡萄糖溶液的对照组产生麦白霉素罐产的约1.22倍。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种提高麦白霉素发酵水平的方法，其特征在于，利用麦白霉素发酵用培养基，以生米卡链霉菌S.mycarofaciens var.Sichuansis作为发酵菌种，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，通过补加葡萄糖溶液，从而提高麦白霉素的发酵水平，以及提高吉他霉素组分含量；

补加葡萄糖溶液的浓度为5％-10％，用量为发酵液体积的2％-10％；

包括以下步骤：

1)种子液的制备：制得的种子液中活菌量为1×10⁷-1×10⁸CFU/mL；2)麦白霉素的发酵生产：按8-10％的接种量，将步骤1)制备的种子液接入装有30L麦白霉素发酵用培养基的容积为50L的发酵罐中，于26-28℃，搅拌转速100-300rpm，空气流量600L/h的条件下进行发酵培养，当发酵液的pH值由最低点反弹至6.0时，补加葡萄糖溶液，发酵周期为5-8天；葡萄糖溶液的补加方式为一次性流动补加，流加速率为200ml/h；

所述麦白霉素发酵用培养基中含有以下各组分：葡萄糖1.5-3.0％、黄豆粉2-5％、酵母粉0.1-0.3％、鱼粉0.1-0.5％、磷酸二氢钾0.05-0.2％、硫酸镁0.05-0.2％和玉米油1-10％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，补加葡萄糖溶液的用量为发酵液体积的4％-7％；所补加的葡萄糖溶液的温度为26-28℃。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述麦白霉素发酵用培养基中含有以下各组分：葡萄糖2％、黄豆粉4％、酵母粉0.2％、鱼粉0.4％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.1％和玉米油8％。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)所述种子液的制备方法如下：将生米卡链霉菌接入高氏一号固体斜面培养基，于28℃培养5天；然后将斜面培养基上的菌种接入装有液体种子培养基的摇瓶中，装液量100mL/750mL，于28℃，搅拌转速220rpm，振荡培养30小时，即得种子液；

其中，所述液体种子培养基的配方为：葡萄糖1-2％、淀粉1-3％、黄豆粉2-4％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、硫酸铵0.2-0.5％和碳酸钙0.1-0.3％。