CN101503659B - 一种哈茨木霉菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2及其应用，该菌株已于2009年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2870。该菌属于半知菌纲，与绝大多数白腐菌所属的担子菌纲相比，为低等真菌，培养周期短，生长繁殖速度快，可以在短时间内培养出大量、均一的木质素降解酶产生菌培养液。本发明还提供利用该菌株在液体产酶培养基中发酵培养生产木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)的方法，可在短时间内生产较高活力的LiP和MnP，且其发酵工艺简单、稳定、成本低廉、产量高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及其应用领域，特别是涉及一种哈茨木霉菌株及其应用。
背景技术
木质素是植物细胞壁重要组成部分，木质素通过植物光合作用，每年在地球上大量积累，在自然界中，木质素含量丰富，是仅次于纤维素的天然高分子化合物，据估算，全球每年可产生约6×1014t木质素。同时，木质素也被微生物降解，参与地球上的碳素循环，并在其中发挥着重要作用。
木质素是植物组织进化的产物，它赋予植物自身保护能力，抵抗微生物对其产生的腐朽作用，它是天然有机物中最难被生物分解的物质之一。自然界中，木质素的降解是一个比较缓慢的过程，是自然界碳素循环的限速步骤。
在传统的造纸业中，木质素一直是被当作获取造纸纤维的障碍而被分离和废弃的，由于传统的分离木质素的方法是采用酸碱等化学试剂在高温下进行的，由此造成的高成本和环境污染问题是一直困扰造纸业的难题。特别是近几十年来，随着全球资源、能源和环境问题的日益突出，人们把寻求新能源和新资源的目光更多地投入到可再生的生物质资源上，而对纤维类生物质资源的有效利用，必须首先将木质素从其他组分中分离出来，因此促使人们寻找对环境更友好的木质素降解方法。
二十世纪八十年代初，在黄孢原毛平革菌中首次发现了木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶，这两种酶可降解木质素，随后发现这些酶还能氧化降解环境宿存的有毒有害的有机污染物，如各种有机染料、DDT、氯代联二苯、二噁英、高丙体六六六、苯并芘等。由于具有极大的应用价值，如何高效低成本地利用天然木质素降解酶来分离木质素，以及降解各种难降解的环境污染物成为人们几十年来科研与实践的努力方向。
目前，已知能够分解木质素的微生物大部分是大型真菌的木材腐朽菌，还有极少数是细菌和放线菌。根据木腐真菌对木材产生的腐朽方式将其分为3大类群：软腐真菌、褐腐真菌和白腐真菌。迄今的研究结果表明，只有白腐菌能彻底地降解木质素，其具有较强的产生木质素降解酶的能力。
近几十年来，在木质素酶和木质素生物降解方面取得了一定的研究进展，但是由于木质素酶的生产成本较高，一直难以实现产业化。这其中的主要原因之一就是目前人们已知和研究应用的白腐菌绝大多数为真菌担子菌纲，该类菌生长缓慢，大多不能形成无性孢子，只能靠菌丝繁殖，个别能产生无性孢子的菌种其产生孢子的能力也很低，因此，在生产上扩大培养困难，培养周期长，难以在短时间内培养出大量、均一的木质素酶产生菌培养液。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养周期短，易于扩大培养的木质素降解酶生产菌：哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2，该菌株已于2009年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2870。
本发明的另一个目的是提供一种哈茨木霉WRF-2的应用，利用该菌株的发酵培养产物生产木质素降解酶的方法。
本发明所述的哈茨木霉WRF-2的特征为：菌株的菌落在PDA平板上30℃ 3天扩展9cm，初期白色稀疏，后形成绿色产孢区；菌丝具隔，分枝；分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5～10x2.5～3.5μm。分生孢子球形、近球形，单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，壁光滑，直径2.5-3.0μm。提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(ITS1-5.8S-ITS2)。ITS1-5.8S-ITS2序列表：
AGGAGCAGCATCTACTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAGTTGGGTGTTTAACGGCTGTGGACGCGCCGCGCTCCCGATGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGAGACGGCCACCGCCAAGAGGCAGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAAACGCCTACGAGAGGCGCCGAGAAGGCTCAGATTACAAAAAACCCGCGAGGGGGTATACAAAAAGAGTTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCTTGGTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCAGAGATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTTTTACTTGATTGTTACATCCAA
将该序列进行Blast比较，与Trichoderma harzianum NR6929相似性达98％。
该菌属于半知菌纲，与绝大多数白腐菌所属的担子菌纲相比，为低等真菌，生长繁殖速度快，可以在短时间内培养出大量、均一的木质素降解酶产生菌培养液。该菌还可在短期内(4-5天)形成大量分生孢子，其形成分生孢子的速度比黄孢原毛平革菌快约一周时间，且产孢子能力可以达到黄孢原毛平革菌的10倍，而黄孢原毛平革菌则是担子菌中生长和产孢能力较强的菌种。极大地节约了生产用时间和能源消耗。利用该菌生产木质素降解酶可以极大地降低生产成本。
本发明所述的利用哈茨木霉WRF-2生产木质素降解酶的方法，是将哈茨木霉WRF-2接种到液体产酶培养基中，培养，得到木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。
所述液体产酶培养基包括碳源、氮源、无机盐、缓冲溶液和水。所述液体产酶培养基还包括生长因子，或进一步包括活性添加成分。
其中，所述碳源选自下述化合物中的至少一种：葡萄糖、果糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠(CMC)、可溶性淀粉、木糖、麦芽糖；所述碳源的终浓度为0.5～10g/L。
所述氮源选自下述化合物中的至少一种：酒石酸铵、草酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠；所述氮源的终浓度为0.2～10g/L。
所述无机盐包括KH2PO4、MgSO4、CaCl2和复合微量元素液，所述KH2PO4的终浓度为0.5～4.0g/L；所述MgSO4的终浓度为0.05～2.0g/L；所述CaCl2·2H2O的终浓度为0.05～1.0g/L。所述微量元素液配方为MgSO4·7H2O 3g、氨基乙酸1.5g、MnSO4 0.5g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、CoSO4 0.1g、CaCl2 0.08g、ZnSO4 0.1g、CuSO4·5H2O 0.01g、AlK(SO4)2 0.01g、H3BO3 0.01g、NaMoO4 0.01g、蒸馏水1000mL，所述微量元素液终浓度为0～100mL/L。
所述生长因子为维生素B1；所述生长因子的终浓度为0～5mg/L。
所述活性添加成分为藜芦醇、麦草粉和吐温80，其中所述藜芦醇的终浓度为0～1g/L；所述麦草粉的终浓度为0～2g/L；所述吐温80的终浓度为0.5～2g/L。
所述缓冲溶液选自下述缓冲溶液中的至少一种：琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、酒石酸-酒石酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；所述缓冲液的终浓度为10～50mM；所述缓冲溶液的pH为3.5～7.5。
所述水可为蒸馏水、自来水或井水等无污染的清洁水。
所述碳源的终浓度优选为0.6g/L。所述碳源优选为淀粉。
所述氮源的终浓度优选为7.5g/L。所述氮源优选为酵母粉。
所述无机盐中，MgSO4的终浓度优选为0.244g/L；KH2PO4的终浓度优选为4.0g/L；CaCl2·2H2O的终浓度优选为0.066g/L；复合微量元素的终浓度优选为40mL/L。
所述生长因子中，维生素B1的终浓度优选为1～2mg/L。
所述活性添加成分中，藜芦醇的终浓度优选为0.4g/L；麦草粉的终浓度优选为0.5g/L；吐温80的终浓度优选为1.5g/L。
所述缓冲溶液的终浓度优选为20mM；所述缓冲溶液优选为琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液；所述缓冲溶液的pH优选为4.5。
所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的接种量无特别限制，一般为104～106个孢子/mL培养基。
所述培养的条件为在20～35℃培养2～8天，优选28～30℃。
所述培养可以120～220rpm的转速振荡培养2～5天，也可静置培养3～8天。
由哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2发酵上述培养基得到的发酵制品也属于本产品的保护范围。
所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体外形。
本发明的哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2具有生长繁殖迅速，较高的木质素过氧化物酶的生产能力，且其发酵工艺简单、稳定、成本低廉、产酶快(摇床培养3天即可达到产酶高峰)、产量高(2000～2300U/L)，在木质素降解酶的生产领域中具有实现其工业化生产的极大可能，并具有广阔的工农业应用和市场前景。
附图说明
图1哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2菌株的子实体的形态图。
图2为哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2菌株的菌丝形态图。
图3为哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2菌株的孢子形态图。
图4为培养48小时的哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2菌株与黄孢原毛平革菌的苯胺蓝平板脱色图的对比，其中a，b分别为WRF-2菌株培养皿的正面和反面照片；c和d分别为黄孢原毛平革菌培养皿的正面和反面照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的分离筛选
PDA综合培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.5g，VB1 10mg，琼脂20g，水1000ml，pH自然(不控制pH值)。新鲜马铃薯去皮后切成边长0.5cm的小方块，加水1000ml，煮沸后再加热10分钟，然后，用四层纱布过滤，得土豆营养液，添加除VB1外的其他成分，补足水至1000ml，121℃灭菌15min，VB1单独配成溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后加入，使其终浓度为10mg/L，混匀后铺平板或制作斜面培养基。
苯胺蓝(Azure-B)脱色培养基：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，苯胺兰0.1g，琼脂18g，水1000ml，pH自然，121℃灭菌15min。灭菌后铺平板。
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的分离筛选步骤如下：
一、分离纯化
1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的子实体(如图1)采自我国南方某树林中，对采集到的子实体采用组织分离法和菌丝切割法相结合的方法进行分离纯化。将采集到的子实体先用70％酒精进行表面灭菌处理，后无菌条件下用无菌手术刀将子实体切开或用手将其撕开，然后切取内部菌肉若干小块，之后用接种针逐一挑到平板培养基(PDA综合培养基)上，于25℃培养，每天观察菌丝生长情况，待观察到分离的组织块上生长出浓密洁白的菌丝时，用无菌医用尖头镊小心夹取菌丝尖端少量菌丝体转接到平板培养基(PDA综合培养基)上进行菌种纯化，注意不要碰到污染的杂菌。
2、将得到的纯菌种转移接种到斜面培养基(PDA综合培养基)上，4℃保存。
二、木质素降解酶产生能力的筛选
1、采用苯胺兰平板脱色法，根据菌株在培养过程中木质素降解酶类的产生情况，从中筛选出产酶快，酶活高的菌种。
苯胺蓝(Azure-B)平板脱色法：分别在苯胺蓝脱色培养基上接种WRF-2和黄孢原毛平革菌，25℃(黄孢原毛平革菌为39℃)培养，每天观察记录，以蓝色培养基中菌落的脱色圈的有无及产生快慢和脱色圈的大小来定性检测木质素过氧化物酶(LiP)和/或锰过氧化物酶(MnP)的产生情况。
WRF-2在培养1天后即产生了明显的脱色圈，而对照模式菌黄孢原毛平革菌在培养1天后没有产生脱色现象；培养2天后，WRF-2产生了直径约为6.0cm的明显脱色圈，而黄孢原毛平革菌仅在接种块周围产生十分轻微的一点脱色现象。二者生长和脱色情况比较如图4所示。
显然，WRF-2不仅生长速度迅速，而且具有迅速强力的苯胺蓝脱色能力，说明该菌种具有快速产生较高活力的木质素过氧化物酶(LiP)和(或)锰过氧化物酶(MnP)的能力，是木质素降解酶生产的理想菌种。
三、菌种分类地位的鉴定
对筛选出的WRF-2菌株的表型特征和核酸特征进行系统地鉴定，结果如下：
培养特征和形态特征为：菌落在PDA平板上25℃3天扩展7cm，初期白色稀疏，后形成绿色产孢区。反面无色。菌丝具隔，分枝。分生孢子梗形成金字塔式的分枝轮廓，分枝末端的小梗束生、对生、互生或单生，瓶形，4.5～10x2.5～3.5μm。分生孢子球形、近球形，单个近无色，聚集时呈淡灰绿色，壁光滑，直径2.5-3.0μm。菌丝体和孢子形态如图2和图3所示。
提取此菌的DNA，以ITS5-ITS4为引物，扩增rDNA的ITS区域(ITS1-5.8S-ITS2)。序列进行Blast比较，与Trichoderma harzianumNR6929相似性达98％。序列如下所示：
ITS1-5.8S-ITS2序列表：
AGGAGCAGCATCTACTGATCCGAGGTCAACATTTCAGAAGTTGGGTGTTTAACGGCTGTGGACGCGCCGCGCTCCCGATGCGAGTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGAGACGGCCACCGCCAAGAGGCAGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAAACGCCTACGAGAGGCGCCGAGAAGGCTCAGATTACAAAAAACCCGCGAGGGGGTATACAAAAAGAGTTTTGGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCTTGGTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCAGAGATCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTTTTACTTGATTGTTACATCCAA
经文献检索，作者未发现有该类菌用于木质素降解或产木质素酶方面的国内外文献报道。
实施例2
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的发酵培养
利用哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2生产木质素过氧化物酶(LiP)和/或锰过氧化物酶，包括以下步骤：
1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的孢子培养产孢培养基：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水1000ml，pH自然，121℃灭菌15min。
用接种铲从斜面挖取一块边长为0.5cm左右的菌丝块接种于产孢培养基平板中，30℃培养5～7天，即可产生大量绿色孢子。
2、发酵生产木质素降解酶
微量元素溶液：MgSO4·7H2O 3g，氨基乙酸1.5g，MnSO4 0.5g，NaCl 1g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoSO4 0.1g，CaCl2 0.08g，ZnSO40.1g，CuSO4·5H2O 0.01g，AlK(SO4)2 0.01g，H3BO3 0.01g，NaMoO40.01g，蒸馏水1000mL。
产酶培养基(/L)：淀粉0.6g，酵母粉7.5g，KH2PO4 4.0g，MgSO40.244g，CaCl2·2H2O 0.066g，藜芦醇2mmol，麦草粉(过60目筛)0.5g，吐温80 1.5g，VB1 2mg，微量元素溶液40mL，20mM琥珀酸钠缓冲液调pH4.5，121℃灭菌15min，VB1单独配成溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后加入，使其终浓度为2mg/L。
LiP酶活性的测定方法：天青B法——参照Frederick S.Archibald.A New Assay for Lignin-type Peroxidase Employing in the Dye Azure B[J]Applied and Environmental Microbiology 1992，58(9)：3110-3116。
反应混合液为3mL，20mmol/L的琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)，终浓度为64μmol/L天青B，加入终浓度为0.1mmol/L的H2O2，30℃下加入300μL酶液启动反应，测反应最初0.5min内651nm处OD值减小速率。根据天青B的色度变化，来标记LiP活性，天青B的ε＝48800(mol/L)-1·cm-1。LiP酶活定义为：每分钟降解1μmol/L天青B所需的酶量为1U。
MnP酶活性的测定方法：酚红钠法——参照MasaakiKuwahara.etc.，Separation and characterization of two extracellularH2O2-dependent oxidases from ligninolytic cultures of Phanerochaetechrysosporium，FEBS，April 1984，247-250。
反应混合液为3mL含有20mmol/L琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)2100μL，终浓度0.04％(质量浓度0.0004g/mL)酚红钠，终浓度25mmol/L的乳酸，终浓度100μmol/L的MnSO4·H2O，终浓度0.1％蛋清，终浓度0.1mmol/L的H2O2，600μL酶液，启动反应，30℃下反应1min。610nm处测OD改变值，氧化的酚红的消光系数ε＝22000(mol/L)-1·cm-1。MnP酶活定义为：每分钟转化1μmol/L酚红钠所需的酶量为1U。
按步骤1培养孢子，用无菌水将孢子洗下，用血球计数法计数后用无菌水调整孢子浓度，使每mL孢子悬液中含有约2.5×107个孢子，然后接种0.5mL孢子悬液入50mL产酶培养基中(装在250mL三角瓶中)，使接种的孢子终浓度2.5×105个/mL培养基，30℃静置培养4天。发酵结束后测定发酵液中LiP的活性为1771.9U/L；MnP的活性为483.1U/L。
实施例3
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的发酵生产
利用哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2生产木质素过氧化物酶(LiP)和/或锰过氧化物酶，包括以下步骤：
1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的孢子培养同实施例2。
2、发酵生产木质素降解酶
产酶培养基配方和LiP、MnP酶活性的测定方法同实施例2。按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入50mL产酶培养基中，30℃，200rpm培养3天，发酵结束后测定发酵液中LiP的活性为1908U/L，MnP的活性为3550U/L。
实施例4
哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的发酵生产
利用哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2生产木质素过氧化物酶(LiP)和/或锰过氧化物酶，包括以下步骤：
1、哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2的孢子培养同实施例2。
2、发酵生产木质素降解酶
产酶培养基(/L)：葡萄糖2g，蛋白胨5g，KH2PO4 1.0g，MgSO41.0g，CaCl2·2H2O 0.75g，藜芦醇1mmol，麦草粉(过60目筛)1g，吐温801.5g，VB1 1mg，微量元素溶液60mL，50mM酒石酸-酒石酸钠缓冲液调pH5.0，121℃灭菌15min，VB1单独配成溶液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后加入，使其终浓度为1mg/L，加净水直至1升。
LiP、MnP酶活性的测定方法同实施例2。按实施例2的方法和浓度接种孢子悬液入50mL产酶培养基中，30℃，200rpm培养3天，发酵结束后测定发酵液中LiP的活性为1801U/L，MnP的活性为2549U/L。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种哈茨木霉菌株及其应用
<130>KHP09112181.3
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>618
<212>DNA
<213>哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2
<400>1
aggagcagca tctactgatc cgaggtcaac atttcagaag ttgggtgttt aacggctgtg 60
gacgcgccgc gctcccgatg cgagtgtgca aactactgcg caggagaggc tgcggcgaga 120
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Claims (9)
1.一种哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai)WRF-2，其保藏编号为CGMCC No.2870。
2.如权利要求1所述的哈茨木霉，其特征在于，其菌株的ITS1-5.8S-ITS2序列如SEQ ID NO：1所示。
3.权利要求1或2所述的哈茨木霉WRF-2CGMCC No.2870在生产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶中的应用。
4.一种生产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的方法，是在液体产酶培养基中发酵培养哈茨木霉WRF-2CGMCC No.2870，得到木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养所用的培养基为液体产酶培养基，包括碳源、氮源、无机盐、缓冲溶液和水；
所述碳源选自下述化合物中的至少一种：葡萄糖、果糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠、可溶性淀粉、木糖、麦芽糖；所述碳源的终浓度为0.5～10g/L；
所述氮源选自下述化合物中的至少一种：酒石酸铵、草酸铵、氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠；所述氮源的终浓度为0.2～10g/L；
所述无机盐包括KH2PO4、MgSO4、CaCl2·2H2O和复合微量元素液，所述KH2PO4的终浓度为0.5～4.0g/L；所述MgSO4的终浓度为0.05～2.0g/L；所述CaCl2的终浓度为0.05～1.0g/L；所述复合微量元素液由如下组分组成：MgSO4·7H2O 3g、氨基乙酸1.5g、MnSO40.5g、NaCl 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、CoSO4 0.1g、CaCl2 0.08g、ZnSO40.1g、CuSO4·5H2O 0.01g、AlK(SO4)2 0.01g、H3BO3 0.01g、NaMoO40.01g、蒸馏水1000mL；复合微量元素液的加入量为使其终浓度为0～100mL/L；
所述缓冲溶液的pH为3.5～7.5，选自下述缓冲溶液中的至少一种：琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、酒石酸-酒石酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；所述缓冲液的终浓度为10～50mM；
所述水为蒸馏水、自来水或井水的无污染的清洁水。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述液体产酶培养基还包括生长因子，所述生长因子为维生素B1，其终浓度为0～5mg/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述液体产酶培养基还包括活性添加成分，所述活性添加成分为藜芦醇、麦草粉和吐温80，其中藜芦醇的终浓度为0～1g/L；麦草粉的终浓度为0～2g/L；吐温80的终浓度为0.5～2g/L。
8.如权利要求4的方法，其特征在于，所述发酵培养采用的接种量为：哈茨木霉WRF-2CGMCC No.2870的接种量为104～106个孢子/mL培养基。
9.如权利要求4的方法，其特征在于，所述发酵培养采用的培养条件为20～35℃培养2～8天。
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