CN114231510A - 一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料配方及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体提供了一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料及其使用方法，以马克斯克鲁维酵母为表达系统，通过在发酵罐发酵过程中阶段性地控制溶氧，待溶氧反弹不下降，开始流加补料A，精确调整酵母细胞生长速度，在发酵罐发酵中期流加补料B，及时调整并补充氮源和磷源，并以碳酸钠溶液替代氨水控制发酵pH，能显著提高发酵液中阿魏酸酯酶的酶活，发酵结束后，发酵上清液中阿魏酸酯酶的酶活高达300000U/ml。该方法成本低、安全性高，解决了目前发酵上清液中阿魏酸酯酶的酶活普遍偏低的问题，实现了高质量的工业化生产转化。

Description

一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料配方及其使用方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料配方及其使用方法
背景技术
阿魏酸酯酶又称为肉桂酸酯酶，属于羧酸酯水解酶亚类，该酶可以水解植物细胞壁中由阿魏酸、p-香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸与半纤维素和木质素形成的酯键，打破它们形成的网状结构，将半纤维素和木质素分开，使纤维素酶可以与纤维素充分接触，大大提高纤维素的降解率。阿魏酸酯酶在加速木质纤维素降解的同时还释放出阿魏酸、p-香豆酸等抗氧化物质，在食品、造纸、医药、化妆品、生产生物乙醇等行业具有很高的应用价值和广阔的市场前景。
研究表明真菌、细菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，已经有近20种不同来源的阿魏酸酯酶基因被克隆和测序，其中多个已经在原核和真核表达系统中实现了异源或同源表达。但目前通过发酵生产的阿魏酸酯酶的酶活普遍偏低，导致生产成本居高不下，限制了阿魏酸酯酶的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中阿魏酸酯酶的发酵酶活偏低的问题。
为此，本发明提供了一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料，包括：补料A和补料B；其中，所述补料A包括200-650g/L的无水葡萄糖、100-300g/L的蔗糖、50-200g/L的甘油、2-8mg/L的生物素、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、80-150mg/L的烟酸和80-150mg/L的泛酸钙；所述补料B包括50-200g/L的酵母浸粉、50-200g/L的蛋白胨、10-50g/L的KH2PO4。
本发明还提供了一种发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将马克斯克鲁维酵母接种到固体培养基中进行活化，获得纯化菌株，将纯化菌株接种到固体培养基中恒温培养，备用；
(2)制备种子液：将活化后的马克斯克鲁维酵母菌株接种到摇瓶种子液培养基中进行发酵培养，得到一级种子液；将一级种子液接种到种子发酵罐中进行发酵培养，得到二级种子液；
(3)发酵罐培养：将二级种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵全程调节pH在5.0-5.5之间；
制备上述用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料，待溶氧反弹不下降，开始流加补料A，控制补料A的补料速度，发酵至35-40h后，同时流加补料A和补料B，控制补料速度，发酵至结束；
(4)过滤、浓缩发酵液，提取阿魏酸酯酶。
具体的，上述步骤(1)中活化温度为28-32℃，活化时间为48-60h，恒温培养温度为28-32℃，培养时间为35-48h；上述步骤(2)中一级种子液的发酵培养温度为28-30℃，摇床转速为150-300rpm/min，培养时间为18-25h。
具体的，上述步骤(2)中以2-15％的接种量将一级种子液接种到种子发酵罐中进行发酵，二级种子液的发酵培养温度为28-32℃，转速为200-400rpm/min，罐压为0.02-0.05Mpa，发酵全程用氨水调节pH在5.0-5.5之间，发酵过程中，控制溶氧在20％以上，当发酵液的湿重为50-130g/L时结束发酵。
具体的，上述步骤(2)中一级种子液和二级种子液的发酵培养基相同，均包括：0.5-3％的无水葡萄糖、0.5-3％的蔗糖、0.5-3％的甘油、0.2-1％的(NH4)2SO4、0.01-0.1％的MgSO4·7H2O、0.05-0.2％的CaSO4·2H2O、0.1-1％的KH2PO4、0.1-0.5％的500x微量元素储液、0.1-0.5％的1000x维生素储液，pH值为5.0-5.5；
其中，所述500x微量元素储液包括1-10g/L的KCl、5-10g/L的EDTA、1-5g/LZnSO4·7H2O、0.1-1g/L的MnCl2·7H2O、0.1-0.5g/L的CoC12·6H2O、0.1-0.5g/L的CuSO4·5H2O、0.1-0.5g/L的Na2MoO4·2H2O、1-5g/L的CaC12·2H2O、1-5g/L的FeSO4·7H2O、0.1-1g/L的H3BO3、0.01-0.1g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.05-0.2g/L的生物素、0.5-2mg/L的尼克酸、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、0.5-2mg/L的吡哆酸、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、1-20mg/L的核黄素、0.05-0.2g/L的泛酸钙、0.05-0.2g/L的烟酸。
具体的，上述步骤(3)中以2-15％的接种量将二级种子液接种到发酵罐中进行发酵，发酵罐发酵培养温度28-32℃，转速为200-650rpm/min，罐压为0.02-0.05Mpa，控制溶氧在40％以上。
具体的，上述步骤(3)中控制补料A的补料速度具体为：从流加补料A时开始计时，0-10h期间内控制溶氧在25-50％，10-30h期间内控制溶氧在0-20％，30h至发酵结束，控制溶氧在25-50％。
具体的，上述步骤(3)中流加的补料B总体积为发酵液总体积的1％，且在32-38h内流加完补料B。
具体的，上述步骤(3)中发酵全程调节pH在5.0-5.5之间具体为：使用氨水将pH控制在5.0-5.5，开始流加补料B时，停止使用氨水，流加浓度为15％的碳酸钠溶液将pH控制在5.0-5.5。
具体的，上述步骤(3)中发酵罐培养基包括：0.5-2％的无水葡萄糖、0.5-2％的蔗糖、0.5-2％的甘油、、0.5-1.5％的(NH4)2SO4、0.1-1％的MgSO4·7H2O、0.5-2％的KH2PO4、0.05-0.2％CaSO4·2H2O、0.1-1％的500x微量元素储液、0.1-0.5％的1000x维生素储液、0.01-0.1％的泡敌，pH值为5.0-5.5；
其中，所述500x微量元素储液包括1-10g/L的KCl、5-10g/L的EDTA、1-5g/L的ZnSO4·7H2O、0.1-1g/L的MnCl2·7H2O、0.1-0.5g/L的CoC12·6H2O、0.1-0.5g/L的CuSO4·5H2O、0.1-0.5g/L的Na2MoO4·2H2O、1-5g/L的CaC12·2H2O、1-5g/L的FeSO4·7H2O、0.1-1g/L的H3BO3、0.01-0.1g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.05-0.2g/L的生物素、0.5-2mg/L的尼克酸、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、0.5-2mg/L的吡哆酸、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、1-20mg/L的核黄素、0.05-0.2g/L的泛酸钙、0.05-0.2g/L的烟酸。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种发酵生产阿魏酸酯酶的方法以马克斯克鲁维酵母为表达系统，通过调节发酵罐发酵培养过程中补料的配方以及补料流加速度，能显著提高发酵液中阿魏酸酯酶的酶活，发酵结束后，发酵上清液中阿魏酸酯酶的酶活高达300000U/ml；该方法成本低、安全性高，解决了目前发酵上清液中阿魏酸酯酶的酶活普遍偏低的问题，实现了高质量的工业化生产转化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
本发明提供了一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料，包括：补料A和补料B；其中，所述补料A包括200-650g/L的无水葡萄糖、100-300g/L的蔗糖、50-200g/L的甘油、2-8mg/L的生物素、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、80-150mg/L的烟酸和80-150mg/L的泛酸钙；所述补料B包括50-200g/L的酵母浸粉、50-200g/L的蛋白胨、10-50g/L的KH2PO4。
本发明还提供了一种发酵生产阿魏酸酯酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将马克斯克鲁维酵母接种到固体培养基中进行活化，活化温度为28-32℃，优选30℃，活化时间为48-60h，获得纯化菌株，将纯化菌株接种到固体培养基中，28-32℃恒温培养35-48h，备用；
其中，固体培养基为YPD培养基；
(2)制备种子液：将活化后的马克斯克鲁维酵母菌株接种到摇瓶种子液培养基中进行发酵培养，培养温度为28-30℃，摇床转速为150-300rpm/min，培养时间为18-25h，优选20h，得到一级种子液；以2-15％的接种量，优选5-8％，将一级种子液接种到种子发酵罐中进行发酵培养，培养温度为28-32℃，优选30℃，转速为200-400rpm/min，罐压为0.02-0.05Mpa，优选0.03Mpa，发酵全程用氨水调节pH在5.0-5.5之间，优选5.0，发酵过程中，通过调节转速和控制通气量，控制溶氧在20％以上，发酵10-15h，优选12h，当发酵液的湿重为50-130g/L，优选80g/L，结束发酵，得到二级种子液，开始转种；
一级种子液和二级种子液的发酵培养基相同，均包括：0.5-3％的无水葡萄糖、0.5-3％的蔗糖、0.5-3％的甘油、0.2-1％的(NH4)2SO4、0.01-0.1％的MgSO4·7H2O、0.05-0.2％的CaSO4·2H2O、0.1-1％的KH2PO4、0.1-0.5％的500x微量元素储液、0.1-0.5％的1000x维生素储液，pH值为5.0-5.5；
其中，所述500x微量元素储液包括1-10g/L的KCL、5-10g/L的EDTA、1-5g/LZnSO4·7H2O、0.1-1g/L的MnCl2·7H2O、0.1-0.5g/L的CoC12·6H2O、0.1-0.5g/L的CuSO4·5H2O、0.1-0.5g/L的Na2MoO4·2H2O、1-5g/L的CaC12·2H2O、1-5g/L的FeSO4·7H2O、0.1-1g/L的H3BO3、0.01-0.1g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.05-0.2g/L的生物素、0.5-2mg/L的尼克酸、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、0.5-2mg/L的吡哆酸、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、1-20mg/L的核黄素、0.05-0.2g/L的泛酸钙、0.05-0.2g/L的烟酸；
培养基配制后110℃-115℃，灭菌20min；
(3)发酵罐培养：以2-15％的接种量，优选8-10％，将二级种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，培养温度28-32℃，优选30℃，转速为200-650rpm/min，罐压为0.02-0.05Mpa，优选0.03Mpa，使用氨水调节pH在5.0-5.5之间，发酵初期，通过调节转速和控制通气量，控制溶氧在40％以上；
配制上述用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料，发酵至6-10h，待溶氧反弹不下降，开始流加补料A，根据发酵时间和溶氧控制补料A的补料速度，具体为从流加补料A时开始计时，0-10h期间内控制溶氧在25-50％，10-30h期间内控制溶氧在0-20％，30h至发酵结束，控制溶氧在25-50％；发酵至35-40h，优选38h，同时流加补料A和补料B并停止使用氨水，通过流加浓度为15％的碳酸钠溶液将pH控制在5.0-5.5；流加的补料B总体积为发酵液总体积的1％，且在32-38h内流加完补料B；发酵至70-78h结束；
其中，发酵罐培养基包括0.5-2％的无水葡萄糖、0.5-2％的蔗糖、0.5-2％的甘油、、0.5-1.5％的(NH4)2SO4、0.1-1％的MgSO4·7H2O、0.5-2％的KH2PO4、0.05-0.2％CaSO4·2H2O、0.1-1％的500x微量元素储液、0.1-0.5％的1000x维生素储液、0.01-0.1％的泡敌，pH值为5.0-5.5；所述500x微量元素储液包括1-10g/L的KCl的5-10g/L的EDTA、1-5g/L的ZnSO4·7H2O、0.1-1g/L的MnCl2·7H2O、0.1-0.5g/L的CoC12·6H2O、0.1-0.5g/L的CuSO4·5H2O、0.1-0.5g/L的Na2MoO4·2H2O、1-5g/L的CaC12·2H2O、1-5g/L的FeSO4·7H2O、0.1-1g/L的H3BO3、0.01-0.1g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.05-0.2g/L的生物素、0.5-2mg/L的尼克酸、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、0.5-2mg/L的吡哆酸、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、1-20mg/L的核黄素、0.05-0.2g/L的泛酸钙、0.05-0.2g/L的烟酸。
所述补料A包括200-650g/L的无水葡萄糖、100-500g/L的蔗糖、50-200g/L的甘油、2-8mg/L的生物素、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、80-150mg/L的烟酸和80-150mg/L的泛酸钙；
所述补料B包括50-200g/L的酵母浸粉、50-200g/L的蛋白胨、10-50g/L的KH2PO4；
培养基和补料均在110-115℃，灭菌20min；
(4)过滤、浓缩发酵液，提取阿魏酸酯酶。
下面通过具体实施例对本发明的发酵生产阿魏酸酯酶的方法的效果进行研究。
本发明中使用的马克斯克鲁维酵母是将来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶基因克隆到重组表达载体，并转化马克斯克鲁维酵母菌株而构建得到，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.10621。
实施例1：
本实施例采用的发酵生产阿魏酸酯酶的方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：将马克斯克鲁维酵母接种到YPD培养基中进行活化，活化温度为30℃，活化时间为60h，获得纯化菌株，将纯化菌株接种到YPD培养基中，在恒温培养箱中30℃培养48h，备用；
(2)制备种子液：将活化后的马克斯克鲁维酵母菌株接种到摇瓶种子液培养基中进行发酵培养，培养温度为30℃，摇床转速为150rpm/min，培养时间为20h，得到一级种子液；以8％的接种量，将一级种子液接种到种子发酵罐中进行发酵培养，培养温度为30℃，转速为200-400rpm/min，罐压为0.03-0.05Mpa，发酵全程用氨水调节pH值为5.0，发酵过程中，通过调节转速和控制通气量，控制溶氧在20％以上，发酵12h后，发酵液的湿重为80g/L，结束发酵，得到二级种子液，开始转种；
一级种子液和二级种子液的发酵培养基相同，均包括：包括：2％的无水葡萄糖、1％的蔗糖、1％的甘油、0.5％的(NH4)2SO4、0.05％的MgSO4·7H2O、0.1％的CaSO4·2H2O、0.3％的KH2PO4、0.2％的500x微量元素储液、0.1％的1000x维生素储液，pH值为5.0；
其中，所述500x微量元素储液包括5g/L的KCl、7.5g/L的EDTA、2.25g/LZnSO4·7H2O、0.5g/L的MnCl2·7H2O、0.15g/L的CoC12·6H2O、0.15g/L的CuSO4·5H2O、0.2g/L的Na2MoO4·2H2O、2.25g/L的CaC12·2H2O、1.5g/L的FeSO4·7H2O、0.5g/L的H3BO3、0.05g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.1g/L的生物素、1mg/L的尼克酸、25mg/L的肌醇、1mg/L的硫胺素、1mg/L的吡哆酸、25mg/L的对氨基苯甲酸、15mg/L的胆碱、5mg/L的核黄素、0.1g/L的泛酸钙、0.1g/L的烟酸；
培养基配制后110℃，灭菌20min；
(3)发酵罐培养：以8％的接种量，将二级种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，培养温度30℃，转速为200-650rpm/min，罐压为0.03-0.05Mpa，使用氨水调节pH值为5.0，发酵初期，通过调节转速和控制通气量，控制溶氧在40％以上，发酵至8h，待溶氧反弹不下降，开始流加补料A，根据发酵时间和溶氧控制补料A的补料速度，具体为从流加补料A时开始计时，0-10h期间内控制溶氧在40％-50％，10-30h期间内控制溶氧在5-15％，30h至发酵结束，控制溶氧在25-40％；发酵至38h，同时流加补料A和补料B并停止使用氨水，通过流加浓度为15％的碳酸钠溶液将pH控制在5.0；流加的补料B总体积为发酵液总体积的1％，且在35h内流加完补料B；发酵至75h结束；
其中，发酵罐培养基包括1％的无水葡萄糖、1％的蔗糖、1％的甘油、1％的(NH4)2SO4、0.5％的MgSO4·7H2O、1％的KH2PO4、0.1％的CaSO4·2H2O、0.7％的500x微量元素储液、0.2％的1000x维生素储液、0.05％的泡敌，pH值为5.0；所述500x微量元素储液包括5g/L的KCl、7.5g/L的EDTA、2.25g/L的ZnSO4·7H2O、0.5g/L的MnCl2·7H2O、0.15g/L的CoC12·6H2O、0.15g/L的CuSO4·5H2O、0.2g/L的Na2MoO4·2H2O、2.25g/L的CaC12·2H2O、1.5g/L的FeSO4·7H2O、0.5g/L的H3BO3、0.05g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.1g/L的生物素、1mg/L的尼克酸、25mg/L的肌醇、1mg/L的硫胺素、1mg/L的吡哆酸、25mg/L的对氨基苯甲酸、15mg/L的胆碱、5mg/L的核黄素、0.1g/L的泛酸钙、0.1g/L的烟酸；
所述补料A包括300g/L的无水葡萄糖、200g/L的蔗糖、50g/L的甘油、5mg/L的生物素、25mg/L的肌醇、1mg/L的硫胺素、25mg/L的对氨基苯甲酸、15mg/L的胆碱、100mg/L的烟酸和100mg/L的泛酸钙；
所述补料B包括80g/L的酵母浸粉、120g/L的蛋白胨、20g/L的KH2PO4；
培养基和补料均在115℃，灭菌20min。
发酵结束后，检测上清液中阿魏酸酯酶的酶活，结果如表1所示。
比较例1：
本比较例采用与实施例1相同的方法发酵生产阿魏酸酯酶，区别在于，步骤(3)发酵罐培养过程中不流加补料B。
发酵结束后，检测上清液中阿魏酸酯酶的酶活，结果如表1所示。
比较例2：
本比较例采用与实施例1相同的方法发酵生产阿魏酸酯酶，区别在于，步骤(3)发酵罐培养全程采用氨水将pH控制在5.0。
发酵结束后，检测上清液中阿魏酸酯酶的酶活，结果如表1所示。
比较例3：
本比较例采用与实施例1相同的方法发酵生产阿魏酸酯酶，区别在于，步骤(3)发酵罐培养过程中，开始流加补料A后，溶氧始终控制在5-15％。
发酵结束后，检测上清液中阿魏酸酯酶的酶活，结果如表1所示。
比较例4：
本比较例采用与实施例1相同的方法发酵生产阿魏酸酯酶，区别在于，步骤(3)发酵罐培养过程中，开始流加补料A后，溶氧始终控制在40-50％。
发酵结束后，检测上清液中阿魏酸酯酶的酶活，结果如表1所示。
比较例5：
本比较例采用中国发明专利CN202011048393.5中提供的生产阿魏酸酯酶的方法，将重组枯草芽孢杆菌(保藏编号为CCTCC NO:M2020421)接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵结束后，检测阿魏酸酯酶的酶活，结果如表1所示。
表1阿魏酸酯酶的酶活
Figure BDA0003400851590000101
由表1中实施例1和比较例1-5的结果可知，在马克斯克鲁维酵母发酵生产阿魏酸酯酶的过程中，通过阶段性地控制溶氧，精确调整酵母细胞生长速度，在发酵罐发酵中期流加补料B，及时调整并补充氮源和磷源，以碳酸钠溶液替代氨水控制发酵pH，可以大幅提高发酵过程中阿魏酸酯酶的产酶量。由比较例5结果可知，采用马克斯克鲁维酵母作为阿魏酸酯酶表达系统，相较于枯草芽孢杆菌，能更有效地提高阿魏酸酯酶的产酶量。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料，其特征在于，包括：补料A和补料B；其中，所述补料A包括200-650g/L的无水葡萄糖、100-300g/L的蔗糖、50-200g/L的甘油、2-8mg/L的生物素、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、80-150mg/L的烟酸和80-150mg/L的泛酸钙；所述补料B包括50-200g/L的酵母浸粉、50-200g/L的蛋白胨、10-50g/L的KH2PO4。
2.一种发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将马克斯克鲁维酵母接种到固体培养基中进行活化，获得纯化菌株，将纯化菌株接种到固体培养基中恒温培养，备用；
(2)制备种子液：将活化后的马克斯克鲁维酵母菌株接种到摇瓶种子液培养基中进行发酵培养，得到一级种子液；将一级种子液接种到种子发酵罐中进行发酵培养，得到二级种子液；
(3)发酵罐培养：将二级种子液接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵全程调节pH在5.0-5.5之间；
制备如权利要求1所述的用于发酵生产阿魏酸酯酶的补料，待溶氧反弹不下降，开始流加补料A，控制补料A的补料速度，发酵至35-40h后，同时流加补料A和补料B，控制补料速度，发酵至结束；
(4)过滤、浓缩发酵液，提取阿魏酸酯酶。
3.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：所述步骤(1)中活化温度为28-32℃，活化时间为48-60h，恒温培养温度为28-32℃，培养时间为35-48h；所述步骤(2)中一级种子液的发酵培养温度为28-30℃，摇床转速为150-300rpm/min，培养时间为18-25h。
4.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)中以2-15％的接种量将一级种子液接种到种子发酵罐中进行发酵，二级种子液的发酵培养温度为28-32℃，转速为200-400rpm/min，罐压为0.02-0.05Mpa，发酵全程用氨水调节pH在5.0-5.5之间，发酵过程中，控制溶氧在20％以上，当发酵液的湿重为50-130g/L时结束发酵。
5.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中一级种子液和二级种子液的发酵培养基相同，均包括：0.5-3％的无水葡萄糖、0.5-3％的蔗糖、0.5-3％的甘油、0.2-1％的(NH4)2SO4、0.01-0.1％的MgSO4·7H2O、0.05-0.2％的CaSO4·2H2O、0.1-1％的KH2PO4、0.1-0.5％的500x微量元素储液、0.1-0.5％的1000x维生素储液，pH值为5.0-5.5；
其中，所述500x微量元素储液包括1-10g/L的KCl、5-10g/L的EDTA、1-5g/L的ZnSO4·7H2O、0.1-1g/L的MnCl2·7H2O、0.1-0.5g/L的CoC12·6H2O、0.1-0.5g/L的CuSO4·5H2O、0.1-0.5g/L的Na2MoO4·2H2O、1-5g/L的CaC12·2H2O、1-5g/L的FeSO4·7H2O、0.1-1g/L的H3BO3、0.01-0.1g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.05-0.2g/L的生物素、0.5-2mg/L的尼克酸、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、0.5-2mg/L的吡哆酸、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、1-20mg/L的核黄素、0.05-0.2g/L的泛酸钙、0.05-0.2g/L的烟酸。
6.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)中以2-15％的接种量将二级种子液接种到发酵罐中进行发酵，发酵罐发酵培养温度为28-32℃，转速为200-650rpm/min，罐压为0.02-0.05Mpa，控制溶氧在40％以上。
7.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中控制补料A的补料速度具体为：从流加补料A时开始计时，0-10h期间内控制溶氧在25-50％，10-30h期间内控制溶氧在0-20％，30h至发酵结束，控制溶氧在25-50％。
8.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流加的补料B总体积为发酵液总体积的1％，且在32-38h内流加完补料B。
9.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵全程调节pH在5.0-5.5之间具体为：使用氨水将pH控制在5.0-5.5，开始流加补料B时，停止使用氨水，流加浓度为15％的碳酸钠溶液将pH控制在5.0-5.5。
10.如权利要求2所述的发酵生产阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中发酵罐培养基包括：0.5-2％的无水葡萄糖、0.5-2％的蔗糖、0.5-2％的甘油、.5-1.5％的(NH4)2SO4、0.1-1％的MgSO4·7H2O、0.5-2％的KH2PO4、0.05-0.2％的CaSO4·2H2O、0.1-1％的500x微量元素储液、0.1-0.5％的1000x维生素储液、0.01-0.1％的泡敌，pH值为5.0-5.5；
其中，所述500x微量元素储液包括1-10g/L的KCl、5-10g/L的EDTA、1-5g/L的ZnSO4·7H2O、0.1-1g/L的MnCl2·7H2O、0.1-0.5g/L的CoC12·6H2O、0.1-0.5g/L的CuSO4·5H2O、0.1-0.5g/L的Na2MoO4·2H2O、1-5g/L的CaC12·2H2O、1-5g/L的FeSO4·7H2O、0.1-1g/L的H3BO3、0.01-0.1g/L的KI；所述1000x维生素储液包括0.05-0.2g/L的生物素、0.5-2mg/L的尼克酸、10-100mg/L的肌醇、0.5-2mg/L的硫胺素、0.5-2mg/L的吡哆酸、10-100mg/L的对氨基苯甲酸、10-50mg/L的胆碱、1-20mg/L的核黄素、0.05-0.2g/L的泛酸钙、0.05-0.2g/L的烟酸。
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