CN103305430B - 一株产漆酶齿毛菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产漆酶齿毛菌及其应用。该产漆酶齿毛菌为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7713。实验证明，本发明的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在PD培养基中，25℃、180rpm（旋转半径20mm）振荡培养6d，每毫升发酵液的漆酶活性是965.42±13.71U，每mg（湿重）菌丝体的漆酶活性是2822.71±312.33U。
Description
技术领域
本发明涉及一株产漆酶齿毛菌及其应用。
背景技术
白腐菌属于担子菌门(Basidiomycota)，具有其特有的木质素降解酶系，因其腐生在木材或树木，致使木质变白腐烂而得此名。目前，已研究最多的白腐菌有：彩绒革盖菌(Coliolus versicolor)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、变色栓菌(Trametes versicolor)、射脉菌(Phlebia radiata)、朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)、凤尾菇(Pleurotus pulm onarius)、杂色云芝(Trametes versicolor)、糙皮侧耳(Pleurotus)等。白腐菌所分泌的木质素降解酶主要有3种，即木质素过氧化酶、锰过氧化物酶和漆酶。
漆酶(Laccase，简称Lac)是一种含铜的多酚氧化物，人们在最早在漆树的分泌物中发现，其后又相继在一些高等真菌、植物、昆虫和细菌中发现这种酶。利用漆酶可以降解氯酚类的有机化合物，缓解因过度使用含氯的芳香类化合物农药对环境造成了严重污染与破坏；产漆酶菌对染料具有较强的脱色能力，这类真菌通过自身分泌的酶系能够将多种人工染料彻底的降解成为CO2和H2O；漆酶能对纸浆进行漂白，避免了利用氯气进行漂白时有毒化合物的释放，降低环境的污染程度；另外，在纸浆的生产工艺中也可用到漆酶。采用漆酶选择性的降解木质素生产纸浆，不仅能够节约设备和能耗，使得纸浆的生产周期缩短，从而降低生产成本，这样将会给造纸工业带来不错的经济效益和社会效益；在食品生产工艺中，漆酶主要用于饮料的色泽与澄清度的控制，多酚类物质能够被氧化成多酚氧化物，从而使其发生聚合，形成的大颗粒能够被滤膜截留，以达到使饮料净化的目的。利用这一反应的强专一性，污染指数低，得到澄清的果汁色泽浅，并且稳定等优点，可以很好的解决果汁加工中的二次浑浊问题。
漆酶的应用前景非常广阔。随着科学研究的不断发展,人们能够对白腐类真菌产酶的机理、酶活性中心及作用机理都会有更多的了解。但仍存在不少问题，如菌株合成漆酶水平偏低，菌体生长较慢,酶催化效率低，不适于工业化生产等。因此，加强生物、化工、食品、农业等多学科交叉研究开发漆酶高表达菌株，探索漆酶合成代谢的影响因子及其作用规律，开拓漆酶新的应用领域和应用途径,必将具有深远的科学意义和巨大的经济效益。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一株产漆酶能力较强的一色齿毛菌。
本发明所提供的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)的菌株号为GSM-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.7713。
将上述一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的菌丝固定在固体载体上得到的固定化真菌菌丝也属于本发明的保护范围。
上述固定化真菌菌丝中，所述固体载体可为木屑、棉籽壳等含木质素的固体物质。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种生产一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝的方法。
本发明所提供的生产一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713菌丝的方法，包括将一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713在含有碳源、氮源和生长因子的培养基中培养的步骤；所述碳源为麦芽糖、淀粉或葡萄糖，所述氮源为酵母提取物或大豆蛋白胨，所述生长因子为维生素B1或维生素C。
上述生产方法中，所述培养基的碳氮比为10：1-20：1。
上述生产方法中，每升所述培养基可按照如下方法配制：含碳量为8g的所述碳源，大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2；所述培养采用的培养温度为25℃。
上述生产方法中，每升所述培养基还可按照如下方法配制：葡萄糖20g，含氮量为0.4g的所述氮源，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2；所述培养采用的培养温度为25℃。
上述生产方法中，每升所述培养基还可按照如下方法配制：葡萄糖20g，大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，所述生长因子10mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2；所述培养采用的培养温度为25℃。
本发明的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)可用于发酵生产漆酶。
本发明提供了一种利用一色齿毛菌(Cerrena unicolor)发酵生产漆酶的方法。
本发明所提供的发酵生产漆酶的方法，包括在液体培养基中培养一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713，收集发酵液或/和菌丝体的步骤。
上述发酵生产漆酶的方法中，所述培养采用的培养温度可为25℃-36℃，如25℃；培养时间可为48-144小时，如144小时。
实验证明，本发明的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在PD培养基中，25℃、180rpm（旋转半径20mm）振荡培养6d，每毫升发酵液的漆酶活性是965.42±13.71U，每mg（湿重）菌丝体的漆酶活性是2822.71±312.33U；一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在1.0mmol/LCu2+培养基（1.0mmol/L Cu2+培养基是向PD培养基中加入1.0mol/L CuSO4溶液至Cu2+终浓度为1.0mmol/L得到的液体）中在25℃发酵192h的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的胞外漆酶产量为2855.00±41.63U/mL发酵液。
生物材料信息
分类命名：一色齿毛菌(Cerrena unicolor)
菌株编号：GSM-01
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年06月05日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7713
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为Cu2+对液体发酵一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713漆酶产量的影响。
图2为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在不同碳源的培养基培养5天的平板照片。
图3为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在不同氮源的培养基培养5天的平板照片。
图4为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在不同碳氮比的培养基培养10天的平板照片。
图5为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在不同生长因子的培养基培养5天的平板照片。
图6为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在不同温度培养3天的平板照片。
图7为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在不同pH培养4天的平板照片。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如下：
PDA培养基
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH值7.0-7.2，用蒸馏水定容至1000mL。将马铃薯去皮，切成小块，放入1000ml水中煮沸30min，四层纱布过滤，收集滤液。溶入葡萄糖及琼脂，补水至1000ml，pH值7.0-7.2。121℃湿热灭菌30min。主要用于菌种分离与保藏。
PD培养基
马铃薯200g，葡萄糖20g，pH值7.0-7.2，用蒸馏水定容至1000mL。马铃薯去皮，切小块，放入1000ml左右水中煮沸30min，四层纱布过滤，收集滤液。溶入葡萄糖，补水至1000ml，pH值7.0-7.2。121℃湿热灭菌30min。主要用于菌丝体液体发酵培养实验。
基础培养基
葡萄糖20g，大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，pH值7.0-7.2，用蒸馏水定容至l000mL。将试剂配制成溶液。121℃湿热灭菌30min。主要用于菌丝体最佳培养条件实验。其中，20g葡萄糖的含碳量为8g，2g大豆蛋白胨的含氮量为0.4g，碳氮比为20:1。
加富培养基
葡萄糖20g，大豆蛋白胨2g，马铃薯200g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，维生素B110mg，琼脂20g，pH值7.0-7.2，用蒸馏水定容至l000mL。马铃薯去皮，切小块，放入1000mL左右水中煮沸30min，四层纱布过滤，收集滤液。溶入葡萄糖、大豆蛋白胨等其他溶液，补水至1000mL，pH值7.0-7.2。121℃湿热灭菌30min。主要用于菌丝体最佳培养条件实验。
实施例1、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的分离及鉴定
1、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的分离
采取北京农学院2、3号办公楼间绿化植物小蜡(Ligustrum sinense)树干上的真菌子实体，利用组织分离获得2株纯培养菌株，编号分别为GSM-01和GSM-10。
2、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的鉴定
分别以菌株GSM-01和GSM-10的基因组DNA为模板，用ITS1(5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3')和ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3')PCR扩增ITS序列，菌株GSM-01扩增到的的ITS序列如SEQ ID No.1，菌株GSM-10扩增到的的ITS序列如SEQ ID No.2。菌株GSM-01与GSM-10的一致性为98.26%。
菌株GSM-01和GSM-10的子实体形态特征均如下：子实体较小、覆瓦状排列，菌盖直径4-8cm，厚约0.5cm，扇形、贝壳状或平伏至反卷，革质，新鲜是表面白色，成熟后转为黄白色。
菌株GSM-01和GSM-10的形态特征均如下：菌丝洁白、浓密，试管培养时产生丰富的白色气生菌丝，菌体老化后呈浅黄色。
根据子实体形态和分子鉴定特征将菌株GSM-01和GSM-10均鉴定为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)。菌株GSM-01已于2013年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7713。下文将该菌株称为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713。菌株GSM-10的ITS序列已于2012年06月11日提交GenBank核酸序列数据库，其GenBank Accession Number JQ798288。下文中将该菌株称为一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10。
实施例2、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713和一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10液体发酵产酶特性研究
1、液体发酵
将一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713和一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10分别单独接种于PD培养基中，25℃、180rpm（旋转半径20mm）振荡培养5d，作为种子液；以5%(v/v)接种量接种内容100mlPD培养基的容积为500ml的三角瓶中，25℃、180rpm（旋转半径20mm）振荡培养6d，4℃下12000rpm离心15min，收集沉淀得到菌丝体，收集上清液得到发酵液，将得到的菌丝体进行研磨成匀浆备用。分别得到一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝体、一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)GSM-01CGMCC No.7713发酵液，一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10菌丝体和一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10发酵液，分别作为漆酶活性待测样品。上述实验重复3次，每次重复采用100ml PD培养基进行发酵。
2、漆酶活性测定
将步骤1得到的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝体和发酵液，一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10菌丝体和发酵液分别按照下述方法进行漆酶活性测定：
漆酶活性采用ABTS法。以ABTS作为反应底物。反应体系为150μl，包括5μl待测样品和145μL2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）溶液（0.5mg/ml,以10mM pH4.6的醋酸钠缓冲溶液配制）。对照管使用经预先灭活的样品代替待测样品，其余条件相同。37℃水浴反应5min，立即测420nm处的吸光值。酶活性定义：每min催化1μmol ABTS所需要酶量定义为1个酶活力单位(U)。
实验结果如表1所示，表明一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713每毫升发酵液的漆酶活性是965.42±13.71U，每mg（湿重）菌丝体的漆酶活性是2822.71±312.33U；一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10每毫升发酵液的漆酶活性是792.50±32.27U，每mg（湿重）菌丝体的漆酶活性是2142.87±196.20U。说明一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713的产漆酶能力是一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10的1.22倍。因此选择一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713进行发酵条件的研究和生长特性的研究。
表1.一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713和一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-10产漆酶能力
实施例3、液体发酵一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713产漆酶
本实施例测试了五种液体发酵培养基，分别为0mmol/L Cu2+培养基、1.0mmol/L Cu2+培养基、2.0mmol/L Cu2+培养基、5.0mmol/L Cu2+培养基和10mmol/LCu2+培养基。0mmol/L Cu2+培养基是PD培养基。1.0mmol/L Cu2+培养基是向PD培养基中加入1.0mol/L CuSO4溶液至Cu2+终浓度为1.0mmol/L得到的液体。2.0mmol/L Cu2+培养基是向PD培养基中加入1.0mol/L CuSO4溶液至Cu2+终浓度为2.0mmol/L得到的液体。5.0mmol/L Cu2+培养基是向PD培养基中加入1.0mol/LCuSO4溶液至Cu2+终浓度为5.0mmol/L得到的液体。10mmol/L Cu2+培养基是向PD培养基中加入1.0mol/L CuSO4溶液至Cu2+终浓度为10mmol/L得到的液体。
将一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713接种于PD培养基中，25℃、180rpm（旋转半径20mm）振荡培养5d，作为种子液。以5%(v/v)接种量分别接入内容100ml的0mmol/L Cu2+培养基、1.0mmol/L Cu2+培养基、2.0mmol/L Cu2+培养基、5.0mmol/L Cu2+培养基和10mmol/L Cu2+培养基的容积为500ml三角瓶中。在25℃、180rpm（旋转半径20mm）振荡培养进行液体发酵。在接种第48、96、144和192h，每种培养基各取3瓶发酵培养物，4℃下12000rpm离心15min，收集上清液得到发酵液，按照实施例2的方法测定发酵液的漆酶活性。实验设三次重复。
结果如图1所示，表明1.0mmol/L-2.0mmol/L的Cu2+提高了一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的胞外漆酶产量，10mmol/L的Cu2+极大的降低了一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的胞外漆酶产量。其中，发酵48-192h，1.0mmol/L Cu2+显著提高了一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)GSM-01CGMCC No.7713的胞外漆酶产量，发酵192h的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713的胞外漆酶产量为2855.00±41.63U/mL发酵液，为同时刻未加Cu2+的PD培养基发酵液酶活（673.61±18.49U/mL发酵液）的4.24倍。一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在未加Cu2+的PD培养基中发酵144h的胞外漆酶产量最高，为965.42±13.71U/mL发酵液。
实施例4、一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713固体培养条件优化
1、试验材料
培养基：PDA培养基、PD培养基、基础培养基、加富培养基，组成同上。
2、试验试剂与仪器
（1）试验试剂
葡萄糖，琼脂，蒸馏水，大豆蛋白胨，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1，蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、山梨醇、甘露醇和羧甲基纤维素钠，酵母浸粉、牛肉浸膏、硝酸铵、硫酸铵、尿素、黄豆粉和甘氨酸。
（2）试验仪器
3、试验方法
（1）菌种的保藏与培养
以无菌操作将一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713接种于平板PDA培养基中央，25℃恒温培养箱中培养。将得到的菌丝接种于斜面PDA培养基中，长满后4℃下避光保藏备用。
（2）不同碳源对菌丝生长速度的影响
实验设9种处理，分别是上述基础培养基、分别用等量含碳量（8g）的蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、山梨醇、甘露醇和羧甲基纤维素钠，代替上述基础培养基中的葡萄糖，以不加碳源的基础培养基(大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2)作为对照（CK）。每处理5次重复。
各处理灭菌倒入培养皿（直径均为9cm）后，在各平板（厚度约为5mm）中央接种直径为5mm的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌落一块，25℃恒温培养箱中避光培养，观测菌丝生长量(菌落直径)和长势情况，计算菌丝体日均生长速度[菌丝生长速度=菌落半径增长度(mm)÷培养天数(d)]。待长势最快一组长满平板时，停止培养，回收各处理菌丝体，测定菌丝体干重。其中，长势最快一组的培养时间为5天。
结果表明麦芽糖和葡萄糖对一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713菌丝生长有利，一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在以葡萄糖为碳源培养基上菌丝生长最快(10.7±0.5mm/d)，以乳糖为碳源培养基上菌丝生长最慢(3.8±0.6mm/d)，以麦芽糖为碳源培养基上干重最高(57.6±6.0mg/皿)，说明一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCCNo.7713菌丝培养的最适碳源为麦芽糖（表2和图2）。
表2.不同碳源对菌丝生长的影响
表2中，+表示生长稀疏，++表示生长较致密，+++表示生长致密。同列中不同小写字母表示在5%水平差异显著，不同大写字母表示在1%水平差异显著。本实施例下表同。
（3）不同氮源对菌丝生长速度的影响
实验设9种处理，分别是上述基础培养基、分别用等量含氮量（0.4g）的酵母浸粉、牛肉浸膏、硝酸铵、硫酸铵、尿素、黄豆粉和甘氨酸，代替上述基础培养基中的大豆蛋白胨，以不加氮源的基础培养基(葡萄糖20g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2)作为对照（CK）。每处理5次重复。
各处理灭菌倒入培养皿（直径均为9cm）后，在各平板（厚度约为5mm）中央接种直径为5mm的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌落一块，25℃恒温培养箱中避光培养，观测菌丝生长量(菌落直径)和长势情况，计算菌丝体日均生长速度[菌丝生长速度=菌落半径增长度(mm)÷培养天数(d)]。待长势最快一组长满平板时，停止培养，回收各处理菌丝体，测定菌丝体干重。其中，长势最快一组的培养时间为5天。
结果表明大豆蛋白胨和酵母浸膏对一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713生长有利，一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713在以大豆蛋白胨为氮源的培养基上菌丝生长最快(8.8±0.3mm/d)，以甘氨酸为氮源的培养基上菌丝生长最慢(4.0±0.2mm/d)，以酵母浸膏为氮源的培养基上干重最高(30.5±1.6mg/皿)。说明一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝培养的最适氮源为酵母浸膏，其次为大豆蛋白胨（表3和图3）。
表3不同氮源对菌丝生长的影响
（4）不同C/N对菌丝生长的影响
以麦芽糖替代上述基础培养基的葡萄糖，使麦芽糖含量为20g/L，并将上述基础培养基中的大豆蛋白胨用不同质量的酵母浸膏替代，配制成C/N比分别为10/1、20/1、30/1、40/1、50/1和60/1的不同培养基，pH值7.0-7.2，每处理5次重复。
各处理灭菌倒入培养皿（直径均为9cm）后，在各平板（厚度约为5mm）中央接种直径为5mm的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌落一块，25℃恒温培养箱中避光培养，观测菌丝生长量(菌落直径)和长势情况，计算菌丝体日均生长速度[菌丝生长速度=菌落半径增长度(mm)÷培养天数(d)]。待长势最快一组长满平板时，停止培养，回收各处理菌丝体，测定菌丝体干重。其中，长势最快一组的培养时间为10天。
结果表明C/N为20/1、40/1、10/1对一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝生长有利，碳氮比为20/1的培养基上菌丝生长最快(4.0±0.0mm/d)，碳氮比为60/1的培养基上菌丝生长最慢(3.8±0.0mm/d)，碳氮比为10/1的培养基上干重最高(38.3±1.1mg)，碳氮比为60/1的培养基上干重最低(分别为20.4±0.8mg)（表4和图4）。说明一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝培养的最适C/N比为10/1，其次为20/1。
表4不同C/N比对菌丝生长的影响
（5）不同生长因子对菌丝生长的影响
采用基础培养基，分别用维生素B2(10mg)、维生素B6(10mg)、维生素C(10mg)、玉米浆(10mg)、肌醇(10mg)替换基础培养基中的维生素B1(10mg)，以不加生长因子为对照(CK)，每处理5次重复。
各处理灭菌倒入培养皿（直径均为9cm）后，在各平板（厚度约为5mm）中央接种直径为5mm的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌落一块，25℃恒温培养箱中避光培养，观测菌丝生长量(菌落直径)和长势情况，计算菌丝体日均生长速度[菌丝生长速度=菌落半径增长度(mm)÷培养天数(d)]。待长势最快一组长满平板时，停止培养，回收各处理菌丝体，测定菌丝体干重。其中，长势最快一组的培养时间为5天。
结果表明以维生素B6为生长因子的培养基上菌丝生长最快(8.9±0.1mm/d)，以肌醇为生长因子的培养基上菌丝生长最慢(8.6±0.1mm/d)，以维生素B1为生长因子的培养基上干重最高(37.2±6.1mg)，以维生素B6为生长因子的培养基上干重最低(24.7±3.6mg)（表5和图5）。综合生长速率和菌丝干重指标，一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝培养的最适生长因子为维生素B1，其次为维生素C。
表5不同生长因子对菌丝生长的影响
（6）不同温度对菌丝生长速度的影响
分别用上述试验中最适碳氮源替代加富培养基中的碳源、氮源，调整C/N比为最适C/N比，pH值7.0-7.2，配成改良培养基，其组成如下：麦芽糖20g，大豆蛋白胨4g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，pH值7.0-7.2，用蒸馏水定容至l000mL。接种后分别在16、20、24、28、32、36℃下恒温避光培养，每处理5次重复。
各处理灭菌倒入培养皿（直径均为9cm）后，在各平板（厚度约为5mm）中央接种直径为5mm的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌落一块，25℃恒温培养箱中避光培养，观测菌丝生长量(菌落直径)和长势情况，计算菌丝体日均生长速度[菌丝生长速度=菌落半径增长度(mm)÷培养天数(d)]。待长势最快一组长满平板时，停止培养，回收各处理菌丝体，测定菌丝体干重。其中，长势最快一组的培养时间为3天。
结果表明，32℃时一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝生长最快(13.2±0.2mm/d)，16℃时菌丝生长最慢(4.3±0.2mm/d)，32℃时一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713干重最高(48.2±6.0mg)，16℃时一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713干重最低(13.4±0.4mg)（表6和图6）。说明一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝培养的最适温度为32℃，其次为36℃。
表6不同温度对菌丝生长的影响
（7）不同pH值对菌丝生长的影响
上述改良培养基灭菌后调pH值为分别5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0，每处理5次重复。
各处理灭菌倒入培养皿（直径均为9cm）后，在各平板（厚度约为5mm）中央接种直径为5mm的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌落一块，25℃恒温培养箱中避光培养，观测菌丝生长量(菌落直径)和长势情况，计算菌丝体日均生长速度[菌丝生长速度=菌落半径增长度(mm)÷培养天数(d)]。待长势最快一组长满平板时，停止培养，回收各处理菌丝体，测定菌丝体干重。其中，长势最快一组的培养时间为4天。
结果表明pH6.5时一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝生长最快(8.99±0.1mm/d)，pH9.0时菌丝生长最慢(7.2±0.14mm/d)，pH6.5时菌丝干重最高(35.5±6.6mg)，pH8.0时菌丝干重最低(23.5±1.1mg)。（表7和图7）说明一色齿毛菌(Cerrena unicolor)GSM-01CGMCC No.7713菌丝培养的最适pH为6.5，其次为5.0、5.5。
表7不同pH值对菌丝生长的影响
（8）统计学分析
所有数据采用SPSS14.0统计软件进行处理分析。
Claims (8)
1.一色齿毛菌(Cerrena unicolor)，其特征在于：所述一色齿毛菌(Cerrenaunicolor)的菌株号为GSM-01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.7713。
2.固定化真菌菌丝，其特征在于：所述固定化真菌菌丝为将权利要求1所述的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)的菌丝固定在固体载体上得到的。
3.生产权利要求1所述的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)的菌丝的方法，包括将权利要求1所述的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)在含有碳源、氮源和生长因子的培养基中培养的步骤；所述碳源为麦芽糖、淀粉或葡萄糖，所述氮源为酵母提取物或大豆蛋白胨，所述生长因子为维生素B1或维生素C。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养基的碳氮比为10：1-20：1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：每升所述培养基按照如下方法配制：含碳量为8g的所述碳源，大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2；所述培养采用的培养温度为25℃。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：每升所述培养基按照如下方法配制：葡萄糖20g，含氮量为0.4g的所述氮源，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2；所述培养采用的培养温度为25℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：每升所述培养基按照如下方法配制：葡萄糖20g，大豆蛋白胨2g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，所述生长因子10mg，琼脂20g，用蒸馏水定容至l000mL，pH值7.0-7.2；所述培养采用的培养温度为25℃。
8.权利要求1所述的一色齿毛菌(Cerrena unicolor)在发酵生产漆酶中的应用。
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