CN107129974B - 降解非酚型木质素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及降解非酚型木质素的方法。本发明通过在非酚型木质素的降解过程中添加有机酸来作为介体提高锰过氧化物酶的降解效率。实验证明，丙二酸和草酸的添加能有效的降解非酚型木质素化合物如藜芦醇。本发明的方法操作简单，成本投资低，适用范围广，无污染，提高非酚型木质素降解效率明显，可广泛用于木质纤维素生物质预处理过程和异生物质降解领域。

Description

降解非酚型木质素的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及降解非酚型木质素的方法。
背景技术
木质纤维素生物质作为一种新型的可再生资源，被广泛应用于生物能源和生物基化学品领域。木质纤维素由纤维素、半纤维素和木质素组成，纤维素和半纤维素由糖单元基本结构单元构成，木质素主要由少量的酚型和大量的非酚型亚结构单元构成。在木质纤维素酶解糖化的过程中，木质素不仅作为物理屏障，限制纤维素酶接近纤维素，同时吸附纤维素酶，导致非反应性的结合。因此木质素的含量和类型对各种木质纤维素原料的水解效率有较大影响。
锰过氧化物酶是一种含铁血红素的糖基化过氧化物酶，是分解木质素的主要酶系。由于锰过氧化物酶的氧化还原电位较低，只能氧化酚型结构的木质素，无法直接降解木质素中含量最多的非酚型结构单元。
发明内容
本发明的目的是提供降解非酚型木质素的方法。
一种锰过氧化物酶以有机酸为介体降解非酚型木质素的方法。
根据本发明的具体实施方式，所述降解非酚型木质素的方法包括锰过氧化物酶以有机酸溶液作为介体降解非酚型木质素的步骤。
根据本发明的具体实施方式，所述降解非酚型木质素的方法，其中，锰过氧化物酶来源于革菌科、齿菌科或多孔菌科真菌，或产锰过氧化物酶的基因工程菌株。
根据本发明的具体实施方式，所述降解非酚型木质素的方法，其中，所述非酚型木质素为藜芦醇、3,4-二甲氧基肉桂酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、或3,4,5-三甲氧基苯甲酸等非酚型木质素。
根据本发明的具体实施方式，所述降解非酚型木质素的方法，其中，所述有机酸溶液为丙二酸-丙二酸钠溶液、草酸-草酸钠溶液、醋酸-醋酸钠溶液、柠檬酸-柠檬酸钠溶液、乳酸-乳酸钠溶液和/或丁二酸-丁二酸钠溶液。
根据本发明的具体实施方式，所述降解非酚型木质素的方法，其中，添加有机酸溶液后，降解体系中有机酸的浓度为50mM。
根据本发明的技术方案，寻找简单有效的介体物质是锰过氧化物酶降解非酚型木质素的关键所在。本发明的方法操作简单，成本投资低，适用范围广，无污染，提高非酚型木质素降解效率明显，可广泛用于木质纤维素生物质预处理过程和异生物质降解领域。
附图说明
图1重组锰过氧化物酶MnP-1和MnP-2在丙二酸-丙二酸钠溶液中降解非酚型木质素藜芦醇。
图2重组锰过氧化物酶MnP-1和MnP-2在不同有机酸丙二酸和草酸溶液中降解非酚型木质素藜芦醇。
图3重组锰过氧化物酶MnP-1和MnP-2在不同有机酸醋酸、柠檬酸、乳酸和丁二酸溶液中降解非酚型木质素藜芦醇。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株：产锰过氧化物酶的大肠杆菌工程菌株。
2、生化试剂：3,4-二甲氧基苯甲醇和3,4-二甲氧基苯甲醛购自Sigma-Aldrich公司，色谱纯乙腈购自Fisher Scientific公司，丙二酸、丙二酸钠、草酸、草酸钠、醋酸、醋酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、乳酸、乳酸钠、丁二酸、丁二酸钠、硫酸锰和过氧化氢都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl,pH7.0)。
实施例1重组锰过氧化物酶的制备
MnP-1氨基酸序列如下：
MAFKTILAFVALATAALAAPSSRVTCSPGRVVSNGACCKWFDVLDDIQENLFDGGVCGEEVHESLRLTFHDAIGFSLSAEREGKFGGGGADGSIMAFAEIETNFHANNGVDEIVEAQRPFAIKHKVSFGDFIQFAGAVGVSNCLGGPRLEFMAGRSNISRAAPDLTVPEPSDSVDKILARMGDAGFSSSEVVDLLISHTVAAQDHVDPTIPGTPFDSTPSEFDPQFFVETLLKGTLFPGNGSNVGELQSPLRGEFRLQSDALLARDPRTACEWQSFVNNQRLMVTKFEAVMSKLAVLGHNPRDLVDCSEVIPVPPRAKTNVAVLPAGKTRADVQAACAATPFPTLQTAPGPATSIVPV
MnP-2氨基酸序列如下：
MAFKHLVVALSIVLSLGVAQAAITKRVACPDGKNTATNAACCSLFAIRDDIQANLFDGGECGEEVHESFRLTFHDAIGTGSFGGGGADGSIIVFDDIETNFHANNGVDEIIDEQKPFIARHNITPGDFIQFAGAVGVSNCPGAPRLDFFLGRPNPVAAAPDKTVPEPFDTVDSILARFKDAGGFTPAEIVALLGSHTIAAADHVDPTIPGTPFDSTPEVFDTQVFVEVQLRGTLFPGTGGNQGEVQSPLRGEIRLQSDHDLARDSRTACEWQSFVNNQAKLQSAFKAAFKKLSVLGHNINNLIDCSEVIPEPPNVKVKPATFPAGITHADVEQACATTPFPTLATDPGPATSVAPVPPS
取分别产锰过氧化物酶MnP-1和MnP-2的大肠杆菌工程菌株，接种于40mL LB培养液中，37℃250rpm振荡培养12h后，按2％比例转接于300mL LB培养基中，37℃250rpm振荡培养4h，直至OD600达到0.8，加入终浓度1mM的诱导剂IPTG诱导4h后，离心收集菌体。采取溶菌酶法裂解菌体，8M尿素溶解包涵体蛋白，配制如下复性体系pH 9.5 50mM Tris-HClbuffer,0.5M urea,0.5mM GSSG,0.1mM DTT,10μM hemin,5mM CaCl2,0.1mg/mL蛋白溶液，于15℃静置复性10小时，10kD膜包浓缩透析pH 6.0Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，阴离子分离纯化。
实施例2重组锰过氧化物酶降解非酚型木质素
按如下反应体系：50μl丙二酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)，20μl去离子水，20μl非酚型木质素藜芦醇溶液，5μl硫酸锰(40mM)，100μl锰过氧化酶(1000U/L)，5μl过氧化氢(4mM)。以未加入锰过氧化物酶的体系作为对照，每个锰过氧化物酶设3个重复。反应在30℃下降解48h，采用高效液相色谱(HPLC)分析藜芦醇的降解率，具体实验结果见图1。
如图1所示，锰离子是重组锰过氧化物酶降解非酚型木质素的必要组成部分，在锰离子缺少的情况下，重组过氧化物酶MnP-1和MnP-2均无法降解非酚型木质素模型化合物。
实施例3重组锰过氧化物酶不同有机酸体系下降解非酚型木质素
按如下反应体系：50μl有机酸缓冲液(0.2M，pH 5.0)，20μl去离子水，20μl藜芦醇溶液，5μl硫酸锰(40mM)，100μl锰过氧化酶(1000U/L)，5μl过氧化氢(4mM)。所用的有机酸缓冲液分别为丙二酸-丙二酸钠、草酸-草酸钠、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乳酸-乳酸钠和丁二酸-丁二酸钠，以未加入锰过氧化物酶的不同有机酸体系作为对照，每个锰过氧化物酶设3个重复。反应在30℃下降解48h，采用高效液相色谱(HPLC)分析藜芦醇的降解率，具体实验结果见图2。
如图2和图3所示，不同的有机酸如丙二酸、草酸、醋酸、柠檬酸、乳酸和丁二酸对锰过氧化物酶降解非酚型木质素发挥着不同的作用，丙二酸和草酸的添加能启动并促进锰过氧化物酶降解非酚型木质素模型化合物，其促进效果丙二酸强于草酸，而其余有机酸醋酸、柠檬酸、乳酸和丁二酸的添加锰过氧化物酶无法降解非酚型木质素模型化合物。
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120>降解非酚型木质素的方法
<160>2
<210> 1
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
MAFKTILAFV ALATAALAAP SSRVTCSPGR VVSNGACCKW FDVLDDIQEN LFDGGVCGEE 60
VHESLRLTFH DAIGFSLSAE REGKFGGGGA DGSIMAFAEI ETNFHANNGV DEIVEAQRPF 120
AIKHKVSFGD FIQFAGAVGV SNCLGGPRLE FMAGRSNISR AAPDLTVPEP SDSVDKILAR 180
MGDAGFSSSE VVDLLISHTV AAQDHVDPTI PGTPFDSTPS EFDPQFFVET LLKGTLFPGN 240
GSNVGELQSP LRGEFRLQSD ALLARDPRTA CEWQSFVNNQ RLMVTKFEAV MSKLAVLGHN 300
PRDLVDCSEV IPVPPRAKTN VAVLPAGKTR ADVQAACAAT PFPTLQTAPG PATSIVPV 358
<210> 2
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
MAFKHLVVAL SIVLSLGVAQ AAITKRVACP DGKNTATNAA CCSLFAIRDD IQANLFDGGE 60
CGEEVHESFR LTFHDAIGTG SFGGGGADGS IIVFDDIETN FHANNGVDEI IDEQKPFIAR 120
HNITPGDFIQ FAGAVGVSNC PGAPRLDFFL GRPNPVAAAP DKTVPEPFDT VDSILARFKD 180
AGGFTPAEIV ALLGSHTIAA ADHVDPTIPG TPFDSTPEVF DTQVFVEVQL RGTLFPGTGG 240
NQGEVQSPLR GEIRLQSDHD LARDSRTACE WQSFVNNQAK LQSAFKAAFK KLSVLGHNIN 300
NLIDCSEVIP EPPNVKVKPA TFPAGITHAD VEQACATTPF PTLATDPGPA TSVAPVPPS 359

Claims (3)

1.降解非酚型木质素的方法，其特征在于，所述方法包括锰过氧化物酶以有机酸溶液作为介体降解非酚型木质素的步骤，所述非酚型木质素为藜芦醇，所述有机酸溶液为丙二酸溶液或草酸溶液。
2.根据权利要求1所述的降解非酚型木质素的方法，其特征在于，锰过氧化物酶来源于革菌科、齿菌科或多孔菌科真菌，或产锰过氧化物酶的基因工程菌株。
3.根据权利要求1所述的降解非酚型木质素的方法，其特征在于，添加有机酸溶液后，降解体系中有机酸的浓度为50mM。
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