CN104673767A - 一种阿魏酸酯酶的生产方法 - Google Patents

一种阿魏酸酯酶的生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阿魏酸酯酶的生产方法，属于生物酶制剂生产技术领域。该方法是利用组成型表达阿魏酸酯酶的基因工程菌株，以淀粉糖化液、玉米浆和氨水等为主要原料发酵产生阿魏酸酯酶。在发酵工程中连续补加发酵培养基和批式排出部分发酵液，在无杂菌污染的条件下持续延长发酵周期，发酵液经板框过滤、超滤浓缩和喷雾干燥后可制得高活力的阿魏酸酯酶制剂，具体步骤如下：（1）菌种制备；（2）扩大培养；（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：（4）阿魏酸酯酶的提纯。利用本发明可以在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下实现持续发酵、持续生产，可以缩短生产周期，降成生产成本。

Description

一种阿魏酸酯酶的生产方法
技术领域
本发明属于生物酶制剂生产技术领域，具体说是涉及一种阿魏酸酯酶A的生产方法。
背景技术
阿魏酸酯酶属于羧酸酯水解酶类，可水解半纤维素中的阿魏酸与阿拉伯糖或半乳糖之间的酯键，使其它半纤维素水解相关酶类更容易接近其底物，促进半纤维素的完全水解。该酶在木质纤维素降解、造纸、有机食品，饲料、医药等工业中具有巨大的潜在应用价值。
阿魏酸酯酶主要由原始菌株和基因工程菌株发酵生产。目前，由于阿魏酸酯酶未进入《食品添加剂》目录，对于阿魏酸酯酶的大规模生产工艺尚未见报道；人们对该酶的理论和应用研究多处于实验室研究阶段。利用原始菌株生产阿魏酸酯酶具有产量低、酶提取纯化难度大，产品质量不稳定等特点。而利用基因工程菌发酵生产阿魏酸酯酶可显著提高阿魏酸酯酶的产量，酶提取纯化及发酵条件控制相对容易，该方法将成为阿魏酸酯酶发酵生产的主要方法。利用基因工程菌株大规模发酵阿魏酸酯酶的生产工艺直接影响该酶的生产成本、销售价格以及产品应用等问题。如何提高阿魏酸酯酶的产率及降低生产成本是相关研发人员亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的不足之处而提供一种可有效降低生产成本、提高阿魏酸酯酶产率的阿魏酸酯酶的生产方法。
本发明的目的是采用下述技术措施来实现的：
本发明所述的阿魏酸酯酶生产方法利用组成型表达阿魏酸酯酶的基因工程菌株，以淀粉糖化液、玉米浆和氨水等为主要原料发酵产生阿魏酸酯酶，在发酵工程中连续补加发酵培养基和批式排出部分发酵液，在无杂菌污染的条件下持续延长发酵周期，通过对发酵液中的阿魏酸酯酶提取可制得高活力的阿魏酸酯酶制剂，具体步骤如下：
（1）菌种制备：
（1.1）将组成型表达阿魏酸酯酶A毕赤酵母菌株按重量百分比1%接种到500mL已灭菌培养基中，在28~30 ℃、200~240 rpm条件下培养48~60小时，作为种子液备用；其中培养基是由下述质量百分比的原料组成：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、余量为水；
（1.2）在50L的发酵罐中制备30 L已灭菌培养基：按质量百分比取工业级原料： 2%淀粉水解液、1%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1mL/m3微量元素母液，120~124℃灭菌30分钟，作为种子液培养基备用；
（1.3）将步骤（1.1）制备的种子液转入步骤（1.2）制备的含有30 L已灭菌培养基的50L的发酵罐中，在28~30 ℃、pH5.8~6.4、180~200 rpm条件下培养32~48小时。
（2）扩大培养：
（2.1）按照步骤（1.2）的方法在6 m3发酵罐内中制备4 m3已灭菌培养基，待灭菌培养液温度降至35℃后备用；
（2.2）将步骤（1.3）中制备的30L菌种液转入步骤（2.1）制得的培养液中；在28~30℃、溶氧量为8mg/L~10mg/L、罐压为0.05Mpa的条件下培养24~36小时，得到扩大培养种子液备用；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8~6.4，使发酵菌株处于适宜的生长pH。
（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：
（3.1）在60m3发酵罐中制备40m3发酵培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在115~121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.2）在60m3发酵罐中制备40m3补料培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在115~121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.3）将步骤（2.2）中所得扩大培养种子液转移如到步骤（3.1）所得发酵培养基中进行发酵；在温度为28~30 ℃，溶氧量为条件下8mg/L~10mg/L，罐压为0.05~0.06Mp条件下培养，当还原糖降低到1.5%时，开始加入步骤（3.2）所得补料培养基进行补料，补料速率参照还原糖百分比；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8~6.4，是发酵菌株处于适宜的生长pH；从接入扩大培养种子液开始计时，48小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时放出首次发酵液20~25 m3；以后每24小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时可再次放出一半发酵液；在发酵过程中应及时跟踪发酵液中杂菌污染状况和单位发酵液中的酶活力两个指标；在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵周期可持续延长。
（4）阿魏酸酯酶的提纯：
利用100~160 m2 聚丙烯板框过滤机将发酵液过滤得到阿魏酸酯酶清液后，利用分子截留量为10000道尔顿超滤设备将阿魏酸酯酶清液进行浓缩10倍，然后采用1000kg/h压力喷雾干燥设备制成粉状阿魏酸酯酶，喷雾干燥进口温度130~140℃，出口温度50~60℃。
 本发明步骤（3.3）所述阿魏酸酯酶的测定方法为：以2mM阿魏酸2-氯-对硝基苯酚酯为底物，在含有2.5% Triton-X 100的100mM磷酸pH6.0缓冲液中于40℃条件下反应10分钟，在410nm波长下检测吸光度；酶活单位定义为：在检测条件下，每分钟水解1μmol阿魏酸2-氯-对硝基苯酚酯所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种利用组成型表达的基因工程毕赤酵母菌株工业化生产阿魏酸酯酶的方法。在发酵过程中连续补料和间断放出发酵液的阿魏酸酯酶发酵方法，该发酵生产在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵生产可持续进行。在阿魏酸酯酶发酵过程中，利用组成型表达阿魏酸酯酶进行发酵生产阿魏酸酯酶可缩短生产周期，降低运行成本；利用淀粉糖化液作为毕赤酵母发酵生产阿魏酸酯酶时的碳源可显著降低生产成本。
附图说明
图1 阿魏酸酯酶生产流程示意图。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例（图1所示）作进一步描述：
实施例1
（1）菌种制备：
（1.1）将组成型表达阿魏酸酯酶A毕赤酵母菌株按重量百分比1%接种到500mL已灭菌培养基中，在28℃、220 rpm条件下培养60小时，作为种子液备用；其中培养基是由下述质量百分比的原料组成：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、余量为水；
（1.2）在50L的发酵罐中制备30 L已灭菌培养基：按质量百分比取工业级原料： 2%淀粉水解液、1%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1mL/m3微量元素母液，124℃灭菌30分钟，作为种子液培养基备用；
（1.3）将步骤（1.1）制备的种子液转入步骤（1.2）制备的含有30 L已灭菌培养基的50L的发酵罐中，在29 ℃、pH6.0、190 rpm条件下培养40小时。
（2）扩大培养：
（2.1）按照步骤（1.2）的方法在6 m3发酵罐内中制备4 m3已灭菌培养基，待灭菌培养液温度降至35℃后备用；
（2.2）将步骤（1.3）中制备的30L菌种液转入步骤（2.1）制得的培养液中；在30℃、溶氧量为9 mg/L、罐压为0.05Mpa的条件下培养36小时，得到扩大培养种子液备用；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至6.0，使发酵菌株处于适宜的生长pH。
（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：
（3.1）在60m3发酵罐中制备40m3发酵培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.2）在60m3发酵罐中制备40m3补料培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.3）将步骤(2.2)中所得扩大培养种子液接入到步骤（3.1）所得发酵培养基中，在温度为29℃，溶氧量为条件下10mg/L，罐压为0.06Mp条件下培养，当还原糖降低到1.5%时，开始加入步骤（3.2）所得补料培养基进行补料，补料速率以还原糖百分比为参考；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至6.0，是发酵菌株处于适宜的生长pH；从接入扩大培养种子液开始计时， 48小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时放出首次发酵液20~25 m3。以后每24小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时可再次放出一半发酵液。在发酵过程中应及时跟踪发酵液中杂菌污染状况和单位发酵液中的酶活力两个指标。在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵周期可持续延长。
（4）利用120 m2 聚丙烯板框过滤机将发酵液过滤得到阿魏酸酯酶清液后，利用超滤设备（分子截留量为10000道尔顿）将阿魏酸酯酶清液进行浓缩10倍，然后采用1000kg/h压力喷雾干燥设备制成粉状阿魏酸酯酶。喷雾干燥进口温度140℃，出口温度55℃。
实施例2
（1）菌种制备：
（1.1）将组成型表达阿魏酸酯酶A毕赤酵母菌株按重量百分比1%接种到500mL已灭菌培养基中，在28 ℃、200 rpm条件下培养48小时，作为种子液备用；其中培养基是由下述质量百分比的原料组成：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、余量为水；
（1.2）在50L的发酵罐中制备30 L已灭菌培养基：按质量百分比取工业级原料： 2%淀粉水解液、1%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1mL/m3微量元素母液，120℃灭菌30分钟，作为种子液培养基备用；
（1.3）将步骤（1.1）制备的种子液转入步骤（1.2）制备的含有30 L已灭菌培养基的50L的发酵罐中，在28 ℃、pH5.8、180 rpm条件下培养32小时。
（2）扩大培养：
（2.1）按照步骤（1.2）的方法在6 m3发酵罐内中制备4 m3已灭菌培养基，搅拌均匀后在120℃条件下蒸汽灭菌30分钟，待灭菌培养液温度降至35℃后备用；
（2.2）将步骤（1.3）中制备的30L菌种液转入步骤（2.1）制得的培养液中；在28℃、溶氧量为8mg/L、罐压为0.05Mpa的条件下培养24小时，得到扩大培养种子液备用；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8，使发酵菌株处于适宜的生长pH。
（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：
（3.1）在60m3发酵罐中制备40m3发酵培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在120℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.2）在60m3发酵罐中制备40m3补料培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在120℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.3）将步骤(2.2)中所得扩大培养种子液接入到步骤（3.1）所得发酵培养基中，在温度为30℃，溶氧量为条件下9mg/L，罐压为0.05Mp条件下培养，当还原糖降低到1.5%时，开始加入步骤（3.2）所得补料培养基进行补料，补料速率以还原糖百分比为参考；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至6.0，是发酵菌株处于适宜的生长pH；从接入扩大培养种子液开始计时， 48小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时放出首次发酵液24 m3；以后每24小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时可再次放出一半发酵液。在发酵过程中应及时跟踪发酵液中杂菌污染状况和单位发酵液中的酶活力两个指标。在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵周期可持续延长。
（4）利用100 m2 聚丙烯板框过滤机将发酵液过滤得到阿魏酸酯酶清液后，利用超滤设备（分子截留量为10000道尔顿）将阿魏酸酯酶清液进行浓缩10倍，然后采用1000kg/h压力喷雾干燥设备制成粉状阿魏酸酯酶。喷雾干燥进口温度130℃，出口温度50℃。
实施例3
（1）菌种制备：
（1.1）将组成型表达阿魏酸酯酶A毕赤酵母菌株按重量百分比1%接种到500mL已灭菌培养基中，在30 ℃、240 rpm条件下培养60小时，作为种子液备用；其中培养基是由下述质量百分比的原料组成：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、余量为水；
（1.2）在50L的发酵罐中制备30 L已灭菌培养基：按质量百分比取工业级原料： 2%淀粉水解液、1%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1mL/m3微量元素母液，121℃灭菌30分钟，作为种子液培养基备用；
（1.3）将步骤（3.1）制备的种子液转入步骤（3.2）制备的含有30 L已灭菌培养基的50L的发酵罐中，在29 ℃、pH6.4、200 rpm条件下培养32~48小时。
（2）扩大培养：
（2.1）按照步骤（1.2）的方法在6 m3发酵罐内中制备4 m3已灭菌培养基，搅拌均匀后在124℃条件下蒸汽灭菌30分钟，待灭菌培养液温度降至35℃后备用；
（2.2）将步骤（3.2）中制备的30L菌种液转入步骤（2.1）制得的培养液中；在30℃、溶氧量为10mg/L、罐压为0.05Mpa的条件下培养36小时，得到扩大培养种子液备用；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至6.4，使发酵菌株处于适宜的生长pH。
（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：
（3.1）在60m3发酵罐中制备40m3发酵培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在120℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.2）在60m3发酵罐中制备40m3补料培养：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在120℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.3）将步骤(2.2)中所得扩大培养种子液接入到步骤（3.1）所得发酵培养基中，在温度为30℃，溶氧量为条件下10mg/L，罐压为0.06Mp条件下培养，当还原糖降低到1.5%时，开始加入步骤（3.2）所得补料培养基进行补料，补料速率以还原糖百分比为参考；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至6.3，是发酵菌株处于适宜的生长pH；从接入扩大培养种子液开始计时，48小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时放出首次发酵液25 m3；以后每24小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时可再次放出一半发酵液。在发酵过程中应及时跟踪发酵液中杂菌污染状况和单位发酵液中的酶活力两个指标；在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵周期可持续延长。
（4）利用160 m2 聚丙烯板框过滤机将发酵液过滤得到阿魏酸酯酶清液后，利用超滤设备（分子截留量为10000道尔顿）将阿魏酸酯酶清液进行浓缩10倍，然后采用1000kg/h压力喷雾干燥设备制成粉状阿魏酸酯酶。喷雾干燥进口温度140℃，出口温度60℃。

Claims (2)

1.一种阿魏酸酯酶的生产方法，所述方法利用组成型表达阿魏酸酯酶的基因工程菌株，以淀粉糖化液、玉米浆和氨水等为主要原料发酵产生阿魏酸酯酶，其特征在于：在发酵工程中连续补加发酵培养基和批式排出部分发酵液，在无杂菌污染的条件下持续延长发酵周期，通过对发酵液中的阿魏酸酯酶提取可制得高活力的阿魏酸酯酶制剂，具体步骤如下：
（1）菌种制备：
（1.1）将组成型表达阿魏酸酯酶A毕赤酵母菌株按重量百分比1%接种到500mL已灭菌培养基中，在28~30 ℃、200~240 rpm条件下培养48~60小时，作为种子液备用；其中培养基是由下述质量百分比的原料组成：1%酵母粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、余量为水；
（1.2）在50L的发酵罐中制备30 L已灭菌培养基：按质量百分比取工业级原料： 2%淀粉水解液、1%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1mL/m3微量元素母液，120~124℃灭菌30分钟，作为种子液培养基备用； 
（1.3）将步骤（1.1）制备的种子液转入步骤（1.2）制备的含有30 L已灭菌培养基的50L的发酵罐中，在28~30 ℃、pH5.8~6.4、180~200 rpm条件下培养32~48小时；
（2）扩大培养：
（2.1）按照步骤（1.2）的方法在6 m3发酵罐内中制备4 m3灭菌培养基，待灭菌培养液温度降至35℃后备用；
（2.2）将步骤（1.3）中制备的30L菌种液转入步骤（2.1）制得的培养液中；在28~30℃、溶氧量为8mg/L~10mg/L、罐压为0.05Mpa的条件下培养24~36小时，得到扩大培养种子液备用；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8~6.4，使发酵菌株处于适宜的生长pH；
（3）液体深层发酵生产阿魏酸酯酶：
（3.1）在60m3发酵罐中制备40m3发酵培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在115~121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.2）在60m3发酵罐中制备40m3补料培养基：取下述质量百分比的工业级原料：3%淀粉水解液、1.5%玉米浆、2%氨水、余量为水；用磷酸调整pH至6.8后，加入1.5mL/m3微量元素母液；搅拌均匀后，在115~121℃条件下保温30分钟，降温至35℃后备用；
（3.3）将步骤（2.2）中所得扩大培养种子液转移入到步骤（3.1）所得发酵培养基中进行发酵；在温度为28~30 ℃，溶氧量为条件下8mg/L~10mg/L，罐压为0.05~0.06Mp条件下培养，当还原糖降低到1.5%时，开始加入步骤（3.2）所得补料培养基进行补料，补料速率参照还原糖百分比；在发酵过程中用无菌氨水及时调整发酵液pH至5.8~6.4，是发酵菌株处于适宜的生长pH；从接入扩大培养种子液开始计时，48小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时放出首次发酵液20~25 m3；以后每24小时后停止补料，待还原糖量降至0.2%以下时可再次放出一半发酵液；在发酵过程中应及时跟踪发酵液中杂菌污染状况和单位发酵液中的酶活力两个指标；在无严重杂菌污染和单位发酵液中的酶活力无显著降低的情况下，该发酵周期可持续延长；
（4）阿魏酸酯酶的提纯：
利用100~160 m2 聚丙烯板框过滤机将发酵液过滤得到阿魏酸酯酶清液后，利用分子截留量为10000道尔顿超滤设备将阿魏酸酯酶清液进行浓缩10倍，然后采用1000kg/h压力喷雾干燥设备制成粉状阿魏酸酯酶，喷雾干燥进口温度130~140℃，出口温度50~60℃。
2. 根据权利要求1所述的阿魏酸酯酶的生产方法，其特征在于：步骤（3.3）所述阿魏酸酯酶的测定方法为：以2mM阿魏酸2-氯-对硝基苯酚酯为底物，在含有2.5% Triton-X 100的100mM磷酸pH6.0缓冲液中于40℃条件下反应10分钟，在410nm波长下检测吸光度；酶活单位定义为：在检测条件下，每分钟水解1μmol阿魏酸2-氯-对硝基苯酚酯所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
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