CN104651427A - 一种制备多拉菌素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新的多拉菌素的制备方法，更具体地，涉及一种多拉菌素的发酵方法，其特征在于发酵过程添加2次环己羧酸或其盐，第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后22-60小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后170-194小时。本发明所述方法的发酵产量高，并且适应于工业化大生产。本发明所述方法可以适用于500L发酵罐通过发酵方式生产多拉菌素。
Description
技术领域
本发明涉及多拉菌素的制备方法，更具体地，本发明涉及一种多拉菌素的发酵方法。
背景技术
多拉菌素由阿维链霉菌的bkdFGH基因缺失突变株发酵过程中添加环己羧酸生物合成，为阿维菌素第三代衍生物。多拉菌素与阿维菌素结构相似，区别在于多拉菌素的25位为环己基，而阿维菌素的25位为二甲基。多拉菌素为25-环己基-5-O-去甲基-25-去(1-甲基丙基)阿维菌素Ala，化学式为C50H74O14，结构式如下式所示：
多拉菌素是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物，与阿维菌素相比，其在动物体内清除率较低、生物半衰期较长、生物利用率比较高，而且其注射剂的刺激性小，可进行肌肉注射，给药方便，持效期更长，一次给药就可以杀死动物体内的线虫和体外寄生虫，不需要重复给药，因此其在养猪业及宠物业上应用的比较广泛。
目前多拉菌素的生产技术由美国辉瑞公司封锁，公开的关于多拉菌素发酵工艺的文献中，多拉菌素的发酵产量低，如ZL201010568764.2中经过优化筛选后增产为300％仅达到60ug/ml。ZL200710043687.7中筛选了突变的可生产多拉菌素的菌株，多拉菌素的前体为24小时后每瓶300ml添加225ul无菌的20％环己甲酸钠，该专利中并没有给出发酵后的多拉菌素产量。
姜薇的硕士论文《多拉菌素的突变生物合成及发酵条件优化》中，对于发酵培养基中环己烷的添加时间和添加量进行了优化筛选，发现在发酵前，发酵12h、24h、48h及5d时添加，均有多拉菌素产生，但是产量上有一定差别，添加浓度大于400ug/mL时，对多拉菌素产生抑制作用。由于环己羧酸对细胞具有一定毒性，不利于菌株的生长，为不影响菌株的生物量，选择在发酵进行48h后，以300ug/mL的浓度添加。得出环己烷在发酵48h后以300ug/mL的浓度添加，多拉菌素产量最高，该文献中公开的多拉菌素的发酵单位最高可以达到68.51ug/mL。
吴婕的硕士论文《多拉菌素产生菌的诱变育种及培养条件的优化》中，对菌种进行了优化，同时优选了环己甲酸的添加量和发酵时长，最终得出发酵第24小时时，前体20％环己甲酸用量为250ul/30ml，发酵11天时多拉菌素的产量最高，该文献中公开的多拉菌素的发酵 单位最高可以达到105.7ug/mL。
多拉菌素发酵技术不仅存在发酵产量低的问题，而且大多都还处于实验室阶段，工业化进程缓慢，因此多拉菌素急需要一种适用于工业化大生产和发酵产量高的技术。
发明内容
为了克服现有技术的以上缺陷，本发明提供一种新的多拉菌素的制备方法，更具体地，涉及一种多拉菌素的发酵方法。
本发明所述方法的发酵产量高，并且适应于工业化大生产。
本发明所述方法可以适用于500L发酵罐通过发酵方式生产多拉菌素。
多拉菌素主要存在于发酵后的菌丝体中，是阿维链霉菌的次级代谢产物，因此影响其合成的因素很多，如碳源、氮源、温度等。另外，发酵产生多拉菌素的一个重要环节是加入前体物质环己羧酸或其盐，其补加量以及补加时间是工艺控制的重点。例如，环己羧酸或其盐添加量少，阿维链霉菌的代谢活动不会受到太大的影响，但是同时会因可转化为多拉菌素的前体少导致多拉菌素的发酵产量低；而添加过量的环己羧酸或其盐，会影响发酵培养基的物质平衡，过多的环己羧酸或其盐会抑制阿维链霉菌的代谢活动，也会导致多拉菌素发酵产量低。
从以上的公开文献可以看到，现有技术的环己羧酸或其盐在发酵过程中只添加一次，添加的方式为配制发酵培养基时直接加入，在发酵后24小时或者48小时加入，各文献中添加量也可以相差十倍以上，并没有统一的添加标准。
在开发多拉菌素发酵工艺过程时，发明人发现阿维链霉菌生长情况会随着发酵时间呈现一定的变化，定期的监测阿维链霉菌的生长情况，发明人意外的发现，根据阿维链霉菌的生长情况，可以分2次加入环己羧酸或其盐以降低环己羧酸或其盐对菌种活力的影响；更进一步的，发明人发现在发酵过程的前中期和后期，分2次加入环己羧酸或其盐，可以有效的增加前体物质环己羧酸或其盐的投料总量，同时尽可能降低前体物质环己羧酸或其盐对菌种的抑制作用，从而增加多拉菌素的发酵产量；发酵过程中2次添加环己羧酸的时间需要根据长期监测的阿维链霉菌生长情况确定，严格控制添加环己羧酸的时间可以有效的提高多拉菌素的发酵产量。
本发明的目的在于提供一种新的多拉菌素的制备方法，其特征在于发酵过程添加2次环己羧酸或其盐，第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后22-60小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后170-194小时。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后34-52小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后176-194小时。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后38-42小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后180-194小时。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.6-1.4g/L；第二次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.3-1.0g/L。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.9-1.1g/L； 第二次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.5-0.7g/L。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于发酵培养基的组分为玉米淀粉、脱脂大豆粉、棉籽饼粉、五水磷酸三镁、轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、氯化钠。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于发酵过程中，控制罐温25-30℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80-300rpm。
所述多拉菌素制备方法，其特征在于发酵培养基中菌种接种量为10-11％。
在姜薇的硕士论文《多拉菌素的突变生物合成及发酵条件优化》中考察了糖类对于发酵产量的影响，结果发现糖类不会产生显著影响。但是发明人在研究多拉菌素发酵工艺中发现，在发酵的中后期补入糖类，可以增加发酵产量。
本发明所述的多拉菌素制备方法，还包括了发酵过程中使用补料糖，补料糖的添加时间为发酵后的96-182小时。
所述的多拉菌素制备方法，其特征在于补料糖选在麦芽糖糊精、玉米淀粉、葡萄糖中的一种或几种。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步详述，实施例中所提及的内容并非对本发明的限定，材料配方及工艺参数的选择可因地制宜而对结果无实质性的影响。
实施例1
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养228小时。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵40小时加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵180小时加入，补加量为0.6g/L。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％；最后放罐单位773mg/L。 环己甲酸盐为环己甲酸溶液中加入等物质的量NaOH，并配制成20％浓度的环己甲酸盐溶液。
实施例2
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
补料策略：(1)试验1：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵40小时加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵180小时加入，补加量为0.6g/L。
(2)试验2：补加一次前体环己甲酸盐，补加环己甲酸盐在发酵40小时加入，补加量为1.6g/L。
(3)试验3：补加一次前体环己甲酸盐，补加环己甲酸盐在发酵180小时加入，补加量为1.6g/L。
结果见表1。
表1：前体环己羧酸添加次数筛选结果
| 试验项目 | 周期 | 批次 | 平均发酵单位(mg/L) |
| 试验1 | 13天 | 3 | 742 |
| 试验2 | 13天 | 3 | 534 |
| 试验3 | 13天 | 3 | 495 |
结论：从表1的前体环己羧酸添加次数筛选结果可以得出，试验2和试验3的平均发酵单位分别为534mg/L、495mg/L，均显著低于试验1的平均发酵单位742mg/L，即说明补加两次前体环己羧酸更加符合菌株的生长情况。补加一次前体环己羧酸，不论是在发酵的前中期还是在发酵的后期，多拉菌素的发酵单位不如补加两次前体环己羧酸的发酵单位。补加两次前体环己羧酸更加符合菌株的生长情况，不抑制菌株的生长活动，同时提供足够的前体环己羧酸，能够有效提高多拉菌的发酵单位。
实施例3
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵T小时加入，补加量为0.8g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵180小时加入，补加量为0.8g/L。结果见表2。
表2：前体环己羧酸第一次添加时间筛选结果
结论：从表2的前体环己羧酸第一次添加时间筛选结果可知，第一次补加前体环己羧酸的时间在38-42小时之间时为发酵38-42小时时，多拉菌素的平均发酵单位分别为706mg/L、674mg/L、637mg/L，较其他时间段补料其平均发酵单位会显著提高；当第一次补加前体环己羧酸的时间为发酵40小时时，多拉菌素的平均发酵单位最高，第一次补加前体环己甲酸盐 的时间为发酵40小时是最优补加前体环己甲酸盐的时间。发酵单位会显著的提高，特别是第一次补料前体环己羧酸的时间为发酵40小时时，多拉菌素的发酵单位最优。
实施例4
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵38小时加入，补加量为0.9g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵Y小时加入，补加量为0.6g/L。
结果见表3。
表3：前体环己羧酸第二次添加时间筛选结果
结论：从表3的前体环己羧酸第二次添加时间筛选结果可知，第二次补加前体环己羧酸的时间为发酵180-194小时时，多拉菌素的平均发酵单位会显著的提高；特别是第二次补加前体环己羧酸的时间为发酵180小时时，多拉菌素的平均发酵单位最高；第二次补加前体环己羧酸的时间最优为发酵180小时。
实施例5
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵40小时加入，补加量为X g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵180小时加入，补加量为0.5g/L。
结果见表4。
表4：前体环己羧酸第一次添加量筛选结果
结论：从表4的前体环己羧酸第一次添加量筛选结果可得出，第一次添加量为发酵0.9-1.1g/L时，多拉菌素的平均发酵单位会显著的提高，特别是第一次添加量为发酵1.0g/L时，多拉菌素的平均发酵单位最高最优；第一次添加量最优为发酵1.0g/L。
实施例6
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵40小时加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵180小时加入，补加量为Z g/L。
结果见表5。
表5：前体环己羧酸第二次添加量筛选结果
结论：从表5的前体环己羧酸第二次添加量筛选结果可得出，第二添加量为发酵0.5-0.7g/L时，多拉菌素的平均发酵单位会显著的提高，特别是第二次添加量为发酵0.5g/L时，多拉菌素的平均发酵单位最高最优；第二次添加量最优为发酵0.5g/L。
实施例7
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养228小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵22小时加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵170小时加入，补加量为0.6g/L。
发酵中后期添加玉米淀粉作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例8
菌株：菌种Streptomyees avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养228小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵34小时加入，补加量为1.0g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵176小时加入，补加量为0.6g/L。
发酵中后期添加麦芽糖糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例9
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵38小时加入，补加量为1.4g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵176小时加入，补加量为0.3g/L。
发酵中后期添加玉米淀粉作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例10
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵60小时加入，补加量为1.1g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵194小时加入，补加量为0.5g/L。
发酵中后期添加玉米淀粉作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例11
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵52小时加入，补加量为0.6g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵188小时加入，补加量为1.0g/L。
发酵中后期添加玉米淀粉作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例12
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵42小时加入，补加量为0.9g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵182小时加入，补加量为0.7g/L。
发酵中后期添加玉米淀粉作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例13
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵38小时加入，补加量为0.9g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵182小时加入，补加量为0.7g/L。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例14
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵42小时加入，补加量为1.1g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵188小时加入，补加量为0.5g/L。
发酵中后期添加麦芽糊精作为补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
实施例15
菌株：菌种Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由国家粮食局科学研究院筛选保藏。
多拉菌素发酵培养基
配制350L发酵培养基，121～123℃灭菌20min。接种量10％，接种后以罐温28.0±0.5℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80rpm进行培养312小时。发酵罐的体积为500L。
补料策略：分两次补加前体环己甲酸盐，第一次补加环己甲酸盐在发酵42小时加入，补加量为1.1g/L；第二次补加环己甲酸盐在发酵172小时加入，补加量为0.5g/L。
发酵中后期添加补料糖，控制总糖在2.5～4.5％。
结果见表6。
表格6：补料糖的筛选结果
| 试验项目 | 周期 | 批次 | 平均发酵单位(mg/L) |
| 麦芽糖糊精 | 13天 | 3 | 782 |
| 玉米淀粉 | 13天 | 3 | 731 |
| 葡萄糖 | 13天 | 3 | 587 |
结论：从表格6数据可以看出，补料糖的种类会影响多拉菌素的平均发酵单位；当补加麦芽糖糊精作为补料糖时，多拉菌素的平均发酵单位显著提高。
Claims (10)
1.一种多拉菌素的制备方法，其特征在于发酵过程添加2次环己羧酸或其盐，第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后22-60小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后170-194小时。
2.如权利要求1所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后34-52小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后176—194小时。
3.如权利要求2所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后38-42小时，第二次添加环己羧酸或其盐的时间为发酵后180-194小时。
4.如权利要求1所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.6-1.4g/L；第二次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.3-1.0g/L。
5.如权利要求4所述多拉菌素制备方法，其特征在于第一次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.9-1.1g/L；第二次添加环己羧酸或其盐的添加量为0.5-0.7g/L。
6.如权利要求1或4所述多拉菌素制备方法，其特征在于发酵培养基的组分为玉米淀粉、脱脂大豆粉、棉籽饼粉、五水磷酸三镁、轻质碳酸钙、磷酸氢二钾、氯化钠。
7.如权利要求1或4所述多拉菌素制备方法，其特征在于发酵过程中，控制罐温25-30℃、罐压0.04MPa、流量25m3/hr、转速80-300rpm。
8.如权利要求1或4所述多拉菌素制备方法，其特征在于发酵培养基中菌种接种量为10-11％。
9.如权利要求1或4所述的多拉菌素制备方法，还包括了发酵过程中使用补料糖，补料糖的添加时间为发酵后的96-182小时。
10.如权利要求9所述的多拉菌素制备方法，其特征在于补料糖选在麦芽糖糊精、玉米淀粉、葡萄糖中的一种或几种。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN104561180A (zh) * | 2014-12-26 | 2015-04-29 | 宁夏泰瑞制药股份有限公司 | 一种突变阿维链霉菌发酵生产多拉菌素的培养基及补料方法 |
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