CN100354415C - 壳聚糖酶制备新工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及壳聚糖酶的制备新工艺，将保藏在PDA斜面(马铃薯培养基)的贵州绿僵菌菌种活化，产生大量绿色分生孢子，然后洗下孢子，制得孢子悬液，接种孢子悬液进行固态发酵。发酵结束后向培养物加入缓冲液提取壳聚糖酶。该工艺具有原料易得、生产成本低廉、操作简单、产酶能力稳定、壳聚糖酶活力较高、产品经济价值高、便于推广的优点，具有较高的经济和实用价值。

Description

壳聚糖酶制备新工艺
技术领域  本发明涉及的是一种壳聚糖酶制备新工艺，属于生物工程技术领域。具体而言是指使用贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)固态发酵生产壳聚糖酶的新技术。
背景技术  壳聚糖是几丁质的脱乙酰产物，是一种高分子阳离子絮凝剂。壳聚糖的降解产物壳寡糖具有较高的溶解性和生理活性，其低分子量壳寡聚糖(如五糖、六糖)还具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，从而使其在食品，农业和医药领域有着广泛的应用前景。目前，由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种方法：化学降解法(如酸解法)和酶解法。利用专一性的壳聚糖酶水解壳聚糖，反应条件温和，可通过反应时间控制水解产物，壳寡糖产量高且质量稳定，是一种较为理想的大规模生产壳寡糖的制备方法。
壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子植物的不同组织中也发现有该酶活性。目前文献报道已经发现细菌(如Myxobacter，Bacillus)，放线菌(如Streptomyces、Nocardioides)，真菌(如Rhizopus，Aspperrgillus，Penicillum)，病毒(Chlorellavirus PBCV-1、CVK-2)中有壳聚糖酶的存在，并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。例如，《山东大学学报》2003(1)，96～99报道李风平等采用160r/min，25℃摇瓶培养腐皮镰孢菌产壳聚糖酶，粗酶液中壳聚糖酶活力为43.2mU/ml；《食品与发酵工业》2004(2)，57～61报道陈小娥等采用150r/min，30℃摇瓶发酵一株曲霉，粗酶液中壳聚糖酶活力为197mU/ml。综上所述，目前壳聚糖酶的发酵工艺具有两大特点。第一，壳聚糖酶产生菌产酶能力较低，酶活力不高，使得壳聚糖酶的来源有限，商品壳聚糖酶价格居高不下，难以大规模应用于工业化生产壳寡聚糖。第二，公开文献报道的壳聚糖酶制备工艺均采用液态发酵，液态发酵生产虽然适合工业自动化生产，但是其存在能耗大，需要大量淡水以及废弃物处理等问题；而且对于最后产酶来说，目前液态发酵产酶的浓度较低，给下游纯化带来了较大的压力。
发明内容  综合比较以上工艺路线，本发明提出了一种贵州绿僵菌固态发酵生产壳聚糖酶的新技术。该技术具有原料易得、生产成本低廉、操作简单、产酶能力稳定、壳聚糖酶活力较高、产品经济价值高、便于推广的优点，具有较高的经济和实用价值。
本发明所述固态发酵技术方案内容如下：
1.菌种保藏：本发明所使用的贵州绿僵菌为公知公用的菌种，购买于中科院微生物研究所。菌种于4℃保藏在PDA斜面培养基，即马铃薯培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，加水1000mL，pH自然，煮沸后过滤)。 半年转接一次。
2.种子培养：使用PDA综合斜面培养基作为种子培养基。配方为(g/l)：土豆汁20％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，MgSO4·7H2O 0.5％，K2HPO4 0.3％，调pH5.6。培养基灭菌后接种。于25～29℃培养7～10天，用灭菌好的0.8％Tween-80溶液洗下孢子，即得孢子种液。
3.固态发酵：本发明所使用固态培养基主要原料为麸皮和黄豆粉，添加壳聚糖为壳聚糖酶诱导剂。培养基由固体营养基质和营养盐液组成。固体营养基质按重量计包括如下组分：麸皮10～30份、黄豆粉30～80份、稻壳10～30份、壳聚糖0.5～3份。营养盐液组成为(g/l)：MgSO4 0.5，KH2PO4 0.5，KCl 0.5，ZnSO4 0.1，pH5.6。固态营养基质和营养液分别灭菌后，按重量比约为1∶1混合均匀，接种孢子液，在相对湿度为70％～85％的条件下，在25～29℃静态培养100～140h。
4.粗酶液的提取：固态发酵后向培养物加入10倍重量的pH值为4～8的缓冲液，机械搅拌1小时后，压滤除渣，所得上清液即为壳聚糖酶液。
5.壳聚糖酶活力测定采用对二氨基苯甲醛法。一个酶活力单位(U)定义为每分钟释放1μg盐酸氨基葡萄糖还原糖所需要的酶量。本发明的上述方法使用的菌种是贵州绿僵菌，绿僵菌是一种广谱虫生真菌，利用其孢子可作为微生物杀虫剂，目前还没有利用其生产壳聚糖酶的文献报道。如德国拜耳公司在20世纪80年代开发的金龟子绿僵菌(M.anisopliae)菌丝体颗粒剂BIO 1020，用于防治葡萄黑耳喙象(Otiorrhynchus sulcatus Fabricius).本发明采用固态发酵的方法，绿僵菌的产壳聚糖酶能力较高而且稳定，所得壳聚糖酶活力平均可达83.1U/g干培养基。
本发明的上述方法使用的是固态发酵。固态发酵在我国有着悠久的应用历史，具有耗能低，污染小，成本低廉，易于推广等优点。本发明充分利用固态发酵的优势，采用低廉的培养基成分，获得了壳聚糖酶的高产量。
下面通过若干实例的具体实施方式，再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于下述的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例一
(1)将保藏在PDA斜面的贵州绿僵菌菌种活化，在25℃培养9天，产生大量绿色分生孢子。用灭菌好的0.8％Tween-80溶液洗下孢子，玻璃棉过滤除去菌丝体后，转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡至孢子分散，即得孢子悬液。
(2)以组成为(g/l)：MgSO4 0.5，KH2PO4 0.5，KCl 0.5，ZnSO4 0.1配制营养盐液，调节pH5.6，取10ml。取黄豆粉6g，麸皮2g，壳聚糖0.2g，稻壳2g混合均匀后作为固体营养基质。固态营养基质和营养液分别灭菌后，放入250ml三角瓶中混合均匀，接入孢子悬液。在相对湿度为75％的条件下，在26℃静态培养100h。
(3)向培养物加入100ml 20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.6)，机械搅拌1小时后，纱布压滤除渣，所得上清液壳聚糖酶活力为82.4U/g干培养基。
实施例二
(1)将保藏在PDA斜面的贵州绿僵菌菌种活化，在28℃培养8天，产生大量绿色分生孢子。用灭菌好的0.8％Tween-80溶液洗下孢子，玻璃棉过滤除去菌丝体后，转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡至孢子分散，即得孢子悬液。
(2)以组成为(g/l)：MgSO4 0.5，KH2PO4 0.5，KCl 0.5，ZnSO4 0.1配制营养盐液，调节pH5.6，取15ml。取黄豆粉9g，麸皮3g，壳聚糖0.3g，稻壳3g混合均匀后作为固体营养基质。固态营养基质和营养液分别灭菌后，放入250ml三角瓶中混合均匀，接入孢子悬液。在相对湿度为80％的条件下，在27℃静态培养120h。
(3)向培养物加入20mmol/L醋酸缓冲液(pH7.0)150ml，机械搅拌1小时后，纱布压滤除渣，所得上清液壳聚糖酶活力为86.0U/g干培养基。
实施例三
(4)将保藏在PDA斜面的贵州绿僵菌菌种活化，在27℃培养10天，产生大量绿色分生孢子。用灭菌好的0.8％Tween-80溶液洗下孢子，玻璃棉过滤除去菌丝体后，转入无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡至孢子分散，即得孢子悬液。
(5)以组成为(g/l)：MgSO4 0.5，KH2PO4 0.5，KCl 0.5，ZnSO4 0.1配制营养盐液，调节pH5.6，取20ml。取黄豆粉12g，麸皮4g，壳聚糖0.6g，稻壳4g混合均匀后作为固体营养基质。固态营养基质和营养液分别灭菌后，放入250ml三角瓶中混合均匀，接入孢子悬液。在相对湿度为80％的条件下，在28℃静态培养130h。
(6)向培养物加入20mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0)200ml，机械搅拌1小时后，纱布压滤除渣，所得上清液壳聚糖酶活力为83.5U/g干培养基。

Claims (5)

1.壳聚糖酶制备新工艺，用贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)固态发酵生产壳聚糖酶，其特征在于将保藏在PDA(马铃薯培养基)斜面的贵州绿僵菌菌种活化，产生大量绿色分生孢子，然后洗下孢子，制得孢子悬液，接种孢子悬液进行培养，培养结束后向培养物加入缓冲液提取壳聚糖酶。
2.如权利要求1所述的壳聚糖酶制备新工艺，其特征在于培养使用的培养基由固体营养基质和营养盐液按重量比约1∶1混合而成。
3.如权利要求2所述的壳聚糖酶制备新工艺，其特征在于固体营养基质按重量计包括如下组分：麸皮10～30份、黄豆粉30～80份、稻壳10～30份、壳聚糖0.5～3份。
4.如权利要求2所述的壳聚糖酶制备新工艺，其特征在于营养盐液组成为：MgSO4 0.5g/l，KH2PO4 0.5g/l，KCl 0.5g/l，ZnSO4 0.1g/l，pH5.6。
5.如权利要求1、2所述的壳聚糖酶制备新工艺，其特征在于培养使用的条件是相对湿度70％～85％，25～29℃，静态培养100～140h。
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