CN1187438C - 高产壳聚糖酶的真菌菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产壳聚糖酶的真菌菌株及其用途。高产壳聚糖酶的真菌菌株的菌落为淡灰绿色，菌落形态部分埋伏气生型，气生菌丝为松絮状，形状为菌丝体，营养菌丝为无色；菌丝有横隔膜，分生孢子梗具有横隔，光滑，分生孢子梗顶端生有不对称帚状分枝，分生孢子为椭圆形。它用于发酵粗酶液降解壳聚糖制备壳低聚糖。从土壤里筛选的青霉属菌株，再采用壳聚糖作为唯一碳源进行培养，以定向育种的方法诱导菌种产生产壳聚糖酶活性，并利用含有壳聚糖酶的发酵液制备不同分子量的壳低聚糖。此方法效率高，成本低，不污染环境，可以控制降解速率，获得几万乃至几个聚合度的壳低聚糖和寡聚糖产品。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产壳聚糖酶的真菌菌株及其用途。
背景技术
壳聚糖(chitosan)是由氨基葡萄糖以β-1，4糖苷键连接成的具有生物活性的高分子聚合物，化学名为聚2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖。它主要是以被废弃的虾壳、蟹壳为原料，经脱钙、去除蛋白和脱乙酰基等化学过程而得到的。其分子结构式如下图所示。
壳聚糖具有许多独特的生物活性。1991年的国际甲壳素大会把壳聚糖和甲壳素确定为除了糖、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质之外的第六大生命要素，对它们在医疗保健方面的作用给予了很高的评价。
壳聚糖的许多生物活性需要以低分子量或者壳寡聚糖的形式才能体现出来，同时一些特定聚合度的壳低聚糖还具有许多壳聚糖本身所不具有的特殊生物活性，如抗肿瘤、免疫激活等作用。但是由于人体内壳聚糖酶和胃酸的含量很少，壳聚糖的作用效果受到了很大的限制。
低聚糖的制备主要有三种方法，即化学法、糖转移法和酶降解法。目前低聚糖的主要制备方法是水解法，用氟化氢降解壳聚糖，得到较高产量的三糖到十糖，但是最后需要移走大量的氟化氢且进行进一步脱氟反应，从而在实践中受到限制。而且化学反应条件非常苛刻。酸水解法是用盐酸将壳聚糖部分水解，得到低聚糖溶液，要强化水解条件。甲壳质低聚糖酸溶液可用活性碳-氟镁石柱吸附分离法进行精制，这样可获得单糖到七糖的低聚糖，吸附的低聚糖可用乙醇溶解析出，并通过改变乙醇浓度分离出二～七糖的各种低聚糖(活性碳不吸附单糖)；需大量的乙醇才能将低聚糖沉淀出来，且氨基葡萄糖不能回收，壳低聚糖酸溶液则要先用浓缩法除去剩余盐酸，再用阳离子交换色谱分离获得不同分子量的壳聚糖。因此，化学方法降解甲壳质和壳聚糖生产壳低聚糖，但由于这些方法存在产物得率低，环境污染严重以及降解程度难以控制等缺点，逐渐为酶降解法所取代。目前用于壳聚糖降解的酶有专一性的壳聚糖酶，也有非专一性的酶如纤维素酶、脂肪酶、溶菌酶等，市售非专一性酶的活力都不大高，而成本较高。所以，筛选新的菌株以获得高活力壳聚糖酶是目前壳低聚糖生产研究的一个热点问题。本发明公开了一种新的高产壳聚糖酶的真菌菌株和一种酶法生产壳低聚糖的方法。以定向育种的方法诱导菌种产生产壳聚糖酶活性，并利用含有壳聚糖酶的粗酶液制备不同分子量的壳低聚糖，可以提高产品的附加值，能产生很高的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的提供一种高产壳聚糖酶的真菌菌株及其用途。
高产壳聚糖酶的真菌菌株的菌落为淡灰绿色，菌落形态部分埋伏气生型，气生菌丝为松絮状，形状为菌丝体，营养菌丝为无色；菌丝有横隔膜，分生孢子梗具有横隔，光滑，分生孢子梗顶端生有不对称帚状分枝，分生孢子为椭圆形。
它用于发酵粗酶液降解壳聚糖制备壳低聚糖。
从土壤里筛选的青霉属菌株，再采用壳聚糖作为唯一碳源进行培养，以定向育种的方法诱导菌种产生产壳聚糖酶活性，并利用含有壳聚糖酶的发酵液制备不同分子量的壳低聚糖。此方法效率高，成本低，不污染环境，可以控制降解速率，获得几万乃至几个聚合度的壳低聚糖和寡聚糖产品。
具体实施方式
本发明提供了经定向育种得到的青霉属菌株，该菌株能生产高活力的壳聚糖酶。该菌株的育种方法是：用从土壤里筛选的青霉属菌株，再采用大分子量的壳聚糖作为唯一碳源进行培养，经几代传代、抗生素优化和紫外线诱变之后，菌种的产壳聚糖酶活力得到了很大提高，发酵粗酶液的酶活力达到2.6U/mL。
本发明还提供了利用菌株发酵产生的含有壳聚糖酶的发酵液生产壳低聚糖的方法。将发酵粗酶液与大分子量壳聚糖溶液按1∶10-30的比例混合，在30℃-60℃的温度下慢速搅拌3-10小时，根据产品的聚合度要求选择不同的反应时间，壳聚糖的平均分子量可以从50万降解到一万以下。
Penicillium sp.的形态学：
| Penicillium sp. | |
| 菌落色泽 | 淡灰绿色 |
| 菌落形态 | 部分埋伏气生型，气生菌丝为松絮状 |
| 菌体形状 | 菌丝体 |
| 营养菌丝 | 营养菌丝为无色； |
| 菌丝隔膜 | 有横隔 |
| 分生孢子梗 | 分生孢子梗具有横隔，光滑， |
| 帚状分枝 | 分生孢子梗顶端生有不对称帚状分枝 |
| 分生孢子 | 分生孢子为椭圆形 |
实施例1：
1.菌种的育种：
采集土壤样品，经富集、纯种分离得到多个菌株。以大分子量的壳聚糖作为唯一碳源进行定向育种培养，诱导菌种的产壳聚糖酶活性。经过数代传代、抗生素优化和紫外线诱变之后，菌种的产壳聚糖酶活性得到了很大提高，以菌种降解壳聚糖的能力作为选择标准，筛选优化获得一株产壳聚糖酶活力最高的菌株作为生产用菌株。发酵粗酶液的酶活力达到2.6U/mL。
Penicillium sp.该菌种保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2002年12月9日，保藏编号：0851。
2.菌种的发酵：
取斜面保藏菌种一支，活化5小时之后，加入无菌水10ml，洗下孢子。将获得的孢子悬液接入50ml摇瓶发酵培养基中，摇床转速为100rpm、30℃下培养40小时左右。将培养得到的菌悬液分为5份，分别接入50ml摇瓶发酵培养基中，培养24小时至指数生长阶段时，接入2L发酵罐培养基中进行培养。摇瓶培养基与发酵罐培养基组成如下：初始pH值为5
| 壳聚糖 | 20g/L |
| 蛋白胨 | 12g/L |
| 尿素 | 5g/L |
| KH2PO4 | 7g/L |
| (NH4)2SO4 | 5g/L |
发酵罐培养30小时后，在冰箱中4℃下保存发酵液二小时，然后在4000rpm离心后取上清液作为粗酶液，待用。
3.壳低聚糖的制备：
1)壳聚糖溶液配制：将42万分子量的壳聚糖样品100g置于50L 2％的醋酸溶液中，用强力搅拌器搅拌，直至壳聚糖完全溶解为止。
2)壳低聚糖溶液制备：配制将上述过程中获得的粗酶液与大分子量壳聚糖溶液以1∶20的比例混合，在50℃的温度下慢速搅拌5小时，用旋转黏度计测定，黏度为2cp。
3)提取和纯化：将壳低聚糖溶液经离子交换柱分离纯化，去除阴、阳离子，真空浓缩到固含量达到10％时，待用。
4)采用蒸发量为5L/hr的喷雾干燥机，通过喷雾干燥，得到淡黄色粉末状水溶性壳低聚糖产品。通过凝胶液相色谱测定，粘均分子量为2000，2-10个聚合度的壳寡聚糖的含量占33.6％。
实施例2：
1.菌种的选育与实施例1相同。
2.取斜面保藏菌种3支，活化5小时之后，加入无菌水各10ml，洗下孢子。直接接入2L发酵罐的培养基中进行培养。初始pH值为4.5，在通气量0.05-0.1m3/hr的情况下进行发酵。发酵74小时，当菌种生长到达指数生长阶段时停止发酵。
1.壳低聚糖的制备：
1)壳聚糖溶液配制：将42万分子量的壳聚糖样品100g置于50L 2％的醋酸溶液中，用强力搅拌器搅拌，直至壳聚糖完全溶解为止。
2)壳低聚糖溶液制备：配制将上述过程中获得的粗酶液与大分子量壳聚糖溶液以1∶30的比例混合，在35℃的温度下慢速搅拌2小时。
3)提取和纯化：将壳低聚糖溶液经离子交换柱分离纯化，去除阴、阳离子，真空浓缩到固含量达到6％时，待用。
4)采用蒸发量为5L/hr的喷雾干燥机，通过喷雾干燥，得到淡黄色粉末状水溶性壳低聚糖产品。通过凝胶液相色谱测定，粘均分子量为9800。
Claims (2)
1.一种高产壳聚糖酶的真菌菌株，其特征在于它是青霉菌(Penicillium sp.)，其保藏编号为：CGMCC NO.0851，菌落为淡灰绿色，菌落形态部分埋伏气生型，气生菌丝为松絮状菌丝体，营养菌丝为无色；菌丝有横隔膜，分生孢子梗具有横隔、光滑，分生孢子梗顶端生有不对称帚状分枝，分生孢子为椭圆形。
2.一种权利要求1所述的高产壳聚糖酶真菌菌株的用途，其特征是用于发酵粗酶液降解壳聚糖制备壳低聚糖。
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