CN102080113A - 使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法 - Google Patents
使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102080113A CN102080113A CN 201010579048 CN201010579048A CN102080113A CN 102080113 A CN102080113 A CN 102080113A CN 201010579048 CN201010579048 CN 201010579048 CN 201010579048 A CN201010579048 A CN 201010579048A CN 102080113 A CN102080113 A CN 102080113A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- grifola frondosa
- polysaccharide
- strain
- substratum
- rice bran
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于微生物应用技术和食品生物技术领域，公开了使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法。按照下述步骤进行：（1）采用植物水解酶对米糠和麸皮进行处理；（2）将得到处理液作为培养基使用诱变得到的灰树花菌株发酵，菌株保藏编号为CGMCCNo.4179；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水清洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白及乙醇沉淀即可得胞内多糖；（5）发酵液离心后的上清液脱蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。本发明可以降低生产成本，节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，生产出高价值的具有辅助抗肿瘤治疗效果的灰树花多糖。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及使用一株适合在米糠和麸皮复合物为碳源和氮源的培养基上生长的灰树花诱变菌株，发酵并高产多糖的方法。
背景技术
国内外科学研究和国内市场表明：食用菌多糖能增强人体免疫力，辅助治疗肿瘤等疾病，已成为肿瘤生物疗法选用的辅助用品。国内由食用菌子实体制成的药字号产品有安徽芜湖的灵芝胶囊、浙江庆元的灰树花胶囊等，由食用菌提取物制成的非药字号保健品也有销售。国际上新西兰产有“GanoPoly”（甘诺宝力）多糖提取物系列产品，销往美国、澳大利亚、中国（包括香港和台湾）等地方。该产品的发明人高益槐是国际知名食用菌产品开发专家，曾经获得爱因斯坦发明奖。高益槐发明的“GanoPoly”系列产品主要由灵芝、云芝、猴头等提取的多糖与壳聚糖一道复合构成，用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等。新西兰安发保健品有限公司现在中国福建泉州建有食用菌多糖的生产基地。在各种食用菌多糖的研究中，现在已有研究说明，药食两用食用菌灰树花的多糖也具有较好的提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等的功效，值得引起足够的重视，例如Ohno Naohito 、Suzuki Iwao等从灰树花菌体中提取灰树花多糖的药效试验表明，灰树花多糖具有抗肿瘤作用和免疫调节作用（参考文献见① Ohno N,Lino K,Suzuki I et al. Neutral and acidic antitumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of Grifola Frondosa[J]. Chem. Pharm. Bull,1985,33(3):1181-1186；② Naohito Ohno,Yoshiyuki Adachi,Iwao Suzuki,et al.characterization of the antiumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa[J].Chem.pharm.Bull.1986,34(4):1709；③Iwao Suzuki,Koichi Hashimoto,Shozo Oikawa,et al.Antiumor and immunmodulating activity of a β-glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa[J].chem.Pharm Bull,1986,37(2):410.）。
灰树花（Grifola frondosa）是一种药食两用的食用菌，属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花（或称奇果菌）属。灰树花有多种名称，如奇果菌、贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、莲花菌、舞茸等 。野生灰树花分布于日本、欧洲、北美和我国许多地区，如黑龙江、吉林、河北、四川、云南、广西、福建等省区。近年来，国内灰树花已在一些省份如河北、浙江、福建等省获得栽培，用于鲜食或提取功能成分。 灰树花栽培的缺点是占用土地，生产周期相对较长。为高效生产灰树花多糖，研究人员对能工厂化生产的液体培养方法的研究十分重视，形成多种研究成果。1986年Ohno N等报道了灰树花液态培养的研究。国内江南大学陈石良的博士论文研究了灰树花深层发酵技术及灰树花的抗肿瘤多糖（参考文献见：陈石良. 药用真菌灰树花深层发酵技术及其抗肿瘤多糖的研究[D].博士学位论文.无锡:江南大学，2000.）。这类研究的内容主要涉及培养基研制、培养工艺、适宜菌种选育等。研究的重点是降低生产成本和提高多糖产量。多数工艺采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯等作为培养基，即使用到农产品加工的副产品如米糠或麸皮，也是作为次要成分加入，一般还需要大量使用葡萄糖或其他粮食类原料。现有的灰树花菌种难以在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠或麸皮的培养基上生长。本专利设计人刘伟民、杨锁华、顾慧敏曾对原有的灰树花菌种在米糠培养基上液体发酵产灰树花多糖的可能性进行过研究，发现尽管对菌株也进行过初步紫外诱变的处理，如不添加较大量的葡萄糖，灰树花在米糠培养基上发酵不理想，所以杨锁华和顾慧敏的硕士论文研究中，仍添加了较多的葡萄糖，故而只以农产品加工副产品为原料生产灰树花多糖以降低成本的设想并没有能得到真正的实现（参考文献见：杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2006；顾慧敏.灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江：江苏大学.2009.）。
中国是农业大国，农副产品来源丰富。米糠、麸皮作为稻谷和小麦加工的副产物，不但其营养成分丰富，而且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灰树花生长所需要的碳源和氮源的原始物质。在灰树花自身纤维素酶及其他酶的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灰树花多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，作为完全的碳源和氮源，而不添加其他碳源和氮源，提供灰树花液体发酵所需的碳源和氮源营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灰树花多糖，将具有经济价值。本发明将得到实现这一目标的一种有效方法。特别说明：本发明所述的米糠麸皮培养基特指只以米糠和麸皮复合物为碳源和氮源物质的培养基，培养基中不再添加其他碳源和氮源物质。
发明的关键问题之一为必须得到适宜在米糠和麸皮复合培养基上生长的灰树花菌株，所以必须对已有菌株进行诱变筛选，因为现有的灰树花菌株在米糠麸皮培养基上生长情况不理想，如能筛选出适宜的灰树花菌株，则研究和生产将有可能取得突破。目前微生物的物理选育方法主要有紫外诱变、离子束诱变、微波诱变等。为了诱变筛选出适合在米糠和麸皮复合培养基上生长并产多糖的灰树花菌株，有必要将紫外诱变与微波诱变进行复合，强化诱变的极端环境，扩大被试灰树花出发菌株突变的位点范围，提高得到正突变菌株的可能性。本发明所采用的紫外诱变与微波诱变进行复合，诱变得到适合在米糠和麸皮培养基上生长并产灰树花多糖的高效菌株的思路还未见有同类报道，所得菌株也为首次发明得到。本发明的另一关键问题为必须得到使用诱变菌株在米糠麸皮复合培养基上进行发酵高产灰树花多糖的工艺方法，这种研究也未见报道。综上所述，本发明的灰树花多糖的生产方法具有鲜明的创新特性。
发明内容
本发明解决前述现有灰树花多糖研究和生产技术中的不足，为了降低生产成本，考虑采用大宗农产品稻谷和小麦等加工的副产品米糠和麸皮作为培养基的碳源和氮源，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，进行液体发酵，以节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，但这需要诱变筛选出在米糠麸皮复合培养基上适宜生长的灰树花菌株和选择适宜的生产工艺方法。因此，为实现上述目的，需要在自然选育之外，通过生物技术手段对灰树花菌株进行诱变，筛选出适宜在米糠麸皮培养基上高产多糖的灰树花菌株，并研究得到适宜于该诱变菌株的发酵工艺方法。
本发明所采取的技术方案如下：利用诱变得到的灰树花菌株，发酵只以米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，生产灰树花多糖按照下述步骤进行：（1）采用植物水解酶对米糠和麸皮进行处理，按34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15-1：25，酶解时间为12-18h；（2）将得到处理液作为培养基用于摇瓶发酵，米糠使用量为3-11g/100mL培养基，麸皮的使用量为3-11g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，装样量40%，接种量10%，培养温度26oC-28 oC，转速150-180r/min，培养时间7-9d；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水清洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白及乙醇沉淀即可得胞内多糖；（5）发酵液离心后的上清液脱蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。其中所述的植物水解酶为Viscozyme L。
在本发明的一个方面中，利用诱变得到的灰树花菌株，在生产型的发酵罐中按照发酵罐80%的容积装入米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，生产灰树花多糖。（1）使用植物水解酶，按34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15-1：25，酶解时间为12-18h对米糠和麸皮进行处理，（2）将得到处理液作为培养基用于在发酵罐中发酵，米糠的使用量为8-11g/100mL培养基，麸皮的使用量为8-11g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，接种量8-10%，培养温度26oC-28 oC，通无菌空气量为1：0.6-1：0.9v/v/min ，搅拌速度为150-180r/min，罐表压为50kPa，培养时间2.5-4d；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水清洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白及乙醇沉淀即可得胞内多糖；（5）发酵液离心后的上清液脱蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。其中所述的植物水解酶为Viscozyme L。
本发明中使用的灰树花菌株JSU10已经于2010年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌株保藏编号为CGMCC No.4179，经鉴定为奇果菌（Grifola sp.）。
本发明的有益效果
本发明采用发明人在同时申请的另一个发明专利中公布的灰树花诱变菌株JSU10，在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上培养生产灰树花多糖，与原始菌株相比产量更高，菌丝干重和菌丝多糖分别提高了39.24%和42.58%。本发明融合三种创新：不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基技术；采用新获得的在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变菌株JSU10作为发酵菌株；得到诱变菌株JSU10在米糠麸皮复合培养基上生长生产灰树花多糖的工艺方法。这三种创新使得本发明具有明显的有益效果，可以降低生产成本，节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，生产出高价值的具有辅助抗肿瘤治疗效果的灰树花多糖。本发明使用了经紫外-微波复合诱变法诱变并筛选出的灰树花新菌株，即具有高生长速率和高多糖产量的突变菌株JSU10，所得菌株适合在米糠和麸皮复合培养基上生长快并高产灰树花多糖，其液体发酵的菌丝干重和多糖较出发菌株分别提高了39.24%和42.58%。灰树花多糖具有辅助抗肿瘤治疗的价值，使得灰树花已经成为一种重要的药用真菌，但灰树花多糖大规模生产依然要面对成本高、产量低等一系列问题。基于此，本发明解决的技术问题是：提供在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的灰树花诱变菌株JSU10发酵生产灰树花多糖的工艺方法。所述工艺方法为灰树花诱变菌株JSU10在米糠麸皮复合培养基上发酵生产灰树花多糖的工艺方法，该方法较现有的其他灰树花多糖的生产方法产生了有益的效果。
具体实施方式
本发明提供一种灰树花菌株变株JSU10（已经同时另行申请专利），可以在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上相对于原有的灰树花菌株具有高生长速率和高多糖产量；该灰树花菌株JSU10已经于2010年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏菌株编号为CGMCC No.4179，经鉴定为奇果菌（Grifola sp.）。本发明提供了采用诱变得到的菌株JSU10生产灰树花多糖的生产工艺方法。
在具体实施方式中，使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：20，酶解时间为15h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵。
实施例一
灰树花菌株采用诱变得到的JSU10菌株。使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按34U/g原料添加酶，固液比采用1：15，酶解时间为12h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为3g/100mL培养基，麸皮的使用量为3g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度26oC，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。得到菌丝干重为0.547g/100mL，胞外多糖为0.036g/100mL培养液，胞内多糖为0.104g/100mL培养液。
实施例二
使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：25，酶解时间为18h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为11g/100mL培养基，麸皮的使用量为11g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28 oC，转速180r/min，培养时间9d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。得到菌丝干重为1.236g/100mL，胞外多糖为0.089g/100mL培养液，胞内多糖为0.187 g/100mL培养液。
实施例三
使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按35FPU/g原料添加酶，固液比采用1：18，酶解时间为14h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为9g/100mL培养基，麸皮的使用量为5g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28 oC，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。得到菌丝干重为0.851g/100mL，胞外多糖为0.07g/100mL培养液，胞内多糖为0.130 g/100mL培养液。
实施例四
使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按35FPU/g原料添加酶，固液比采用1：17，酶解时间为16h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为5g/100mL培养基，麸皮的使用量为4g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，摇瓶的装样量为40%容积，接种量10%，培养温度28 oC，转速150r/min，培养时间7d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。得到菌丝干重为0.547g/100mL，胞外多糖为0.052g/100mL培养液，胞内多糖为0.141 g/100mL培养液。
实施例五
利用诱变得到的灰树花菌株JSU10，在生产型的发酵罐中按照发酵罐80%的容积装入米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，生产灰树花多糖。使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按34FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15，酶解时间为12h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为8g/100mL培养基，麸皮的使用量为8g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，接种量8%，培养温度26oC，通无菌空气量为1：0.6v/v/min ，搅拌速度为150r/min，罐表压为50kPa，培养时间2.5d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。得到菌丝干重为7.0g/L，胞内多糖为0.8g/L培养液。
实施例六
利用诱变得到的灰树花菌株JSU10，在生产型的发酵罐中按照发酵罐80%的容积装入米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，生产灰树花多糖。使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：25，酶解时间为18h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵，米糠的使用量为11g/100mL培养基，麸皮的使用量为11g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，接种量10%，培养温度28 oC，通无菌空气量为1：0.9v/v/min ，搅拌速度为180r/min，罐表压为50kPa，培养时间4d。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。得到菌丝干重为11.5g/L，胞内多糖为1.1g/L培养液。
实施例七
利用诱变得到的灰树花菌株JSU10和诱变前的实验室保存的出发灰树花菌株，在生产型的发酵罐中按照发酵罐80%的容积装入米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，生产灰树花多糖。使用丹麦诺维信公司生产的酶活为1590.41IU/mL(FPU酶活)的植物水解酶Viscozyme L，按36FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15，酶解时间为15h对米糠和麸皮进行处理，得到处理液作为培养基用于发酵。装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28℃，通风量1：0.8v/v/mim，搅拌速度150r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，培养时间4d，发酵培养基为米糠100g/L，麸皮110g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，pH自然。称重法测定菌丝干重，苯酚硫酸法测定菌丝多糖。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3 次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉24h，经离心、冷冻干燥，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。发酵液离心后的上清液适当浓缩到原来的1/5的体积，Sevage法脱蛋白后用3倍体积的95%的乙醇提取胞外多糖，并且在4℃的冰箱中醇析24小时，离心即得到胞外粗多糖的沉淀。将此沉淀物用丙酮、乙醚依次洗涤后，干燥，称量得到胞外多糖的质量。试验结果为：（1）突变菌株JSU10和出发菌株在相同条件和培养基中发酵，菌丝干重分别为10.0g/L和7.21g/L，突变菌株JSU10的菌丝干重较出发菌株提高了39.24%。（2）突变菌株JSU10和出发菌株在相同条件和培养基中发酵，菌丝多糖两者分别为1.02g/L和0.718g/L， 突变菌株JSU10的菌丝多糖较出发菌株提高了42.58%。发酵试验表明，JSU10和原始菌株相比，发酵性能发生了变化。
Claims (4)
1.使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，利用诱变得到的灰树花菌株，发酵只以米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，按照下述步骤进行：（1）采用植物水解酶对米糠和麸皮进行处理，按34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15-1：25，酶解时间为12-18h；（2）将得到处理液作为培养基用于发酵，米糠使用量为3-11g/100mL培养基，麸皮的使用量为3-11g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，装样量40%，接种量10%，培养温度26oC-28 oC，转速150-180r/min，培养时间7-9d；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水清洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白及乙醇沉淀即可得胞内多糖；（5）发酵液离心后的上清液脱蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。
2.使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，其特征在于在利用诱变得到的灰树花菌株，生产型的发酵罐中按照发酵罐80%的容积装入米糠和麸皮复合原料为碳源和氮源的培养基，生产灰树花多糖，按照下述步骤进行：（1）使用植物水解酶，按34-38FPU/g原料添加酶，固液比采用1：15-1：25，酶解时间为12-18h对米糠和麸皮进行处理，（2）将得到处理液作为培养基用于在发酵罐中发酵，米糠的使用量为8-11g/100mL培养基，麸皮的使用量为8-11g/100mL培养基，添加磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75 g/L，pH自然，装样量为发酵罐容积的80%，接种量8-10%，培养温度26oC-28 oC，通无菌空气量为1：0.6-1：0.9v/v/min ，搅拌速度为150-180r/min，罐表压为50kPa，培养时间2.5-4d；（3）将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，用蒸馏水清洗涤，干燥至恒重得菌丝体；（4）将上述菌丝体经常规水提取、脱蛋白及乙醇沉淀即可得胞内多糖；（5）发酵液离心后的上清液脱蛋白后用乙醇沉淀即得到胞外多糖。
3.权利要求1或2所述的使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，其特征在于其中所述的植物水解酶为Viscozyme L。
4.权利要求1或2所述的使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法，其特征在于其中所述的诱变得到的灰树花菌株其菌株保藏编号为CGMCC No.4179。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010579048 CN102080113B (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010579048 CN102080113B (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102080113A true CN102080113A (zh) | 2011-06-01 |
| CN102080113B CN102080113B (zh) | 2013-04-17 |
Family
ID=44086303
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010579048 Expired - Fee Related CN102080113B (zh) | 2010-12-09 | 2010-12-09 | 使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102080113B (zh) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102816806A (zh) * | 2011-06-07 | 2012-12-12 | 江苏大学 | 一种灰树花多糖硒复合物的生产方法 |
| CN102816807A (zh) * | 2011-06-07 | 2012-12-12 | 江苏大学 | 一种灰树花多糖锰复合物的生产方法 |
| CN102816701A (zh) * | 2011-06-07 | 2012-12-12 | 江苏大学 | 用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株 |
| CN105754866A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-07-13 | 江苏大学 | 一株生产灰树花菌丝体的灰树花诱变菌株 |
| CN105754867A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-07-13 | 江苏大学 | 一种生产富硒灰树花菌丝的方法 |
| CN107686818A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-02-13 | 江苏安惠生物科技有限公司 | 一种灰树花多糖产生菌及灰树花多糖制备方法 |
| CN110117602A (zh) * | 2019-01-10 | 2019-08-13 | 江苏大学 | 灰树花udp-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用 |
| CN114402907A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-29 | 江苏大学 | 一种灰树花的栽培方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55150892A (en) * | 1979-05-15 | 1980-11-25 | Nippon Beet Sugar Mfg Co Ltd | New fungus mold, grifora frondosa var tokachiana and method for culturing the same |
| KR20040032478A (ko) * | 2002-10-10 | 2004-04-17 | 한불화장품주식회사 | 신규한 담자균류 그리폴라 프론도사 ｈｂ0071 ｋｃｔｃ10337ｂｐ와 이 균주로부터 생산된 다량의 다당류의제조방법과 이의 용도 |
| CN1880444A (zh) * | 2006-05-15 | 2006-12-20 | 徐泽平 | 灰树花菌株、培养方法及其应用 |
| JP2007224296A (ja) * | 2006-01-27 | 2007-09-06 | Nagaoka Univ Of Technology | 腐朽材からの多糖類取得方法 |
| CN101659707A (zh) * | 2008-08-25 | 2010-03-03 | 徐财泉 | 灰树花子实体或菌丝体d组分多糖的提取分离方法 |
-
2010
- 2010-12-09 CN CN 201010579048 patent/CN102080113B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55150892A (en) * | 1979-05-15 | 1980-11-25 | Nippon Beet Sugar Mfg Co Ltd | New fungus mold, grifora frondosa var tokachiana and method for culturing the same |
| KR20040032478A (ko) * | 2002-10-10 | 2004-04-17 | 한불화장품주식회사 | 신규한 담자균류 그리폴라 프론도사 ｈｂ0071 ｋｃｔｃ10337ｂｐ와 이 균주로부터 생산된 다량의 다당류의제조방법과 이의 용도 |
| JP2007224296A (ja) * | 2006-01-27 | 2007-09-06 | Nagaoka Univ Of Technology | 腐朽材からの多糖類取得方法 |
| CN1880444A (zh) * | 2006-05-15 | 2006-12-20 | 徐泽平 | 灰树花菌株、培养方法及其应用 |
| CN101659707A (zh) * | 2008-08-25 | 2010-03-03 | 徐财泉 | 灰树花子实体或菌丝体d组分多糖的提取分离方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《International Journal of Biological Macromolecules》 20060407 Xiaohua Nie等 Preparation of a chemically sulfated polysaccharide derived from Grifola frondosa and its potential biological activities 228-233 1-4 , * |
| 《Mycoscience》 20001015 Hirotada Kurushima等 Activities of polysaccharides obtained from Grifola frondosa on insulin-dependent diabetes mellitus induced by streptostreptozotoc in mice 473-480 1-4 , * |
| 《中国食品添加剂》 20100630 王艳萍等 液态发酵条件对灰树花产胞外多糖产量的影响 94-98 1-4 , * |
| 《食品与发酵工业》 20090831 袁德云，章克昌 灰树花的液体发酵及其胞内多糖的分离纯化 108-110 1-4 第29卷, 第8期 * |
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102816806A (zh) * | 2011-06-07 | 2012-12-12 | 江苏大学 | 一种灰树花多糖硒复合物的生产方法 |
| CN102816807A (zh) * | 2011-06-07 | 2012-12-12 | 江苏大学 | 一种灰树花多糖锰复合物的生产方法 |
| CN102816701A (zh) * | 2011-06-07 | 2012-12-12 | 江苏大学 | 用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株 |
| CN102816807B (zh) * | 2011-06-07 | 2014-04-09 | 江苏大学 | 一种灰树花多糖锰复合物的生产方法 |
| CN102816806B (zh) * | 2011-06-07 | 2014-05-28 | 江苏大学 | 一种灰树花多糖硒复合物的生产方法 |
| CN102816701B (zh) * | 2011-06-07 | 2014-08-20 | 江苏大学 | 用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株 |
| CN105754866A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-07-13 | 江苏大学 | 一株生产灰树花菌丝体的灰树花诱变菌株 |
| CN105754867A (zh) * | 2015-12-25 | 2016-07-13 | 江苏大学 | 一种生产富硒灰树花菌丝的方法 |
| CN105754866B (zh) * | 2015-12-25 | 2019-04-30 | 江苏大学 | 一株生产灰树花菌丝体的灰树花诱变菌株 |
| CN105754867B (zh) * | 2015-12-25 | 2019-04-30 | 江苏大学 | 一种生产富硒灰树花菌丝的方法 |
| CN107686818A (zh) * | 2017-09-28 | 2018-02-13 | 江苏安惠生物科技有限公司 | 一种灰树花多糖产生菌及灰树花多糖制备方法 |
| CN110117602A (zh) * | 2019-01-10 | 2019-08-13 | 江苏大学 | 灰树花udp-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用 |
| CN110117602B (zh) * | 2019-01-10 | 2023-06-09 | 江苏大学 | 灰树花udp-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用 |
| CN114402907A (zh) * | 2021-12-16 | 2022-04-29 | 江苏大学 | 一种灰树花的栽培方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102080113B (zh) | 2013-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102080113B (zh) | 使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法 | |
| CN103343152B (zh) | 一种灰树花诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法 | |
| CN102796673B (zh) | 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法 | |
| CN102816806B (zh) | 一种灰树花多糖硒复合物的生产方法 | |
| CN102119631B (zh) | 用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株 | |
| CN103477994B (zh) | 用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株 | |
| CN101899398B (zh) | 一种黑曲霉菌株及其应用 | |
| CN104087631B (zh) | 一种深层液态发酵生产樟芝胞外多糖的方法 | |
| CN102816701B (zh) | 用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株 | |
| CN101933439A (zh) | 一种利用植物油提高桑黄液体培养菌丝量的方法 | |
| CN103275875A (zh) | 一种康宁木霉及其复合微生物菌剂组合和用途 | |
| CN110093281B (zh) | 桑黄液体深层发酵培养工艺 | |
| CN104099385A (zh) | 一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法 | |
| CN108795819A (zh) | 一种复合微生物培养物及其在生产类胡萝卜素中的应用 | |
| CN103421861A (zh) | 一种液态发酵米糠麸皮全料生产冬虫夏草多糖的方法 | |
| CN103555786B (zh) | 一种灵芝诱变株液态发酵米糠麸皮全料生产多糖的方法 | |
| Yao et al. | Relationship between saccharifying capacity and isolation sources for strains of the Rhizopus arrhizus complex | |
| CN105441334B (zh) | 产灰树花多糖的菌株及其应用 | |
| CN104762229A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株及其应用 | |
| CN103740675A (zh) | 一种纤维素酶的生产方法 | |
| Berovic et al. | Advances in Production of Medicinal Mushrooms Biomass in Solid State and Submerged Bioreactors | |
| CN108796027A (zh) | 一种生产类胡萝卜素的方法 | |
| CN100390295C (zh) | 一种微生物多糖及其生产方法和应用 | |
| CN110527702B (zh) | 利用诱变获得的桦褐孔菌菌株生产桦褐孔菌多糖的方法 | |
| CN103131583A (zh) | 酯化红曲保健酒的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130417 Termination date: 20141209 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |