JP5317262B2 - ケカビによるエタノールの製造法 - Google Patents
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一方、草本系バイオマスである稲わらおよびもみ殻は、我が国の農産廃棄物の代表で、セルロース、ヘミセルロース、リグニンを含んでいる。
また、加水分解の際に生ずる発酵阻害物質(フルフラール、5-ヒドロキシメチルフラード、酢酸など)により強く発酵が阻害されるため、エタノール発酵効率の向上や阻害物質除去法の開発が必須である。
さらに、組換え微生物を用いた場合には、高いエタノール生産性を達成できるものの、組換え菌を使用する際の安全対策として、発酵装置から菌体の流失を防ぐためのシールド対策、発酵後の殺菌対策などの付帯設備を用意する必要がある(特許文献3)。さらに、倫理的問題を解決していく必要がある。
Toivola, A., Yarrow, D., van den Bosch, E., van Dijen, J.P., andScheffers, W.A. (1984) Alcoholic Fermentation of D-xylose by Yeasts, Appliedand Environmental Microbiology, June, 1221-1223 Trans, A.V. and Chambers, R.P. (1986)Ethanol Fermentation of Red Oak Acid Prehydrolysate by the Yeast Phichia stipitis CBS 5776, Enzyme Microbiology and Technology, Vol.8, 439-444.
本発明は、上記問題点を解決しつつ、微生物の作用を利用して、バイオマス資源の主成分であるデンプン、セルロース、およびヘミセルロースの加水分解物から、エタノールを製造する方法を提供することを目的とする。
その結果、これまでキシロースからのエタノール生成活性が知られていなかったケカビ、特にムコール(Mucor)属またはリゾムコール(Rhizomucor)属の微生物が、グルコースまたはキシロースを含む加水分解液からエタノールを生成する能力に優れていることを見出し、本発明を完成した。
〔1〕木質系バイオマスまたは草本系バイオマスの加水分解物にケカビに属する糸状菌を作用させることを特徴とするエタノールの製造方法。
〔2〕ケカビに属する糸状菌がペントースの資化能を有するものである〔1〕のエタノールの製造方法。
〔3〕ペントースの資化能を有するケカビに属する糸状菌がムコール(Mucor)属またはリゾムコール(Rhizomucor)属である〔1〕または〔2〕のエタノールの製造方法。
〔4〕木質系バイオマスまたは草本系バイオマスの加水分解物が、ペントースおよび/またはヘキソースを含むものである〔1〕〜〔3〕のエタノールの製造方法。
〔5〕草本系バイオマスが穀類、稲わら、もみ殻、麦わらまたはバガスである〔1〕〜〔4〕のエタノールの製造方法。
ムコール・バシリイホルムス(Mucor bacilliformis)
ムコール・シイルシネロイデェス(Mucor circinelloides)
ムコール・グイリイモビイデイ(Mucor guilliermobidii)
ムコール・ヘマリス(Mucor hiemalis)
ムコール・ヤバニカス(Mucor javanicus)
ムコール・ラセモサス(Mucor racemosus)
ムコール・オドラトス(Mucor odoratus)
リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)
リゾムコール・プシルス(Rhizomucor pusillus)
カビ:”The Genera of Hyphomycetes from soil”, G.L.Barron, Baltimore, Maryland, Williams and Wilkins(1968). ”Compendium of soil Fungi”, K.H. Domsh, W. Gams, T. Anderson, New York, Academic Press(1980).
ムコール・バシリイホルムス(NBRC6414,8638)
ムコール・シイルシネロイデェス(NBRC4554,4563,4574,5398,5774,5775,6746,30470,31398)
ムコール・グイリイモビイデイ(NBRC9403)
ムコール・ヘマリス(NBRC9261,9410,9411,9412)
ムコール・ヤバニカス(NBRC4569,4570,4572,5382)
ムコール・オドラトス(NBRC7102,8637)
ムコール・ラセモサス(NBRC4581,5403)
リゾムコール・ミエヘイ(NBRC9740,9741,9742,9743)
リゾムコール・プシルス(NBRC4578,4579,4580,9744,9745,9856)
これらの糸状菌は、野生株、変異株、または、細胞融合、もしくは遺伝子操作などの遺伝子手法より誘導される組み換え株など、いずれの株も好適に用いることができる。また、これらの糸状菌は、単独または混合して使用することができ、酵母などのヘキソースの資化能・発酵能を有する微生物と組み合わせて使用することもできる。
バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門(NBRC) 発行の微生物カタログ第1版(2005年)に記載されており、NBRCより入手することができる。
本発明で用いる菌は糸状性を持つため,簡便な方法でエタノールを分離することができる。
さらに、好気条件でもエタノールが生産できるため、嫌気環境を作るための施設を必要としない。
本発明に使用される培地はいわゆる液体培地であって、炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類、核酸成分、微量金属塩等を必要により取捨選択し、組み合わせて適当量添加した水溶液が使用可能である。
以下に示す組成の培地を調製した後、この培地25mLを100mLエーレンマイヤーフラスコに分注し、オートクレーブ(121℃、15分間)により滅菌した。
炭素源
グルコース5.0%、キシロース5.0%、あるいはグルコース2.5%とキシロース2.5%の混合液、
その他成分
酵母エキス 0.5%
硫酸アンモニウム 0.75%
硫酸アンモニウム・7水和物 0.075%
リン酸水素二カリウム 0.35%
塩化カルシウム 0.1%
pH 7.5(pH調整剤: 1N水酸化ナトリウム水溶液)
一方、本発明では、各培養上清液中のエタノールが確認できたことから、好気培養によりグルコースまたはキシロースを炭素源としてエタノールを生産できることを見出した。特に、Rhizomucor pusillus NBRC4578を用いた場合、グルコースを炭素源とした時のエタノール濃度は、22.0g/L、キシロースの時、2.15g/L、またはグルコースとキシロースの混合液の時に、11.5g/Lできることが判明した。さらに、グルコースを用いて得られたエタノール収率YE/Sは0.44以上と、前述の酵母あるいはZymomonas mobilisなどを培養した際に用いて得られる最大収率0.42あるいは0.44を上回るエタノールを生産できる微生物であることがわかった。一方、キシロースを用いて得られたエタノール収率YE/Sは0.12と、前述のPichia stipitis CBS5776を微好気条件下で用いた場合に得られる最大収率0.36と同等量のエタノールを得ることはできないものの、好気条件下でかなり高い収率でエタノールを得ることができることがわかった。
以下に表1、表2、表3にまとめた。
カラム;BPX5、内径0.25μm x 25m(SGE製)
移動相;ヘリウムガス
流速;32mL/分間
カラム温度;60℃(2min)→ 15℃上昇/分→180℃(5min)
検出器;水素炎イオン化型検出器 (FID,GC−2010,島津製作所製)
検出時間:0.95分間
カラム;CARBOSep Gel−87P (東京化成工業製)
移動相;水
流速;1.0mL/分間
カラム温度;80℃
検出器;示唆屈性計(RID−10A,島津製作所製)
検出時間:グルコース 7.1分間,キシロース 7.8分間
標準物質;L−グルコース(和光純薬製)、キシロース(和光純薬製)
表中、Gは炭素源としてグルコース50g/Lを示す。Xは炭素源としてキシロース50g/Lを示す。 G+Xは炭素源としてグルコース25g/Lとキシロース25g/Lの混合液を示す。なお、培養は、28℃で120rpmの振盪培養を行った。
実施例1と同じ培地を調製し、各々25mLを100mLエーレンマイヤーフラスコ中に分注し、オートクレーブ(121℃、15分間)により滅菌した。Rhizomucor pusillus NBRC4578を各フラスコに等量植菌後、実施例1と同じ培地を用いて同じ条件で120時間28℃で静置嫌気培養と好気振盪培養を行い、実施例1と同様の方法にて、適当な時間ごとにフラスコを回収し、培養上清液を調製した。
実施例2と同じ培地を調製し、各々25mLを100mLエーレンマイヤーフラスコ中に分注し、オートクレーブ(121℃、15分間)により滅菌した。Saccharomyces cerevisiae 協会7号を用いて、静置嫌気培養と好気振盪培養を行った。
また、キシロースを用いた場合(図4)、嫌気または好気条件いずれの場合でも、キシロースの消費は認められたが、エタノールの培地中での蓄積は確認することはできなかった。
本発明が、農産廃棄物である稲わらの加水分解物からエタノールを生産できるか確認するために、4Lのサクラ精機製気泡塔型バイオリアクター中に硫酸による稲わら加水分解液4.0Lを仕込み、常法により滅菌処理を行った。
硫酸加水分解稲わらの調製は、300g−dryの稲わらを0.5%硫酸水溶液3L中に24時間浸した後、121℃で60分間オートクレーブ処理を行った。その後、沈殿物を除いた後、6N水酸化ナトリウムを用いて体積4.0L、pH7.5に調製した。この時得られた加水分解物溶液の成分は、ヘキソース(グルコース>22g/L,ガラクトース<0.1g/L,マンノース<0.1g/L),ペントース(キシロース>15g/L,アラビノース<0.8g/L),カルソンリグニン(24.2g/L),酸可溶リグニン(2.2g/L)である。この溶液を直接気泡塔型バイオリアクター内に入れ、そこへRhizomucor pusillus NBRC4578を植菌することにより120時間好気培養を行った(図5)。
また、気泡塔は28℃に制御し、さらに、好気条件に保つために、除菌した空気0.2VVMになるようにリアクター内に供給した。
また、比較のためにグルコース30g/Lとキシロース20g/L(グルコース:キシロース=3:2)を炭素源とした培養も同時に行った。
Claims (4)
- 草本系バイオマスの加水分解物にMucor Circinelloides、Mucor javanicus、及びRhizomucor Pusillusからなる菌株群より選ばれる少なくとも一種のケカビに属する糸状菌を作用させることを特徴とするエタノールの製造方法。
- ケカビに属する糸状菌がペントースの資化能を有するものである請求項1記載のエタノールの製造方法。
- 草本系バイオマスの加水分解物が、ペントースおよび/またはヘキソースを含むものである請求項1または2記載のエタノールの製造方法。
- 草本系バイオマスが穀類、稲わら、もみ殻、麦わらまたはバガスである請求項1〜3いずれか記載のエタノールの製造方法。
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