CN104450832A - 一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术 - Google Patents

一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术 Download PDF

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林荣业
李成平
饶桂维
梅瑜
王楠
金建昌
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朱晓娟
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Abstract

一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，属于食品加工技术、生物制药技术和化学工程技术领域。该组菌种具有产生高活性胞外甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶的生物学特性并高效降解甲壳素。主要过程：首先将保存的斜面菌种接种到以甲壳素为唯一碳源的双层平板上，46℃培养24h，然后按一定接种量接入以甲壳素为唯一碳源的液体培养基中进行液体种子培养，46℃培养72h，作为生产菌种再按一定比例接入以甲壳素为唯一碳源的发酵培养基中。这种技术可降解甲壳素生产壳聚糖、不同分子量的壳寡糖、葡萄糖胺(氨基葡萄糖)和乙酰氨基葡萄糖及其他相关产品，还可生产甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶。

Description

一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术
技术领域
一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，属于食品加工技术、生物制药技术和化学工程技术领域。
背景技术
浙江省是我国的海洋大省，水产业在我省的经济发展中占有重要地位，每年海水养殖的虾蟹类产量超过6万吨，远洋捕捞的虾蟹类超过80万吨。甲壳素是水产加工中产量较大的副产物，每年的产量约5万吨以上。甲壳素的加工处理带来的污染十分严重。甲壳素(chitin)广泛存在于虾、蟹等甲壳动物，部分植物，细菌及真菌等生物中，是仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物，年平均产量达数十亿吨之多。壳寡糖(Chitosan oligosaccharides)是指由2-10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚氨基葡萄糖，是由甲壳素脱乙酰基后降解或甲壳素降解后脱乙酰基得到的产物，具有提高免疫力、促进钙吸收、增殖肠道有益菌、防治成人疾病、抑制癌细胞生长、促进肝脾抗体形成等生物活性功能。壳寡糖在人体内的吸收率近100％，其功效是壳聚糖的数十倍，有“软黄金”之称谓。
在壳寡糖制备过程中，甲壳素的脱乙酰基及降解是生产的关键。目前，以甲壳素直接制备壳寡糖主要有二种方法：化学法及化学-酶解法。即先通过化学方法将甲壳素脱乙酰基后，再用化学法或酶法降解得到低分子的壳寡糖。这些方法中均用到无机强碱或强酸，存在着耗能大、产物纯化难、易污染环境、产品脱乙酰度不均一等缺点。因此得到高活性胞外甲壳素脱乙酰基酶的微生物是开发甲壳素资源一个急待解决的课题。我们从新疆极端气候地区土壤中分离得到一组嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3能产生高活性的胞外甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶，同时高效降解甲壳素，嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3最适生长温度45-46℃，在特制的甲壳素平板上，培养24h后，其透明圈与菌落直径比高达5以上。以1.5％甲壳素为主要碳源发酵72h后，甲壳素全部降解成可溶性的低聚物。其产生的胞外甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶最适反应温度为46℃，发酵液经微孔过滤除去菌体细胞后，以1％的甲壳素为底物，46℃反应可完全降解甲壳素。
本发明的有益效果：传统的甲壳素降解生产壳聚糖、不同分子量的壳寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相关产品的技术通常都要使用强碱高温，对环境污染严重，能耗高。
与传统的甲壳素降解生产相比，本发明采用新型嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3高效降解甲壳素进行生产，生产条件温和，不污染环境，符合节能减排。
与传统的甲壳素降解生产相比，本发明还可生产高活性甲壳素脱乙酰基酶和降解酶，提供给其他甲壳素相关产品生产企业。
与传统的甲壳素降解生产相比，酶法降解甲壳素容易控制产品的组分。
发明内容
一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术。该技术所用这组嗜热芽孢杆菌菌种ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`革兰氏阳性菌，产芽孢，菌落高凸起，圆形，边缘完整，表面光滑，乳白色，半透明，柔软；ctn x10和ctn x5-3的菌落高凸起，不规则边缘叶状，表面粗糙，不透明，浅棕色；这组嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a的最适生长温度45-46℃，最适生长pH7.2-7.6；在以甲壳素为唯一碳源的平板培养基上培养24h，产生显著的透明圈，具有同时产生高活性甲壳素脱乙酰基酶和降解酶并高效降解甲壳素的生物特性；在以甲壳素为唯一碳源的液体培养基中(甲壳素含量1.5％)培养60-72h，可高效降解甲壳素；其高活性甲壳素脱乙酰基酶和降解酶的最适反应温度是46℃，最适反应pH为7.4。
本发明一种利用嗜热芽孢杆菌(ThermophilicBacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，根据不同需要进行(1)降解甲壳素生产壳聚糖、不同分子量的壳寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相关产品；(2)生产高活性甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶；
具体实施方式
一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术
1、菌种制备
1)平板菌种培养：将嗜热芽孢杆菌C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3分别在以甲壳素为唯一碳源的双层平板培养基上划线接种，45-46℃进行24小时培养，培养好后置冰箱备用；2)液体菌种培养：用接种环挑取培养好的平板嗜热芽孢杆菌C8-3-2a、ctnC8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3菌种接种到100mL以甲壳素为唯一碳源的液体培养基中，45-46℃进行72小时培养，培养好后置冰箱备用；
3)原料处理：用于配制平板培养基的甲壳素要先磨碎，再过30目筛。用于发酵生产的甲壳素剪碎成小段或小颗粒。
2、发酵生产
以5％的接种量将培养好的液体菌种接入200mL以甲壳素为唯一碳源的发酵培养基中，45-46℃培养，146rpm，60-72小时，甲壳素完全降解后终止发酵。离心去除菌体后，按不同用途和生产目的处理，备用。
附图说明：
图1是嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a在特制的以甲壳素为唯一碳源的双层平板上的菌落形态示意图。
图2是嗜热芽孢杆菌ctn C8-1在特制的以甲壳素为唯一碳源的双层平板上的菌落形态示意图。
图3是嗜热芽孢杆菌ctn C8-1`在特制的以甲壳素为唯一碳源的双层平板上的菌落形态示意图。
图4是嗜热芽孢杆菌ctn x5-3在特制的以甲壳素为唯一碳源的双层平板上的菌落形态示意图。
图5是嗜热芽孢杆菌ctn x10在特制的以甲壳素为唯一碳源的双层平板上的菌落形态示意图。

Claims (4)

1.一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，其特征是：
1)该技术使用的是一组嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3，这组菌种都产芽孢，其中ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`的菌落高凸起，圆形，边缘完整，表面光滑，乳白色，半透明，柔软；ctn x10和ctn x5-3的菌落高凸起，不规则边缘叶状，表面粗糙，不透明，浅棕色；这组菌种的最适生长温度45-46℃，最适生长pH7.2-7.6，在以甲壳素为唯一碳源的平板培养基上培养24h，降解甲壳素产生显著的透明圈，其中ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`的透明圈与菌落的直径比在5以上；这组菌种具有同时产高活性甲壳素脱乙酰基酶和降解酶的生物特性；在以甲壳素为唯一碳源的液体培养基中(甲壳素含量1.5％)培养60-72h，可高效降解甲壳素；其高活性甲壳素脱乙酰基酶和降解酶的最适反应温度是46℃，最适反应pH为7.4，其遗传基因可作为构建基因工程菌优良的基因供体。
2)采用这组嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3可降解甲壳素生产壳聚糖、不同分子量的壳寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相关产品，还可生产甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶。
2.根据权利要求1所述的一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，其特征是嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctnx10、ctn x5-3可作为降解甲壳素生产壳聚糖、不同分子量的壳寡糖和葡萄糖胺(氨基葡萄糖)及其他相关产品的生产菌种；可作为生产甲壳素脱乙酰基酶和甲壳素降解酶的生产菌种：菌种可以单个使用也可以组合使用。
3.根据权利要求1所述的一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，其特征是利用嗜热芽孢杆菌(ThermophilicBacillus)产生的酶进行甲壳素降解生产相关产品，其产品壳聚糖、不同分子量的壳寡糖、葡萄糖胺(氨基葡萄糖)和乙酰氨基葡萄糖及其他相关产品可作为食品、保健品和药品及其原料，还可作为化工原料和生物质材料原料。
4.根据权利要求1所述的一种利用嗜热芽孢杆菌(Thermophilic Bacillus)酶高效脱乙酰基降解甲壳素的技术，其特征是：一组嗜热芽孢杆菌ctn C8-3-2a、ctn C8-1、ctn C8-1`、ctn x10、ctn x5-3可作为构建基因工程菌优良的基因受体，其遗传基因可作为构建基因工程菌优良的基因供体。
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