KR100892355B1 - 치마버섯 균사체의 반연속식 액상배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 대량생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산하는 치마버섯 균사체의 반연속식 배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 대량 생산 공정 개발에 관한 것이다.

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Description

치마버섯 균사체의 반연속식 액상배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 대량생산 방법 {Methods for large-scale production of β-1,6-branched-β-1,3-glucan using semi-continuous fermentation performed with Schizophyllum commune}

본 발명은 치마버섯(Schizophyllum commune) 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 (β-1,6-branched-β-1,3-glucan)(이하, "베타 글루칸"이라 칭함)의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 회분식 배양과 비교해 베타 글루칸 생산성이 약 3배 이상 증가한 반연속식 액상배양을 통해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.

다당류(polysaccharide)는 보편적으로 살아있는 개체들로부터 생산되는데 이 다당류들은 복잡한 화학적 구조, 생리적 기능과 식품공학, 생분해성 플라스틱, 화장품, 농경학, 연료와 그 외의 다양한 산업분야에서 넓은 범위의 잠재적 응용력이 존재한다. 그러나 현재까지 자연계로부터 발견된 수많은 다당류(polysaccharide)의 종류에 비하여 산업화되어 사용되고 있는 다당류의 종류는 극히 제한적이다. 그 중 사용되고 있는 효모의 세포벽, 버섯류, 곡류 등에 존재하는 베타 글루칸(β-glucan)은 여러 가지 영역에서 효능에 대한 평가가 이루어지고 있는데 버섯 중 특 히 치마버섯 유래 다당류의 베타 글루칸은 피부 질병 및 염증을 막아주고 자외선 차단효과와 항산화 효과가 있으며, 화상이나 상처에 의해 야기된 괴사조직 제거와 손상된 상피조직 재생에 관여하는 피부 면역체계를 활성화시킴으로써 치유 효과가 있다고 알려져 있다.

치마버섯(Schizophyllum commune)은 싱어(Singer, R.)의 분류서(The Agaricales in modern taxonomy, 1975)에 의하면 분류학상으로 담자균류의 주름버섯목 송이과 치마버섯속에 속하는 목질부후균으로, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸 다당류(β-1,6- branched-β-1,3-glucan polysaccaride)를 세포외로 생산하는 균주이다.

치마버섯은 거친 식감으로 인해 중국에서만 일부 식용하는 것으로 알려져 있었으나, β-1,6-분지-β-1,3-글루칸 구조의 ‘Schizophyllan'이라는 다당체의 생리활성이 알려지면서 버섯자체로는 이용이 어려우나 균사체 등으로부터 추출하여 보습 효과, 항-종양 활성, 마크로파지 자극, 항생(anti-biotic) 활성 등의 면역학적 효과(Shimizu et al. 1992; Komatsu et al. 1973)를 이용하여 약품, 화장품 등의 유효기능성분으로서 다양하게 활용되고 있다.

치마버섯으로부터 유래된 schizophyllan은 베타-1,3-글루칸 주당쇄에 규칙적인 베타-1,6-잔기를 갖는 글루칸으로서, 표고버섯(Lentinus edodes), 느타리버섯(Pleurotus ostreatus), 상황버섯(Phellinus linteus) 등의 다른 버섯류로부터 생산된 β-glucan의 분자량이 수십만 내지 200만인데 비해 치마버섯 유래 schizophyllan의 분자량은 200만 ~ 500만으로 상당히 크며, 다른 버섯류의 β- glucan이 불균일한 당조성과 구조를 갖는데 비하여 분지된 균일하고 특유한 구조를 갖고 있으며, 세포외로 분비되는 안정한 중성 다당류의 특성을 갖고 있다. [참조: Kenichi T., Saimei T. Synthesis of the repeating units of Schizophyllan. 1986].

한편, 치마버섯 유래의 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법 및 이를 함유하는 외용제 조성물이 대한민국특허 제99-76537호에 개시되어 있으며, 치마버섯의 균사체를 회분식 액체 배양하여 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산하는데 있어서, 배양도중에 활성탄을 첨가하거나 활성탄 첨가 후 포도당을 더 첨가시키는, 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조방법을 개시한다.

종래의 회분식 배양 방법은 대사산물의 생성을 유도하거나 조절하기가 어려운 결점을 가진다. 또한, 치마버섯과 같이 균사를 형성하는 담자균류는 독특한 3차원적 특성으로 인해 고농도 배양을 할 경우, 배양액의 점도가 상승하여 물질 및 산소전달이 저해되어 궁극적으로 생산성이 감소하는 결과가 나타나는 경우가 많은데, 회분식 배양 방법은 영양 물질의 공급이나 제거 없이 반응기에서 세포를 배양하기 때문에 궁극적으로 생산성이 감소하는 한계를 가지고 있다.

본 발명은, 반연속식 배양 방법을 사용하여 영양분 공급 속도 및 회수 배양액의 속도 및 양의 조절을 통해 균체 성장을 임의로 조절하여 배양액의 점도를 완화시켜 산소 및 물질 전달을 용이하게 함으로써, 대규모의 치마버섯 유래 베타- 1,6-분지-베타-1,3-글루칸 생산이 가능하다.

상기 선행발명을 포함한 선행기술 어디에도 본 발명에 따른 반연속식 배양 방법을 사용한 치마버섯 유래 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조 방법에 대해 기술하고 있지 않다.

본 발명은 상기 종래 기술이 지니는 한계를 극복하기 위해 안출된 것으로, 이에 따른 본 발명의 목적은 기존의 회분식 배양공정에 비해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산성을 현저히 개선 시킨 새로운 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 액상 배양공정을 제공하는 데 있다.

본 발명에서는 일정시간 영양분을 첨가하고, 베타-글루칸의 생산성이 최대로 증가하였을 때, 배양액의 대부분을 회수하고, 다시 외부에서 영양분을 공급하는 반연속식 배양공정을 확립하여 치마버섯 유래 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 대량생산을 제공한다.

본 발명은 치마버섯 균사체의 액상배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산하는데 있어서 액상 배양시 반응기에서 4 내지 7일 배양시킨 후, 전체 배양 부피를 기준으로 0.1%~99%(v/v)의 균사체를 포함한 배양액을 제거하고, 제거된 배양액만큼의 새로운 배지를 다시 주입하는 과정을 반복하는 반연속식 배양법을 도입시킴으로써, 기존 회분식 배양에 비해 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 생산성을 크게 증가시켰다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 위의 새로운 배지는 단회적, 간헐적 또는 연속적으로 주입되며, 바람직하게는 연속적으로 주입된다.

본 발명에 따른 배지연속주입식 반연속배양공정은 회분식 배양공정에 비해 베타-글루칸 (베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸)의 월간 생산성이 2.24배 높게 나타났으며 따라서, 본 발명에 의하면 면역증강, 높은 보습력, 화상치유용 화장품 및 의약품의 원료인 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 대량공급이 가능하다.

본 발명은 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 고농도로 생산하는 반연속식 균사체 액상배양법을 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "회분식 배양"은 초기에 한번 배지를 채운 후 더 이상의 영양 물질의 공급이나 제거없이 반응기에서 세포를 배양하는 방법을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "유가식 배양"은 회분식배양과 달리 배양액을 빼내는 일 없이 배지를 연속 혹은 간헐적으로 공급하는 배양법을 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "반연속식 배양"은 배양기간 중 생물반응기로부터 배양액(배지+균체)의 일부를 제거하고 새로운 배지를 다시 주입하는 과정을 수 회에 걸쳐 되풀이하는 생산 배양 시스템을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "배지단회교환 반연속식배양"은 일정량의 배양액을 제거 후 제거된 양에 상응하는 신선한 배지의 첨가가 단회적으로 일어나는 반연속식 배양 시스템을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "배지간헐교환 반연속식배양"은 일정량의 배양액을 제거 후 신선한 배지를 간헐적으로 첨가해주는 반연속식배양 시스템을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "배지연속교환 반연속식배양"은 일정량의 배양액을 제거 후 신선한 배지를 연속적으로 첨가해주는 반연속식배양 시스템을 의미한다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 배양액 및 배지의 교환 주기는 3일 내지 10일이다. 바람직하게는 4일 내지 7일이다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 교환시 회수되는 배양액의 비율은 배양 부피의 0.1%~99%(v/v)의 배지이다. 바람직하게는 30% 내지 90%이다. 더욱 바람직하게는 40 내지 80%이다. 더욱 특히 바람직하게는 80%이다.

발명의 내용은 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 치마버섯 균사체 액상배양법

(1) 치마버섯의 포자를 발아시켜 균사체를 얻는 단계;

치마버섯의 균사체는 야생에서 채취한 치마버섯의 자실체로부터 수득한 포자를 발아하여 획득한 균사체를 이용하였다. 효모-감자전분-포도당 한천배지(효모추출물 3g, 감자전분 10g, 포도당 10g, 한천 15g, 증류수 1ℓ)에 도말하여 24˚C 온도에서 7일간 배양하여 얻는다. 한편, 균사체는 효모-감자전분-포도당 한천배지가 든 시험관에 사면배양하여 4˚C에 보관하고, 1개월마다 계대배양하여 사용한다.

(2) 균사체를 액체배지에 배양하는 단계;

상기의 사면배지에서 성장한 균사체를 무균적으로 수거한 후, 이를 액체배지에 5%(v/v)되게 접종한다. 액체배지로는 포도당 5%, 효모추출물 1%, 맥아추출물 0.4%, 탈지유 0.4%, 일인산칼륨 0.3%, 황산철 0.04% pH는 5.5로 조정된 배지를 사용할 때 균사체 성장율 및 베타글루칸 생산성 측면에서 양호하다. 균사체의 액체배양은 발효조내에서 28˚C, 교반속도 250 rpm, 통기량 1vvm의 조건으로 7일간 배양한다.

(3) 치마버섯 배양액에서 베타 1,6-분지-베타 1,3-글루칸 회수 단계;

알콜정제를 통해 치마버섯 유래 베타-글루칸을 회수하였고 수율을 높이고자 증류수와 에탄올을 반복적으로 첨가하였다.

<실시예 2> 회분식 배양과 유가식 배양에서의 베타 글루칸 생산

앞에서 언급하였던 것과 같이 균사형성 담자균류의 경우, 세포량이 높을수록 그 독특한 3차원적 구조에 의해 물질 및 산소 공급이 원활하게 이루어지지 않아 궁극적으로 생산물의 수율이 감소하는 단점이 발견되곤 한다. 따라서 본 실시예에서는 5L 발효기(조업부피: 3L)에서 포도당을 배양 초기부터 배양기 외부에서 공급하는 유가식 배양과 기존의 회분식 배양에서의 세포성장 및 베타 글루칸 생산성을 비교하였다. 유가식 배양의 실험 방법은 다음과 같다. 탄소원인 포도당을 제외한 다른 액체 배지 성분은 초기 배지 제조 시에 첨가하여 배양액을 준비하였다. 준비된 배지를 멸균한 다음 치마버섯 균사체를 접종하여 배양을 시작함과 동시에 포도당 용액 (150 g 포도당/300 ml)을 0.05 ml/분의 속도로 배양기 내로 공급하였다. 그 결과 배양 100시간에 300 ml의 포도당 용액이 모두 공급되었다. 실험결과를 도면 1에 제시하였다. 용존산소의 변화양상을 살펴보면 탄소원을 초기부터 첨가하여 배양한 회분식 배양의 경우 배양 24시간에 급격히 감소하는 반면, 탄소원을 외부에서 천천히 공급하는 유가식 배양의 경우 매우 천천히 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 포도당 용액이 모두 공급된 100시간 이후에서 회분식 배양과 유가식 배양에서 균사체 및 베타 글루칸 생산량을 분석해본 결과 유가식 배양보다 회분식 배양에서 모두 높은 생산성을 보였으며 탄소원 이용 속도도 유가식 배양보다 회분식 배양에서 더 높게 나타났다. 이는 유가식 배양의 경우 세포의 성장 및 베타 글루칸을 생산하는데 있어 공급기질인 포도당의 공급 속도를 세포가 필요로 하는 만큼 정밀하게 조절하는 것이 매우 어렵기 때문에 회분식 배양보다 베타 글루칸의 생산성 이 오히려 감소된 것으로 보인다. 따라서 유가식 배양은 회분식 배양에 비해 베타 글루칸의 대량생산에 적합하지 않은 공정으로 판단할 수 있다.

<실시예 3> 반연속식 배양에서의 배양액의 제거 및 새로운 배지 주입 양에 따른 베타 글루칸 생산 (500L 파일롯 스케일 발효기)

치마버섯 균사체의 베타 글루칸의 생산성을 최대로 높이기 위하여 반연속식 배양방법을 개발하였다. 반연속식 배양은 전술한 바와 같이 배양기간 중 생물반응기로부터 배양액(배지+균체)의 일부를 제거하고 새로운 배지를 다시 주입하는 과정을 수 회에 걸쳐 되풀이하는 생산 배양 시스템이다. 반연속식 배양에서 일정량의 배양액을 제거 후 제거된 양에 상응하는 신선한 배지의 첨가가 단회적으로 일어나는 반연속식 배양 시스템을 배지단회교환 반연속식배양이라고 칭한다. 이러한 반연속식 배양은 생산 배양 이전 단계인 성장 배양 단계를 거치지 않고 장기간의 생산 배양을 통해 지속적인 유용 대사산물을 얻을 수 있는 것이 장점이자 특징이라 할 수 있다. 따라서 반연속식 배양의 성공은 짧은 배양기간 동안 높은 대사산물의 생산성을 얻을 수 있고 더 나아가 대규모화 과정에서 배양일수의 감소에 따른 비용 절감을 기대할 수 있다. 본 실시예에서는 반연속식 배양을 위하여 500L 파일롯 스케일 발효기(조업부피: 350L)를 이용하였다. 1차 회분식 배양은 6일간 수행하였으며 (단순회분식 배양은 본 단계에서 배양을 종료하고 베타 글루칸 회수함), 그 후 배양액의 일정 비율 (30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%)을 연동펌프와 공기압을 이용하여 회수하고, 회수 부피만큼의 신선한 배지를 주입하였다. 2차 회분식 배양은 4일간 수행하였으며 3차와 4차 회분식 배양은 6일간 수행하였다. 총 22일간 생산 배양을 하였고 24시간 간격으로 시료를 회수하였다. 배지를 교환하는 시점에서는 교환 전과 후에 각각의 시료를 회수하여 비교하였다. 반연속식 배양의 실험결과를 도면 2에 제시하였다. 그 결과 70%, 80% 및 90% 배지교환 조건에서 베타 글루칸의 생산성이 감소되지 않고 지속되는 경향을 보였으며 반면 30%, 40%, 50% 및 60%의 배지를 교환하는 조건에서는 배지를 교환할 때마다 베타 글루칸의 생산성이 감소되는 경향을 보였다. 그러나 한정된 배양 시설에서 단회 배양으로 생산물을 회수해야 하는 기존의 회분식 배양에 비해, 배지단회교환 반연속식 배양은 베타 글루칸의 생산성이 월등히 높다. 표 1에는 500L 배양시 회분식 배양과 배지단회교환 반연속식배양에서의 베타글루칸 총 생산량을 비교하였다.

500L 규모 배양 (조업부피 350L)에서 배양방법에 따른 배양일수와 베타 글루칸 총 생산량

		배양일수 (일)	회수 배양액부피 (리터)	베타 글루칸 총 생산량 (그램)	생산성 증가율 (배)
회분식 배양		6	350	3500	-
배지단회교환 반연속식 배양	30% 교환	22	665	5285	1.51
	40% 교환	22	770	6545	1.87
	50% 교환	22	875	7700	2.20
	60% 교환	22	980	8470	2.42
	70% 교환	22	1085	11550	3.30
	80% 교환	22	1190	13160	3.76
	90% 교환	22	1295	15417	4.4

결과를 살펴보면 배지단회교환 반연속식배양에서 교환부피가 증가할수록 베타 글루칸 총생산성이 크게 증가하는 것을 알 수 있다. 교환부피가 클수록 배양액의 점도는 감소하고 산소 및 영양분 공급효율이 증가하여 결과적으로 세포의 대사효율이 증가한다. 이로써 치마버섯 균사체의 배양을 통한 베타 글루칸의 생산은 배양액 내의 영양분 농도뿐만 아니라 배양액의 점도에 영향을 크게 받는다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 4> 반연속식 배양에서 새로운 배지 주입 속도를 조절하여 베타 글루칸 생산 (500L 파일롯 스케일 발효기)

반연속식 배양은 배양액 및 세포의 회수와 새로운 배지의 주입이 장기간동안 반복적으로 일어나게 되는 배양 방법으로 베타 글루칸의 생산성이 불안정한 균주이거나 세포 활성이 쉽게 변화하는 균주일 경우 배양 후반에 가까워질수록 베타 글루칸 생산성은 낮아지고, 배양기 내에 존재하는 매우 많은 생산 균주 중 세포성장률이 높은 균주가 우세종이 되어 배양 말기에 생산성이 감소하는 현상이 발생하게 된다. 따라서 본 실시예에서는 새로운 배지의 주입시 발생되는 배양액의 화학적 환경변화를 최소화하고, 생산균주의 과성장을 억제하기 위하여 일정량(80% V/V)의 배양액을 제거 후 신선한 배지를 간헐적으로 첨가해주는 배지 간헐주입식 반연속배양과, 배지를 연속적으로 주입하는 배지연속주입식 반연속배양을 수행하였다. 전술한 배지단회교환 반연속식배양 시 90%의 배양액을 교환하는 조건에서 베타 글루칸의 생산성이 가장 높았으나, 많은 양의 배양액과 제거하는 과정에서 잔존하는 배양액 부피가 일관되지 못하는 단점을 발견하여 80%의 배지를 교환하는 배양 연구를 진행하였다.

신선한 배지의 주입속도를 조절한 반연속식 배양을 위하여 500L 파일롯 스케일 발효기(조업부피: 350L)를 이용하였다. 1차 회분식 배양은 6일간 수행하였으며, 그 후 80%의 배양액을 연동펌프와 공기압을 이용하여 회수하고, 회수 부피만큼의 신선한 배지를 간헐적 혹은 연속적으로 주입하였다. 2차 회분식 배양은 4일간 수행하였으며 3차와 4차 회분식 배양은 6일간 수행하였다. 총 22일간 생산 배양을 하였고 24시간 간격으로 시료를 회수하였다. 배지를 교환하는 시점에서는 교환 전과 후에 각각의 시료를 회수하여 비교하였다.

본 실시예에 대한 결과를 도면 3에 나타내었다. 대조군인 단회배지교환 반연속식배양 결과와 비교하였을 때, 배지 간헐 혹은 연속주입식 반연속배양 결과, 배양기간과 배지교체 횟수가 증가할수록 베타 글루칸 생산성이 모두 향상된 결과를 보였다. 특히 배지연속주입식 반연속배양의 경우 배지가 교체될 때마다 약 10%의 베타 글루칸 생산성이 향상되었다. 배양방법에 따른 베타글루칸 총생산량을 표 2에 제시하였다. 80% 배지단회교환 반연속식배양에 의한 베타글루칸 생산성과 비교하였을 때, 배지 간헐 주입식 반연속식 배양은 1.1배, 배지 연속주입식 반연속 배양은 1.2배 베타 글루칸 생산성 향상을 나타내었다.

배지 간헐 혹은 연속주입식 반연속배양의 베타 글루칸 생산성 (80% 배지 교환)

반연속식 배양방법 (80% 배지교환)	배일 일수	회수배양액 부피 (리터)	베타글루칸 총생산량 (그램)	생산성 증가율 (배)
배지단회교환	22	1190	13160	-
배지 간헐주입식	22	1190	14700	1.11
배지 연속주입식	22	1190	15750	1.20

대규모 미생물 회분식 액상배양의 경우, 생산배양을 준비하기 위해서는 반복적인 종균배양과, 생산배양 이후의 세척 및 준비기간이 반드시 필요하다. 다시 말해서, 회분식배양의 경우 한 달에 최대 2회(1회당 6일 배양) 배양을 수행할 수밖에 없다. 따라서 단순회분식 배양의 경우 1개월간 베타 글루칸 생산량은 약 7.0 킬로그램이다. 그러나 배지연속주입식 반연속배양의 경우, 생산균주의 활성이 사라지기 전까지 연속적인 생산배양이 가능하기 때문에 전체적인 생산성은 크게 증가하게 되어 1개월간 약 15.7킬로그램의 베타글루칸이 생산된다. 표 3에는 500L 배양기에서 기존에 사용되던 회분식 배양과 본원에서 발명된 배지연속주입식 반연속배양의 베타-글루칸 생산성을 비교하였다. 월간 베타-글루칸 생산량을 비교해 보면 회분식배양에 비해 약 2.24배 증가한 것을 확인하였다.

1개월간 회분식 액상배양과 배지 연속주입식 반연속배양에서의 베타글루칸 생산성 비교표

	배양 일수 (일/월)	베타-글루칸 생산량 (킬로그램/월)	생산성 증가율(배)
단순회분식배양	12	7.0	-
배지연속주입식 반연속배양	22	15.7	2.24

도 1은 치마버섯 균사체의 회분식배양(batch culture)과 유가식배양(fed-batch culture)에서의 용존산소변화(DO), 균사성장경향(DCW), 베타-글루칸 생산성 및 포도당 소모경향이다.

도 2는 치마버섯 균사체의 배지 단회교환 반연속배양에서 배지교환 부피에 따른 베타-글루칸 생산성이다.

도 3은 치마버섯 균사체의 배지 단회교환 반연속배양(control), 배지 간헐주입식 반연속배양 (pulse feeding;PF) 및 배지 연속주입식 반연속배양(continuous feeding; CF)에서의 베타-글루칸 생산성이다.

Claims (5)

1. 치마버섯 균사체의 액상배양을 통한 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸을 생산하는데 있어서, 액상배양이 반응기에서 4 내지 7일 배양시킨 후, 전체 배양 부피를 기준으로 70% 내지 90%(v/v)의 균사체를 포함한 배양액을 제거하고, 제거된 배양액 만큼의 새로운 배지를 다시 주입하는 과정을 반복하는 반연속식배양임을 특징으로 하는, 치마버섯(Schizophyllum commune) 유래 베타-1,6-분지-베타-1,3-글루칸의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, 새로운 배지가 단회적으로 주입됨을 특징으로 하는, 제조 방법.
3. 제1항에 있어서, 새로운 배지가 간헐적으로 주입됨을 특징으로 하는 제조 방법.
4. 제1항에 있어서, 새로운 배지가 연속적으로 주입됨을 특징으로 하는 제조 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제거되는 배양액의 부피가 80%임을 특징으로 하는 제조 방법.

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