CN107686818A - 一种灰树花多糖产生菌及灰树花多糖制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灰树花多糖产生菌及灰树花多糖制备方法，灰树花多糖产生菌（Griflola frondosa）菌株AHSW GF‑001，保藏编号为CGMCC No.14548。采用本发明得到的灰树花多糖的含量在65%左右，灰树花多糖的产量达到3.29g/l。

Description

一种灰树花多糖产生菌及灰树花多糖制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程和食药用菌技术领域，具体涉及一种采用原生质体紫外诱变得到的灰树花新菌株以及利用此菌株进行液体深层发酵法制备灰树花多糖的方法。
背景技术
灰树花是一种食药兼用的大型真菌，属于真菌界、真菌门、担子菌亚门、层菌纲、无隔担子菌亚纲、非褶菌目、多孔菌科、灰树花菌属真菌，学名：Grifola frondosa(Dicks，ex Fr)S．F．Gray，灰树花多糖是灰树花中含量较高的物质，也是其主要功能性成分之一。依据现代的工业技术可以从灰树花子实体、菌丝体以及发酵液中提取灰树花多糖。灰树花多糖主要由D-葡萄糖以及少量的D-木糖、D-甘露糖、D-盐藻糖、L-阿拉伯糖、龙胆二糖和半乳糖组成的一类异构糖复合物，具有生物活性的灰树花多糖的基本结构为带有β-(1-6)侧链的β(1-3)-D-葡聚糖。国内外的研究已经证实灰树花多糖具有防癌、抗癌，抗衰老、抗HIV、促进性腺功能，临床拥有防治糖尿病，抑制肥胖，调节血压，治疗动脉硬化和脑血栓等症，口服能美容和滋润皮肤、延缓老年斑出现，另外其对于增加食欲、提高免疫力、增强记忆力有显著的作用。
液体深层发酵法制备真菌多糖是真菌多糖生产产业化发展的未来趋势，与传统的子实体提取相比，其具有不受季节因素影响、生产周期短、生产效率高以及工业化连续生产等优势，同时生产场地占地面积小，技术便于规模化推广。
原生质体紫外诱变法以原生质体为生物材料，利用紫外线进行诱变筛选变异株的方法。由于原生质体缺少了细胞壁的保护，使得其对紫外线的照射更加敏感，更易引起变异。紫外诱变可使生物材料的DNA分子形成嘧啶二聚体，减弱双键间氢键的作用，引起DNA双链的结构变形扭曲，影响其复制和转录，同时引起碱基颠换、转换、缺失或移码，造成突变。相较于其他诱变育种的方法，本方法具有工艺较为简单、材料易获得、对设备要求不高以及试验过程对人体无毒害等优势。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可进行液体深层发酵法生产制备灰树花多糖（包含菌丝体多糖和发酵液多糖）的菌株及其灰树花多糖制备方法。
本发明的技术解决方案是：
一种灰树花多糖产生菌（Griflola frondosa）菌株AHSW GF-001，其特征是：保藏编号为CGMCC No.14548；分类命名：灰树花，拉丁文学名：Griflola frondosa，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，保藏日期2017年8月28日。
灰树花新菌株的选育
1、灰树花诱变出发菌株的筛选：引进多株灰树花菌株，进行液体发酵多糖产量比较试验，以液体发酵灰树花多糖产量（包括胞外多糖和胞内多糖）为指标，选择灰树花多糖产量最高且菌丝生长速度较快、发酵周期较短的菌株作为诱变的出发菌株。
2、以灰树花出发菌株制备原生质体悬液，而后对原生质体悬液进行紫外诱变处理，15w紫外灯管距离样品20cm照射60s，而后进行涂布再生培养。
3、菌株初选：选择生长速度较快、菌丝形态较粗壮的菌株进行培养。
4、复筛：先后与出发菌株进行菌丝拮抗试验，液体摇甁发酵试验比较多糖产量指标。选择菌丝拮抗试验呈阳性，产量指标明显高于出发菌株的菌株，而后与出发菌株进行酯酶同工酶电泳试验，验证该菌株是否为不同于出发菌株的变异株。
5、遗传稳定性试验：将新菌株进行连续传代培养10代后，与初代菌株试验比较液体摇甁发酵菌丝生物量和多糖产量有无明显退化，相关指标无明显变化的菌株即为遗传性状稳定的菌株，选择其作为最终的目标菌株-灰树花新菌株。
液体深层发酵法制备灰树花多糖：
灰树花斜面菌种接种于种子液培养基中，种子液培养基配方为葡萄糖2.0%，玉米粉1.5%，豆饼粉1. 5%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，pH自然。
旋转式摇床140r/min，26℃培养12天。种子液10L。
以种子液10%接种量接种于发酵培养基中，发酵罐100L，装液量60%，发酵培养基配方：葡萄糖2.5%，玉米粉2.5%，豆饼粉0.75%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，pH自然。
搅拌速度140r/min，通气量1:0.5-1vvm，温度26℃。
发酵80-110小时（约96h左右，具体发酵终点的判断为还原糖浓度稳定不再明显下降，pH值缓慢上升时为发酵终点）。
而后对发酵液进行分离，收集菌丝体，破碎后采取先超声辅助处理，而后进行水提浓缩醇沉和干燥的方法进行胞内多糖的提取制备。收集发酵液进行浓缩至1/10体积，而后用4倍体积无水乙醇静置，沉淀干燥，即得灰树花胞外多糖。
采用上述方法得到的灰树花多糖的含量在65%左右，灰树花多糖的产量达到3.29g/l。
具体实施方式
一种灰树花多糖产生菌（Griflola frondosa）菌株AHSW GF-001，分类命名：灰树花，拉丁文学名：Griflola frondosa，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，保藏日期2017年8月28日。
该菌株是以灰树花1号（引自北京吉蕈园科技有限公司）为出发菌株，利用原生质体紫外诱变的方法进行诱变筛选，得到的变异株，编号：14548。
实施例1：
灰树花新菌株的选育
(1)原生质体制备：PD液体培养基中培养灰树花菌丝，收集湿菌丝1g，加入0.6mol/l的甘露醇配制的2%的溶壁酶+蜗牛酶10ml，32℃酶解3h，0.6mol/l的甘露醇溶液洗涤后3000r/min离心，处理2次，稀释至107个/ml级，得到灰树花原生质体悬液。
(2)紫外诱变：取精制的原生质体悬液，涡旋混匀，取约15-20毫升，置于灭菌培养皿中，放置灭菌回形针2个。紫外诱变箱中进行紫外诱变处理，同时开启磁力搅拌。紫外灯管15w，距离20cm，处理60s。取0.2ml涂布于RM再生培养基上，26℃避光培养10-12d，诱变过程中避免可见光，防止发生光修复。
(3)菌株筛选：挑选生长速度较快、菌丝外形较为粗壮的菌株进一步进行拮抗试验、摇甁液体发酵试验，液体发酵试验培养基采用PD液体培养基，培养条件为140r/min，26℃培养10天左右，选取拮抗试验阳性的菌株，摇甁液体发酵试验菌丝生物量和多糖产量高的菌株作为新的变异菌株，而后进行同工酶电泳试验，进一步确定试验菌种是否发生变异。
(4)遗传稳定性试验：将试验的变异菌株在PDA培养基斜面上进行继代培养10次，而后与初代菌株一起进行摇甁液体发酵试验，比较菌丝生物量以及多糖产量指标有无明显变化，数据进行统计学分析，选择无明显变化的菌株作为目标菌株(p＞0.5)。试验获得一株灰树花变异株，编号AHSWGF-001。
PD液体培养基：马铃薯汁200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1g，水1000ml，pH自然。
原生质体RM再生培养基：麦芽糖10g,葡萄糖4g,蛋白胨5g,酵母粉4g,琼脂20g，0.6mol/l蔗糖溶液1000ml，pH自然。
PDA固体培养基：马铃薯汁200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏1g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。
实施例2：
液体发酵法制备灰树花多糖
1、 灰树花PDA斜面菌种接种于种子液培养基中，26℃，140r/min摇床培养12天。10%接种量接液体种子液于发酵培养基中，26℃，140r/min摇床培养5-7天。
2、 将种子液10%接种量接种于100L发酵罐中，发酵罐装液量60%，发酵液培养基配方为：葡萄糖2.5%，玉米粉2.5%，豆饼粉0.75%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，pH自然。通气量1:0.5vvm，搅拌速度140r/min。还原糖浓度不再下降，pH值出现缓慢回升，约为96h后达到发酵终点。
3、 灰树花菌丝体多糖提取：到达发酵终点后，对发酵液过滤，收集菌丝体，菌体破碎后，加水，料水比约为1:30，超声提取30min，而后95℃提取1h，提取2次，合并提取液，浓缩至1/10体积，加入4倍体积的无水乙醇静置沉淀，沉淀进行真空干燥，得到灰树花菌丝体多糖提取物。经计算测定灰树花粗多糖得率为0.78g/l，样品中灰树花粗多糖纯度达到70%，
4、 灰树花发酵液多糖提取：到达发酵终点后，对发酵液过滤，收集滤液，浓缩至1/10体积，然后加4倍体积的无水乙醇沉淀，静置过夜，沉淀真空干燥。得到灰树花发酵液多糖提取物，测定灰树花多糖含量。样品中灰树花多糖纯度达到65%，灰树花粗多糖提取率为2.51g/l。
上述实施过程中灰树花多糖的含量测定采用硫酸蒽酮法。

Claims (2)

1.一种灰树花多糖产生菌（Griflola frondosa）菌株AHSW GF-001，其特征是：保藏编号为CGMCC No.14548。
2.一种利用权利要求1所述的灰树花多糖产生菌菌株制备多糖的方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）灰树花多糖产生菌菌株菌种接种于种子液培养基中，种子液培养基配方为葡萄糖2.0%，玉米粉1.5%，豆饼粉1. 5%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%；
（2）旋转式摇床140r/min，26℃培养12天；种子液10L；
（3）以种子液10%接种量接种于发酵培养基中，发酵罐100L，装液量60%；发酵培养基配方：葡萄糖2.5%，玉米粉2.5%，豆饼粉0.75%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%；
（4）搅拌速度140r/min，通气量1:0.5-1vvm，温度26℃；发酵80-110小时；
（5）然后对发酵液进行分离，收集菌丝体，破碎后采取先超声辅助处理，而后进行水提浓缩醇沉和干燥的方法进行胞内多糖的提取制备；将收集发酵液进行浓缩至1/10体积，而后用4倍体积无水乙醇静置，沉淀干燥，即得灰树花胞外多糖。
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180213

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