CN109957587A - 灰树花液体深层发酵培养及其多糖的提取以及多糖的应用 - Google Patents

灰树花液体深层发酵培养及其多糖的提取以及多糖的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种灰树花液体深层发酵培养及其多糖的提取以及多糖的应用，所述灰树花液体深层发酵培养工艺利用发酵培养液A与发酵培养液C对灰树花菌种进行发酵培养，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达3％‑4％后所得的溶液；所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1‑30:1混合后所得的混合液；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35～40％的溶液。本发明利用双孢蘑菇罐藏加工废水作为灰树花液体深层发酵培养的培养基来源，将双孢蘑菇罐藏加工废水变废为宝。

Description

灰树花液体深层发酵培养及其多糖的提取以及多糖的应用
技术领域
本发明涉及一种灰树花液体深层发酵培养及其多糖的提取以及多糖的应用。
背景技术
灰树花[Grifola frondosa(Dicks.Fr.)S.F.Gray]隶属担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科、树花菌属，又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子菌、云蕈、莲花菌等，日本称之为舞茸，美国称之为林鸡。其肉质脆嫩，味如鸡丝，能烹调成多种美味佳肴，且含有多种生理活性物质，是一种极具开发和研究价值的食、药兼用蕈菌。目前灰树花的人工栽培已初具规模，但传统栽培只能根据自然气候条件选择春、秋两季进行栽培，并且在人工栽培中灰树花不同的生长发育时期对环境中温度、湿度、空气、光照和培养基中的水分、pH要求都比较严苛，而且生产周期较长无法满足市场消费以及深加工的需求。
双孢蘑菇学名为Agaricus bisporus(Lange)Sing,中文别名为蘑菇、洋菇，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，约占世界食用菌总产量的25％左右。由于新鲜的双孢蘑菇储藏期较短，故其国际贸易形式主要以罐藏加工产品为主，而罐藏加工生产时必须及时对鲜菇进行预煮杀青，防止蘑菇开伞，而预煮后的熟菇重量比鲜菇下降35％～40％，损失的重量变成工业废水。在中国，每年用于罐藏加工的双孢蘑菇原料约占双孢蘑菇总产量的80％，也就是说每年约有30％的双孢蘑菇产量变成工业废水而流失，而它是高BOD和COD含量的生产废水，其中COD的含量为540.29g/L，比国家三级排放标准高出13.07倍，直接排放会造成环境污染，而废水处理会增加企业的生产成本。这些废水中含有大量的营养成分，充分利用好蘑菇产业废水，将其被废为宝，具有极其深远的实际意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种成本低、培养周期短、发酵培养液来源广泛且能够充分利用双孢蘑菇加工废水的灰树花液体深层发酵培养工艺。
本发明的目的之二在于提供一种基于所述灰树花液体深层发酵培养工艺的灰树花多糖的制备方法以及灰树花多糖的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种灰树花液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化；
(2)制备灰树花种子悬液；
(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；
(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％-10％，在通气量为1：0.1-1.0vvm，温度为25～30℃，罐压为0.03-0.1MPa下发酵培养2-4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2-4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1-3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1-30:1混合后所得的混合液；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％～40％的溶液。
一种灰树花多糖的制备方法，它包括以下工艺步骤：
(1)灰树花菌种活化；
(2)制备灰树花种子悬液；
(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；
(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％-10％，在通气量为1：0.1-1.0vvm，温度为25～30℃，罐压为0.03-0.1MPa下发酵培养2-4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2-4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1-3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；
(6)对步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行热水浸提，收集浸提液；
(7)将步骤(5)每次放出回收的发酵液以及过滤所得的灰树花菌发酵液与步骤(6)所得浸提液混合后，进行离心，取上清液，将所得的上清液浓缩至折光率达到30％～35％，得浓缩液B；
(8)将浓缩液B进行梯度醇沉，收集沉淀，即得所述灰树花多糖；
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1-30:1混合后所得的混合液；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％～40％的溶液。
由所述灰树花多糖的制备方法制得的灰树花多糖在制备治疗肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、胃癌、乳腺癌药物中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.本发明利用双孢蘑菇罐藏加工废水作为灰树花液体深层发酵培养的培养基来源，将双孢蘑菇罐藏加工废水变废为宝，减轻环境污染、避免水体富营养化，为建设美丽乡村做贡献。
2.与传统栽培方式相比，本发明利用发酵培养液A与发酵培养液C对灰树花进行液体深层发酵培养，具有原料来源广泛、培养周期短、产量高、可进行工厂化生产、有效成分的含量易于控制，无需砍伐木材，从而保护环境等优点。
3.本发明不仅利用了双孢蘑菇罐藏加工废水醇沉过滤后所得的滤液，还利用了双孢蘑菇罐藏加工废水醇沉过滤后的多糖沉淀，做到了对双孢蘑菇罐藏加工废水的充分利用，实现了真正的变废为宝。
4.本发明在灰树花多糖的制备中，采用梯度醇沉的方式对浓缩液B进行多糖提取纯化，能够最大程度的提取并保留浓缩液B中的有效多糖，使得制得的灰树花多糖中多糖含量为80-85％。
5.本发明制得的灰树花多糖对肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、白血病细胞等具有良好的抑制作用，可在制备治疗肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、胃癌、乳腺癌等的药物中应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：
一种灰树花液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25-28℃活化5-7d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200-250rpm，在25-28℃的条件下振荡培养5-7d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将85-95ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的3％-5％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将200-250mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的10％-15％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％-10％，在通气量为1：0.1-1.0vvm，温度为25～30℃，罐压为0.03-0.1MPa下发酵培养2-4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2-4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1-3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.0-6.5。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1-30:1混合后所得的混合液，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节混合液pH值为6.0-6.5；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％～40％的溶液。
双孢蘑菇罐藏加工的工业废水醇沉后形成的沉淀为一些多糖，将这些多糖溶解后与发酵培养液A复配制成的发酵培养液C，能够为灰树花菌发酵培养提供所需的碳源与氮源，以利于灰树花的培养，大大缩短了灰树花培养的周期。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35～55％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％-100％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1:1～2:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.0-6.5，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵培养液A；
本发明利用经灭菌的稀NaOH水溶液或稀HCl调节浓缩后滤液的pH值；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到35～40％，之后将溶解所得的溶液在121-122℃下，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵培养液B。
一种灰树花多糖的制备方法，它包括以下工艺步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25-28℃活化5-7d；所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200-250rpm，在25-28℃的条件下振荡培养5-7d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将85-95ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的3％-5％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将200-250mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的10％-15％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％-10％，在通气量为1：0.1-1.0vvm，温度为25～30℃，罐压为0.03-0.1MPa下发酵培养2-4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2-4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1-3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值始终维持在6.0-6.5。
(6)将步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行细胞破碎，之后加入水，使灰树花菌丝体质量与水体积比为1:2～1:3g/mL，接着在温度为80-85℃的条件下，进行热水浸提7～8h，收集浸提液。
(7)将步骤(5)每次放出回收的发酵液以及过滤所得的灰树花菌发酵液与步骤(6)所得浸提液混合后，进行离心，取上清液，将所得的上清液浓缩至折光率达到30～35％，得浓缩液B；其中，离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-20min；对上清液进行浓缩时选用的浓缩方法为利用降膜蒸发器，降膜蒸发。
(8)将浓缩液B进行梯度醇沉，收集沉淀，即得所述灰树花多糖；步骤(8)的具体操作方法为：
在浓缩液B中，边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到80-85％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到80-85％)，静置5-6h，过滤，收集沉淀A；
在沉淀A中按沉淀A质量与水体积比为1:4～1:5g/mL加入蒸馏水，使沉淀A溶解，之后加入无水乙醇，使含醇量达30％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到30％)，静置1-2h，过滤收集沉淀B与滤液B；
在滤液B中加入无水乙醇，使含醇量达45％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到45％)，静置1-2h，过滤收集沉淀C与滤液C；
在滤液C中加入无水乙醇，使含醇量达60％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到60％)，静置1-2h，过滤收集沉淀D与滤液D；
在滤液D中加入无水乙醇，使含醇量达85％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到85％)，静置1-2h，过滤收集沉淀E；
之后，混合所得的沉淀B、沉淀C、沉淀D以及沉淀E得混合沉淀物，将混合沉淀物在40-45℃干燥，即得所述灰树花多糖。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1-30:1混合后所得的混合液，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节混合液pH值为6.0-6.5；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％～40％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％～55％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％-100％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1:1～2:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.0-6.5，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵培养液A；
本发明利用经灭菌的稀NaOH水溶液或稀HCl调节浓缩后滤液的pH值；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到35～40％，之后将溶解所得的溶液在121-122℃下，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵培养液B。
本发明所用的灰树花菌(GIM 5.63)购自广州微生物菌种保藏中心。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述：
实施例1：
一种灰树花液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25℃活化7d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200rpm，在25℃的条件下振荡培养7d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将85ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的3％，接种之后在25℃，转速为150rpm，持续培养5d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将200mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的10％，接种之后在25℃，转速为150rpm，持续培养5d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％，在通气量为1：0.1vvm，温度为25℃，罐压为0.03MPa下发酵培养4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.0。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1混合后所得的混合液，调节混合液pH值为6.0；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.0，再经121℃，湿热灭菌20min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到35％，之后将溶解所得的溶液在121℃下，湿热灭菌20min后，得所述发酵培养液B。
实施例2：
一种灰树花液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在28℃活化6d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为250rpm，在28℃的条件下振荡培养6d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将90mL发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的4％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养7d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将220mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的12％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的10％，在通气量为1：0.5vvm，温度为28℃，罐压为0.05MPa下发酵培养3天，之后放出并回收占发酵罐容积的25％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵3天，接着再放出并回收占发酵罐容积的25％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵2天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，根据实际情况利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.2。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达2％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为25:1混合后所得的混合液，调节混合液pH值为6.2；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达38％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到45％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入100％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1.5:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达2％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.2，再经121℃，湿热灭菌15min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到38％，之后将溶解所得的溶液在121℃下，湿热灭菌15min后，得所述发酵培养液B。
实施例3:
一种灰树花液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在26℃活化5d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为220rpm，在26℃的条件下振荡培养5d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将95ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的5％，接种之后在30℃，转速为200rpm，持续培养6d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将250mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的15％，接种之后在30℃，转速为200rpm，持续培养6d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2.5L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的9％，在通气量为1：1.0vvm，温度为30℃，罐压为0.1MPa下发酵培养2天，之后放出并回收占发酵罐容积的30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2天，接着再放出并回收占发酵罐容积的30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，根据实际情况利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.5。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为30:1混合后所得的混合液，调节混合液pH值为6.5；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达40％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为2:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达3％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.5，再经122℃，湿热灭菌10min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到40％，之后将溶解所得的溶液在122℃下，湿热灭菌10min后，得所述发酵培养液B。
实施例4：
一种灰树花多糖的制备方法，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25℃活化7d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200rpm，在25℃的条件下振荡培养7d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将85ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的3％，接种之后在25℃，转速为150rpm，持续培养5d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将200mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的10％，接种之后在25℃，转速为150rpm，持续培养5d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％，在通气量为1：0.1vvm，温度为25℃，罐压为0.03MPa下发酵培养4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.0。
(6)将步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行细胞破碎，之后加入水，使灰树花菌丝体质量与水体积比为1:2g/mL，接着在温度为80℃的条件下，进行热水浸提8h，收集浸提液。
(7)将步骤(5)每次放出回收的发酵液以及过滤所得的灰树花菌发酵液与步骤(6)所得浸提液混合后，进行离心，取上清液，将所得的上清液浓缩至折光率达到30％，得浓缩液B；其中，离心时，离心机的转速控制在11500rpm之间，离心温度为15℃，离心时间为20min；对上清液进行浓缩时选用的浓缩方法为利用降膜蒸发器，降膜蒸发。
(8)将浓缩液B进行梯度醇沉，收集沉淀，即得所述灰树花多糖；步骤(8)的具体操作方法为：
在浓缩液B中，边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到80％，静置5h，过滤，收集沉淀A；
在沉淀A中按沉淀A质量与水体积比为1:4g/mL加入蒸馏水，使沉淀A溶解，之后加入无水乙醇，使含醇量达30％，静置1h，过滤收集沉淀B与滤液B；
在滤液B中加入无水乙醇，使含醇量达45％，静置1h，过滤收集沉淀C与滤液C；
在滤液C中加入无水乙醇，使含醇量达60％，静置1h，过滤收集沉淀D与滤液D；
在滤液D中加入无水乙醇，使含醇量达85％，静置1h，过滤收集沉淀E；
之后，混合所得的沉淀B、沉淀C、沉淀D以及沉淀E得混合沉淀物，将混合沉淀物在40℃干燥，即得所述灰树花多糖。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1混合后所得的混合液，调节混合液pH值为6.0；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.0，再经121℃，湿热灭菌20min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到35％，之后将溶解所得的溶液在121℃下，湿热灭菌20min后，得所述发酵培养液B。
实施例5：
一种灰树花多糖的制备方法，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在28℃活化6d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为250rpm，在28℃的条件下振荡培养6d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将90mL发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的4％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养7d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将220mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的12％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的10％，在通气量为1：0.5vvm，温度为28℃，罐压为0.05MPa下发酵培养3天，之后放出并回收占发酵罐容积的25％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵3天，接着再放出并回收占发酵罐容积的25％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵2天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，根据实际情况利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.2。
(6)将步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行细胞破碎，之后加入水，使灰树花菌丝体质量与水体积比为1:2.5g/mL，接着在温度为82℃的条件下，进行热水浸提7.5h，收集浸提液。
(7)将步骤(5)每次放出回收的发酵液以及过滤所得的灰树花菌发酵液与步骤(6)所得浸提液混合后，进行离心，取上清液，将所得的上清液浓缩至折光率达到32％，得浓缩液B；其中，离心时，离心机的转速控制在12000rpm之间，离心温度为20℃，离心时间为15min对上清液进行浓缩时选用的浓缩方法为利用降膜蒸发器，降膜蒸发。
(8)将浓缩液B进行梯度醇沉，收集沉淀，即得所述灰树花多糖；步骤(8)的具体操作方法为：
在浓缩液B中，边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到82％，静置5.5h，过滤，收集沉淀A；
在沉淀A中按沉淀A质量与水体积比为1:5g/mL加入蒸馏水，使沉淀A溶解，之后加入无水乙醇，使含醇量达30％，静置1.5h，过滤收集沉淀B与滤液B；
在滤液B中加入无水乙醇，使含醇量达45％，静置1..5h，过滤收集沉淀C与滤液C；
在滤液C中加入无水乙醇，使含醇量达60％，静置1.5h，过滤收集沉淀D与滤液D；
在滤液D中加入无水乙醇，使含醇量达85％，静置1.5h，过滤收集沉淀E；
之后，混合所得的沉淀B、沉淀C、沉淀D以及沉淀E得混合沉淀物，将混合沉淀物在42℃干燥，即得所述灰树花多糖。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达2％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为25:1混合后所得的混合液，调节混合液pH值为6.2；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达38％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到45％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入100％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1.5:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达2％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.2，再经121℃，湿热灭菌15min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到38％，之后将溶解所得的溶液在121℃下，湿热灭菌15min后，得所述发酵培养液B。
实施例6:
一种灰树花多糖的制备方法，它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在26℃活化5d；
所述PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备灰树花种子悬液；用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为220rpm，在26℃的条件下振荡培养5d，得所述灰树花种子悬液。
所述PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将95ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的5％，接种之后在30℃，转速为200rpm，持续培养6d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将250mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的15％，接种之后在30℃，转速为200rpm，持续培养6d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2.5L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的9％，在通气量为1：1.0vvm，温度为30℃，罐压为0.1MPa下发酵培养2天，之后放出并回收占发酵罐容积的30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2天，接着再放出并回收占发酵罐容积的30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；整个发酵过程中，根据实际情况利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.5。
(6)将步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行细胞破碎，之后加入水，使灰树花菌丝体质量与水体积比为1:3g/mL，接着在温度为85℃的条件下，进行热水浸提7h，收集浸提液。
(7)将步骤(5)每次放出回收的发酵液以及过滤所得的灰树花菌发酵液与步骤(6)所得浸提液混合后，进行离心，取上清液，将所得的上清液浓缩至折光率达到35％，得浓缩液B；其中，离心时，离心机的转速控制在12500rpm之间，离心温度为25℃，离心时间为10min对上清液进行浓缩时选用的浓缩方法为利用降膜蒸发器，降膜蒸发。
(8)将浓缩液B进行梯度醇沉，收集沉淀，即得所述灰树花多糖；步骤(8)的具体操作方法为：
在浓缩液B中，边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到85％，静置6h，过滤，收集沉淀A；
在沉淀A中按沉淀A质量与水体积比为1:4.5g/mL加入蒸馏水，使沉淀A溶解，之后加入无水乙醇，使含醇量达30％，静置2h，过滤收集沉淀B与滤液B；
在滤液B中加入无水乙醇，使含醇量达45％，静置2h，过滤收集沉淀C与滤液C；
在滤液C中加入无水乙醇，使含醇量达60％，静置2h，过滤收集沉淀D与滤液D；
在滤液D中加入无水乙醇，使含醇量达85％，静置2h，过滤收集沉淀E；
之后，混合所得的沉淀B、沉淀C、沉淀D以及沉淀E得混合沉淀物，将混合沉淀物在45℃干燥，即得所述灰树花多糖。
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为30:1混合后所得的混合液，调节混合液pH值为6.5；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达40％的溶液。
所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为2:1；
e.将将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达3％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.5，再经122℃，湿热灭菌10min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到40％，之后将溶解所得的溶液在122℃下，湿热灭菌10min后，得所述发酵培养液B。
实施例7：灰树花多糖体外抗肿瘤实验：
(1)实验药物：灰树花多糖，为本发明实施例5所得。设定的浓度为521μg/mL，256μg/mL，128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL(本发明灰树花剂量或浓度均以多糖质量计算)；
(2)试剂与仪器：DMEM培养基、二甲基亚砜DMSO、青霉素、链霉素、小牛血清(FCS)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑基(MTT)；CO2恒温培养箱；Bio-Rad680型酶标仪；对数生长期的四种细胞：肝癌细胞hep-6、胃癌细胞MGC80-3、白血病细胞Molt-4、乳腺癌细胞MCF-7。
(3)实验过程：取四种对数生长期的细胞按1×105细胞密度接种于96孔板中，培养过夜，更换无血清培养基；将制备所得的灰树花多糖稀释至不同浓度(521μg/mL，256μg/mL，128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL)；加入过夜培养的细胞中，同时设立空白对照组；震摇混合均匀，置于37℃5％浓度的CO2恒温培养箱中培养，48小时后，每孔添加MTT(5mg/mL)20μL，置于37℃5％浓度的CO2恒温培养箱中继续培养4小时，弃上清(培养液)，每孔加入100μL的DMSO，样品震摇15min，用酶标仪于570nm处测定吸光值(OD)；实验重复三次。细胞抑制率(Cell Vability)(％)＝(OD对照组-OD实验组)/(OD对照组-OD空白组)×100％。实验结果如表1所示：
表1灰树花多糖对各细胞的抑制率(％)
浓度(μg/mL) hep-6 MGC80-3 Molt-4 MCF-7
8 2.31±0.41 7.74±0.38 3.35±0.23 4.21±0.21
16 5.11±0.25 10.33±0.87 7.32±0.32 6.37±0.91
32 9.03±0.23 16.09±2.11 10.16±1.21 11.21±0.32
64 12.1±1.021 21.13±3.24 17.98±2.27 15.02±2.11
128 17.32±3.22 31.24±5.10 21.33±1.71 20.13±2.05
256 23.03±3.37 35.79±4.21 31.27±4.15 21.21±2.32
521 35.17±5.34 41.05±3.26 32.07±4.43 24.31±4.23
由表1可知，本发明灰树花多糖不同浓度作用于四种癌细胞48小时后，各种癌细胞的生长均受到不同程度的抑制，并且，随着灰树花多糖浓度的增加，细胞生长抑制率也逐渐增加，呈现出较好的量效关系，尤其是对胃癌细胞MGC80-3的抑制率在512μg/mL时达到41.05±3.26。因此，灰树花多糖对处于对数生长期的四种细胞肝癌细胞hep-6、胃癌细胞MGC80-3、白血病细胞Molt-4、乳腺癌细胞MCF-7均有较好的抗肿瘤活性，尤其适合对抗胃癌细胞。
需要说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种灰树花液体深层发酵培养工艺，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)灰树花菌种活化；
(2)制备灰树花种子悬液；
(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；
(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％-10％，在通气量为1：0.1-1.0vvm，温度为25～30℃，罐压为0.03-0.1MPa下发酵培养2-4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2-4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1-3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及灰树花菌丝体；
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1-30:1混合后所得的混合液；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％～40％的溶液。
2.根据权利要求1所述的灰树花液体深层发酵培养工艺，其特征在于：所述发酵培养液A与发酵培养液B的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35％～55％，得浓缩液A；
d.在浓缩液A中加入95％-100％的乙醇进行醇沉，之后过滤回收醇沉后所得的沉淀并收集滤液；其中，醇沉时加入乙醇的体积与浓缩液A的体积比为1:1～2:1；
e.将步骤d收集的滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％，然后将浓缩后的滤液pH调节至6.0-6.5，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵培养液A；
f.将步骤d回收的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到35～40％，之后将溶解所得的溶液在121-122℃下，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵培养液B。
3.根据权利要求1所述的灰树花液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(1)的具体方法为：将保存的灰树花菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25-28℃活化5-7d。
4.根据权利要求1所述的灰树花液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(2)的具体方法为：用接种针勾取0.5cm2大小的活化后的灰树花菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，接种5～6次，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200-250rpm，在25-28℃的条件下振荡培养5-7d，得所述灰树花种子悬液。
5.根据权利要求1所述的灰树花液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(3)的具体方法为：将85-95ml发酵培养液A置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的3％-5％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得一级液体菌种。
6.根据权利要求1所述的灰树花液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(4)的具体方法为：将200-250mL发酵培养液A置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为三角瓶中发酵培养液A体积的10％-15％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得二级液体菌种。
7.一种灰树花多糖的制备方法，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
(1)灰树花菌种活化；
(2)制备灰树花种子悬液；
(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的灰树花种子悬液接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；
(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养液A的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养液C，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为发酵罐中发酵培养液C体积的8％-10％，在通气量为1：0.1-1.0vvm，温度为25～30℃，罐压为0.03-0.1MPa下发酵培养2-4天，之后放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，继续发酵2-4天，接着再放出并回收占发酵罐容积的20％-30％的发酵液，补入等同体积的发酵培养液A，再发酵1-3天后放罐，发酵醪经过滤，得灰树花菌发酵液以及所述灰树花菌丝体；
(6)对步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行热水浸提，收集浸提液；
(7)将步骤(5)每次放出回收的发酵液以及过滤所得的灰树花菌发酵液与步骤(6)所得浸提液混合后，进行离心，取上清液，将所得的上清液浓缩至折光率达到30％～35％，得浓缩液B；
(8)将浓缩液B进行梯度醇沉，收集沉淀，即得所述灰树花多糖；
其中，所述发酵培养液A为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集滤液、滤液浓缩至滤液中可溶性固形物浓度达1％-3％后所得的溶液；
所述发酵培养液C为发酵培养液A与发酵培养液B按体积比为20:1-30:1混合后所得的混合液；所述发酵培养液B为双孢蘑菇罐藏加工废水依次经浓缩、醇沉、过滤收集沉淀、沉淀溶于水形成的折光率达35％～40％的溶液。
8.根据权利要求7所述的灰树花多糖的制备方法，其特征在于：步骤(6)的具体操作方法为：将步骤(5)所得的灰树花菌丝体进行细胞破碎，之后加入水，使灰树花菌丝体质量与水体积比为1:2～1:3g/mL，接着在温度为80-85℃的条件下，进行热水浸提7～8h，收集浸提液。
9.根据权利要求7所述的灰树花多糖的制备方法，其特征在于：步骤(8)的具体操作方法为：
在浓缩液B中，边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到80-85％，静置5-6h，过滤，收集沉淀A；
在沉淀A中按沉淀A质量与水体积比为1:4～1:5g/mL加入蒸馏水，使沉淀A溶解，之后加入无水乙醇，是含醇量达30％，静置1-2h，过滤收集沉淀B与滤液B；
在滤液B中加入无水乙醇，是含醇量达45％，静置1-2h，过滤收集沉淀C与滤液C；
在滤液C中加入无水乙醇，是含醇量达60％，静置1-2h，过滤收集沉淀D与滤液D；
在滤液D中加入无水乙醇，是含醇量达85％，静置1-2h，过滤收集沉淀E；
之后，混合所得的沉淀B、沉淀C、沉淀D以及沉淀E得混合沉淀物，将混合沉淀物在40-45℃干燥，即得所述灰树花多糖。
10.权利要求7-9所述的制备方法制得的灰树花多糖在制备治疗肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、胃癌、乳腺癌药物中的应用。
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