CN109072210B - 用预处理的木质纤维素渣料制备纤维素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备纤维素分解酶或半纤维素分解酶的方法，其包括：‑在密闭反应器中，在至少一种浓度为10‑90g/L的碳质生长底物存在下，在25‑30℃的温度和为4‑5.5的pH下的纤维素分解微生物的生长阶段a)；‑酶制备阶段b)，其中在25‑27℃的温度和4‑5的pH下加入至少一种诱导碳质底物，在所述方法中所述诱导底物是从木质纤维素材料的预处理工艺获得的预处理渣料，所述渣料未经过酶促水解并以分批进料或连续方式被引入，并具有特定特征：在测试中水解产率大于80％，和在测试中测得的在10s‑1剪切速率时的表观粘度小于1Pa.s。

Description

用预处理的木质纤维素渣料制备纤维素的方法
本发明涉及用于制备纤维素分解酶和半纤维素分解酶的方法。
酶尤其用于制备第二代生物燃料(即来自木质纤维素生物质)的方法中，特别是当生物燃料是乙醇时。通常，根据本发明的方法可用于所有包括生物质的酶促水解，特别是木质纤维素生物质的酶促水解的工艺中。它尤其可用于通过丝状真菌来制备酶中。
现有技术
自超过45年来，在将组成多糖水解成可发酵糖之后，将木质纤维素材料转化为乙醇已成为许多研究的主题。
木质纤维素材料是纤维素材料，即由超过90重量％的纤维素和/或木质纤维素组成(木质纤维素基本上包含纤维素，半纤维素和木质素)。纤维素和半纤维素是基本上由戊糖和己糖组成的多糖。木质素是一种基于酚类化合物的具有复杂结构和高分子量的大分子。
木材，稻草和玉米穗轴是最广泛使用的木质纤维素材料，但可以使用其它资源，如专用林地作物，产酒精植物残留物，含糖植物和谷物，造纸工业的木质纤维素残留物，以及来自木质纤维素材料的转化产物。它们大部分包含约35至50％的纤维素，20至30％的半纤维素和15至25％的木质素。
将木质纤维素材料生物化学转化为乙醇的方法包括物理化学预处理步骤，然后使用酶混合物进行酶促水解以产生糖的步骤，使释放的糖的乙醇发酵步骤，其中乙醇发酵和酶促水解可以是同时进行(SSF工艺)，和乙醇纯化步骤。
酶混合物是纤维素分解酶(也称为纤维素酶)和/或半纤维素分解酶(通常称为木聚糖酶)的混合物。纤维素分解酶具有三种主要类型的活性：内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和纤维二糖酶，后者也称为β-葡糖苷酶。半纤维素分解酶尤其具有木聚糖酶活性。
酶促水解是有效的并且在温和条件下进行。
酶的成本仍然很高，占将木质纤维素材料转化为乙醇的成本的20％至50％。因此，已经进行了大量工作来降低这种成本：首先是优化酶的制备，通过选择高产微生物和改进制备所述酶的方法，然后减少在水解中的酶的量，通过优化预处理步骤，改善这些酶的特定活性，以及优化酶促水解步骤的实施。
在过去十年中，许多研究集中于理解酶混合物的作用机制和表达。目的是通过改变微生物来分泌最适合用于木质纤维素材料水解的混合物。
最常用于酶混合物的工业制备的纤维素分解微生物是真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)。它具有在诱导碳质底物(例如纤维素)存在下，分泌非常高浓度(高达100g/l)的酶混合物的能力。具有使木质纤维素材料水解必不可少的性质的其它蛋白质也由里氏木霉(Trichoderma reesei)，例如木聚糖酶产生。诱导碳质底物的存在对于纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的表达是必需的。碳质底物的种类对酶混合物的组成具有强烈影响。木糖是这种情况，其与诱导碳质底物如纤维素或乳糖结合，允许显著提高所述木聚糖酶的活性。
在酶混合物工业制备方法中，乳糖仍然是最合适的底物之一；然而，其成本差异很大，并约占酶成本价的三分之一到三分之二。在使用乳糖作为碳质底物的情况下，酶混合物制备方法取决于外部碳源。因此，使用从木质纤维素材料的生化转化过程获得的碳质底物是一个重要的前进方向。
可以使用的另一种诱导底物是纤维素。然而，它具有比乳糖还更贵的成本。
专利申请US-2011/262997用预处理的生物质代替在制备纤维素酶的常规方法中使用的纤维素，预处理的生物质特别通过使生物质(任选地已经洗涤)在酸性条件下通过蒸汽爆炸(explosion à la vapeur)进行预处理。预处理的生物质仅用作诱导物，微生物的生长是用葡萄糖作为碳质底物而获得的。在间歇操作方法的实施例中，在实验开始时总共加入预处理(酸煮)和洗过的渣料，以及葡萄糖和消泡剂的溶液。
一方面，该方法的缺点在于它需要在使用前对所使用的预处理渣料进行脱毒。洗涤是用于脱毒的推荐选择。如果需要在工业规模上应用这种方法，则洗涤的实施将大大增加该方法的成本。
另一方面，在实验开始时加入所有预处理渣料的事实大大增大了介质的粘度，这需要施加高耗散功率。用于搅拌介质所需的电动机功率(kW/m3)称为“耗散功率”。粘度的这种增加还需要非常高的通气速率以允许转移足够的氧气。
另一专利申请WO-13/190064也涉及用于使预处理的木质纤维素生物质(称为第一预处理的生物质)酶促水解的酶的制备。这种制备在不添加糖(例如葡萄糖)的情况下进行，但是在包含复合糖和木质素的固体存在下进行。这种固体优选从其它生物质处理方法(其包括使所述固体酶促水解然后分离，该方法从第二预处理的生物质开始)中获得。在该酶制备方法中，所述固体的复合糖/木质素比小于所述第二生物质的复合糖/木质素比是必要的。这种标准要求从水解产物中除去至少50％的水和可溶性糖。这增加了这种方法的成本。此外，这种固体包含非常高的木质素百分比，这使得酶的制备效率较低。事实上，已知的是，木质素的酚类化合物对酶具有抑制作用。
专利申请WO-13/053924使用相同类型的方法操作，其中预处理的生物质也起到生长底物的作用，而不添加(或略微添加)单糖(葡萄糖)。此外，在不添加维生素和/或矿物质和/或酶产生诱导剂的情况下进行培养。该方法还需要对渣料进行脱毒(特别是如果使用的预处理是酸性的)。
专利申请WO11028554教导了使用由半纤维素水解获得的固体残余物以通过里氏木霉(Trichoderma reesei)制备纤维素酶的用途，其中残留物已经在木质素提取步骤中除去其木质素部分。该制备在添加糖(葡萄糖)的情况下进行。获得的酶用于纤维素的水解，而不用于半纤维素的水解。脱木质素的固体残余物在微生物生长阶段开始时使用，这导致操作困难。
本发明的一个目的是提出一种从制备方法中获得的诱导碳源，其允许制备适合于木质纤维素材料水解的酶混合物。
纤维素酶的制备方法使用预先处理的渣料，其优选先前未经过脱毒的。
发明详述
本发明涉及通过使用预处理渣料的纤维素分解微生物在深层培养中制备酶混合物的方法。
将衍生自木质纤维素材料的底物称为“预处理渣料(marc)”，其经历了预处理步骤，优选在酸性介质中的蒸汽爆炸(explosion à la vapeur)。生物质是一种优选类型的材料；在本文中，术语“生物质”和“木质纤维素材料”通常可以相同地进行使用。
将木质纤维素材料生物化学转化为醇(特别是乙醇)的方法通常包括物理化学预处理步骤(优选在酸性介质中蒸汽爆炸(explosion à la vapeur))，其产生预处理渣料，然后使用产生糖的酶混合物的酶促水解步骤，然后，所述糖的乙醇发酵步骤，其中乙醇发酵和酶促水解可以同时进行(SSF方法)或分开进行(SHF方法)，和乙醇的纯化步骤。
本发明具有许多优点：
-它减少或甚至消除了向所述木质纤维素材料的生物化学转化方法供应外部来源的碳质底物；
-它产生酶混合物，特别适用于在生化转化方法中预处理的木质纤维素材料的酶促水解。
-提出了一种方法的实施方式，其允许不对所用的预处理渣料进行脱毒(例如洗涤)。这允许减少在洗涤过程中产生的并在排出之前必须进行再处理的流出物的量。
-提出了一种方法，其中介质的粘度保持在低值，这允许限制氧气需求，并因此提供了可以按比例放大到工业规模的方法。
该方法可以以连续或分批进料方式进行操作。
在分批进料方式中，实施该方法的一种特别有利的方式是根据反应介质的pH变化和在输出气体中的CO2％以顺序方式进行渣料的添加。
这种操作方式允许使用未脱毒的预处理渣料(未洗涤的渣料)。
这种方法的优点，特别地使用上述操作方式，是保持介质的低粘度。这对于不影响氧气转移并且具有可以按比例放大到工业规模的方法是重要的。
本发明更特别地涉及包含两个阶段的酶制备方法：
-在密闭反应器中，在至少一种碳质生长底物存在下，所述微生物的生长阶段a)，所述生长阶段在碳质生长底物浓度为10-90g/l的条件下进行。在该阶段中不引入预处理渣料。由此获得所述微生物的培养物。
-酶(或酶)混合物的制备阶段b)，其中至少一种诱导碳质底物以分批进料或连续方式被引入，所述诱导碳质底物是所述预处理渣料的一部分，所述制备阶段使用连续或非连续(分批进料)方式添加渣料进行实施。
更确切地，本发明涉及制备纤维素分解酶或半纤维素分解酶的方法，包括：
-在闭合反应器中，在至少一种浓度为10-90g/l的碳质生长底物存在下，在25-30℃的温度和4-5.5的pH下，纤维素分解微生物的生长阶段a)，
-在25-27℃的温度和4-5的pH下的酶制备阶段b)，其中引入至少一种诱导碳质底物，
在该方法中
-所述诱导底物是从木质纤维素材料的预处理工艺获得的预处理渣料，所述渣料未经过酶促水解并以分批进料或连续方式被引入，
-所述渣料具有在96小时后为至少80％的酶促水解产率，所述水解在50℃和pH4.8下使用10毫克CELLIC® CTEC2酶/克MS对渣料进行实施，所述渣料含有15重量％干物质(MS)，所述产率是通过酶促水解释放的单糖质量除以最大理论质量的比率，所述最大理论质量是如果由预处理产生的所有纤维素，半纤维素和低聚物进行水解时所得到的，
-在室温下使所述预处理渣料以10重量％MS进行悬浮，其在10s-1的剪切速率时具有小于1Pa.s，优选小于0.15Pa.s的表观粘度，
-以连续方式以每升介质和每小时0.3-0.8克MS的速率引入所述渣料；以分批进料方式，每f小时加入的渣料量(f在0.5h-48h之间)为0.3f-0.8f克干物质/升介质。
优选地，步骤b)的介质的表观粘度在10s-1的剪切速率时保持小于10Pa.s，优选小于1Pa.s。
在被引入阶段b)中之前，渣料可以已经被脱毒(洗涤)或者可以没有被脱毒(洗涤)。阶段b)通常在没有添加糖的情况下操作。因此，非常有利地，所述预处理渣料是唯一的诱导底物。
如下面将详细描述的，预处理渣料由液体和固体形成，其中固体含有20-70％的干物质，其中20-50％是木质素。所述预处理渣料的固体还含有30-60重量％的纤维素和1-10重量％的无机化合物和半纤维素，并且该液体含有30-80重量％的糖。
预处理优选是在酸性条件下的蒸汽爆炸(explosion à la vapeur)。
阶段a)
在用于制备根据本发明的酶混合物的方法中使用的微生物是属于木霉属(Trichoderma)，曲霉属(Aspergillus)，青霉属(Penicillium)或裂褶菌属(Schizophyllum)的真菌菌株，优选属于里氏木霉(Trichoderma reesei)物种。最有效的工业菌株是属于里氏木霉种的菌株，其经过修饰以通过突变-选择方法改善酶混合物，例如菌株CL847(专利FR-2555803)。也可以使用通过遗传重组技术改进的菌株。这些菌株在与其生长和酶的产生相容的条件下在搅拌和充气的反应器中进行培养。已知许多改进的菌株，例如MCG77 (Gallo - US Patent 4275 167), MCG 80 (Allen, AL and Andreotti, RE,Biotechnol-Bioengi 1982 12, 451-459 1982), RUT C30 (Montenecourt, BS andEveleigh, DE, Appl. Environ. Microbiol. 1977, 34, 777-782)和CL847 (Durand etal, 1984 Proc.SFM Symposium "Genetics of Industrial Microorganisms", Paris,HESLOT H. Ed, pp 39-50)。
在所述阶段a)中使用的所述微生物的碳质生长底物有利地选自可溶性工业糖，并且优选选自葡萄糖，乳糖，木糖，在木质纤维素材料的酶促水解产物的单体糖的乙醇发酵后获得的液体残余物(酒糟)，和半纤维素级分的提取物(C5化合物)，其为从预处理的木质纤维素底物(例如在预处理阶段分离的液体)获得的单体形式，它们单独进行使用或作为混合物进行使用。根据其性质，所述碳质底物在灭菌之前被引入到封闭的反应器中或单独灭菌并将其引入封闭的反应器(在其灭菌后)中。
该碳质生长底物在所述阶段a)中以每升反应体积10至90g碳质底物的初始浓度进行使用。
优选地，所述生长阶段a)进行30至70小时，优选30至40小时。
优选地，所述生长阶段a)在4-5.5之间，优选4.8的pH下操作，并且在25至30℃，优选27℃的温度下操作。
阶段b)
根据本发明，在所述制备阶段b)中使用的所述诱导碳质底物有利地是预处理渣料。
木质纤维素材料的预处理步骤允许改善纤维素级分对酶促水解的敏感性。
优选地，预处理步骤在酸性介质中进行。它优选是酸水解，酸煮或蒸汽爆炸。优选地，预处理步骤是蒸汽爆炸。有利地，在蒸汽爆炸之前是用酸溶液浸渍所述木质纤维素材料的步骤，所述酸溶液优选为硫酸水溶液。这时将其称为在酸性条件下的蒸汽爆炸(该材料含有酸)。
在预处理结束时，获得预处理渣料，并且该渣料的一部分用于产生酶，另一部分用于酶促水解，然后用于发酵以产生醇。
所述的渣料部分可以原样使用(完全渣料)，或者优选地，它可以是其固体部分，或者也可以有利地是在或多或少分离液体后获得的部分。
根据所使用的预处理，渣料呈固体形式，具有或多或少的水分但没有液相，或者它包含固相和液相，并且在后一种情况下，液相可以全部或部分分离。
根据所用的预处理方法，固体部分占预处理渣料重量的20-70％。用于制备酶的渣料的干物质含量为10-85％，最通常为20-70％，非常优选为40％-60％(这通常对应于在预处理后获得固体形式的渣料)。
所述固体部分由木质素，无机化合物，纤维素和未水解的残留半纤维素组成。在所述固体部分中纤维素的比例为30至60重量％。在所述固体部分中木质素的比例为20至50重量％。在所述固体部分中的无机化合物和半纤维素的比例为1至10重量％。
所述预处理渣料的液体部分含有比例为30-80％的木糖，木糖寡糖，甘露糖和阿拉伯糖。
在优选的实施方案中，渣料直接进行使用，即不经历化学或生物化学处理。因此，本发明不使用还经历了酶促水解的预处理渣料。可以进行一种或多种物理处理(液体分离，加热，浓缩装置等)。
在优选的方案中，渣料不进行洗涤。在某些情况下，可以将其洗涤以使其脱毒，优选通过使用最少量的水来进行。
优选地，所述制备阶段b)进行70-200小时，优选100-150小时。
优选地，所述制备阶段b)在4-5的pH和25-27℃的温度下操作。
在预处理步骤结束时，预处理渣料直接地或非直接地在根据本发明的酶混合物的制备阶段b)中用作为诱导碳质底物。
制备阶段b)以连续方式通过以每升介质和每小时0.3至0.8克干物质(优选0.4至0.6克/升/小时，最通常0.5克/升/小时)的速率通过连续加入渣料进行实施，或者以分批进料方式通过每f小时依次添加渣料进行实施，其中f为0.5小时-48小时，加入的渣料量为0.3f-0.8f克干物质/升介质。
这意味着，如果例如每12小时添加一次，则添加的渣料量将为3.6g(即0.3x12)-9.6g(即0.8x12)干物质/升介质，优选为4.8-8.4g干物质/升介质。
根据分批进料的优选实施方式，预处理渣料的添加根据在出口气体中的CO2 mol%的信号和介质的pH测量值进行。CO2的百分比(％)的稳定性为±0.02％(对于为0.5min-1的vvm)(其与0.05单位的pH值增加相结合)或pO2增大至少5％，触发渣料的顺序添加。
事实上，在添加之后，观察到在出口气体中的％CO2增大，这对应于在预处理渣料(主要是木糖和葡萄糖)中存在的可溶性糖的消耗。然后酶攻击纤维素，这将诱导纤维素酶的产生，并且％CO2降低。
当观察到在出口气体中的％CO2停止降低和pH提高超过0.05单位时，进行添加。
pO2(饱和时溶解氧的浓度)信号通常保持高的(在大气压下在液体介质中氧饱和浓度的30％以上)。
当进行该方法时，有利地注意介质的表观粘度在10s-1的剪切速率下保持低于10Pa.s，优选低于1Pa.s。
事实上，粘度对氧的转移有不利影响。这时有必要大大提高耗散功率和/或通气速率以确保转移，这极大地增加了能量消耗并且可能使该方法难以按比例放大到工业规模。
可用于根据本发明的方法中的预处理渣料具有以下特征：
-在用所述恢复至15％的干物质(MS)的渣料的样品进行的酶促水解测试(在50℃和pH 4.8下，使用10mg CELLIC® CTEC2酶(由Novozymes销售)/克MS)中，在96小时后，水解产率大于80％。水解产率是由酶促水解释放的单糖(例如葡萄糖，木糖)的质量除以理论最大质量的比，该理论最大质量在如果预处理产生的所有纤维素、半纤维素和低聚物都被水解时将获得，
-在粘度测试中，以10％MS进行悬浮，该预处理渣料的表观粘度小于1Pa.s，优选小于0.15Pa.s(在剪切速率为10s-1时)。使用来自TA Instrument的AR2000流变仪进行测量，其具有螺旋带状几何形状，如Hénault等人在2014年的文章"Experimental guidelines tooptimize two crucial steps of lignocellulosic bioethanol production: arheological approach"中所描述。
作为预处理渣料的来源的生物质的种类对酶的产生以及对用于处理木质纤维素生物质的生物化学方法的酶促水解性能具有影响。实施例表明芒草比秸秆更具反应性，后者然而在本发明方法中产生高水平的性能。
实施例
这些实施例表明，操作方式和所使用的渣料类型对该方法的性能有影响。
实施例1：以分批方式使用预处理渣料：在实验开始时加入所有渣料。
真菌的预培养在机械搅拌的发酵罐中进行。矿质介质具有以下组成：KOH 1.66g/l、H3PO4 85% 2mL/L、(NH4)2SO4 2.8g/L、 MgSO4.7H20 0.6g/L、CaCl2 0.6g/L、MnSO4 3.2mg/L、ZnSO4.7H2O 2.8mg/L、CoCl2 4.0mg/L、FeSO4.7H2O 10mg/L，玉米浆(Corn Steep)1.2g/L，消泡剂0.5mL/L，并加入5g.L-1的邻苯二甲酸钾，以缓冲pH值。
含有矿质介质的发酵罐在120℃下灭菌20分钟。
用里氏木霉CL847菌株接种发酵罐。
通过使用30g.L-1浓度的葡萄糖作为碳质底物，以进行在预培养中的蘑菇生长。接种物的生长持续2-3天，并在28℃下在培养箱振荡器中进行。
当残留葡萄糖浓度小于15g/L时，进行向纤维素酶制备发酵罐的转移。
通过使用在酸性条件下通过蒸汽爆炸预处理的芒草来进行四个实验以产生酶：
-以10％MS进行2次实验
-以20％MS进行2次实验。
纤维素酶的制备在机械震荡的发酵罐中进行。矿质介质具有以下组成：KOH 1.66g/l、H3PO4 85% 2 mL/L、(NH4)2SO4 2.8 g/L、MgSO4、7H2O 0.6 g/L、CaCl2 0.6 g/L、MnSO43.2 mg/L、ZnSO4.7H2O 2.8 mg/L、CoCl2 4.0 mg/L、FeSO4.7 H2O 10 mg/L、玉米浆(CornSteep)1,2g/L、消泡剂0.5mL/L。
含有矿质介质的发酵罐在120℃下灭菌20分钟。
用里氏木霉CL847菌株的液体预培养物以10％(v/v)的浓度接种发酵罐。将pH调节至5.5。
以20％MS进行的实验是不成功的：没有产生纤维素酶。介质太粘稠和/或含有太多抑制剂。
以10％MS进行的实验在150小时后产生15g/L的蛋白质，即产率为0.1g/L/h。
用在酸性条件下预处理的木质纤维素生物质以分批方式进行蛋白质浓度的演变如图1所示。
实施例2：分批进料方式的实验
进行了五次实验(实验1至5)。
真菌里氏木霉CL847的预培养如在实施例1中进行，但用15g/L的葡萄糖作为唯一的碳质底物。通过以分批进料方式添加预处理渣料，即通过添加以下物质，在24小时后开始纤维素酶制备：
-每12小时加入6克渣料干物质/升介质(实验3，实验4，实验5)，
-12克干物质/升，频率相同(实验1和实验2)。
通过使用三种不同的在酸性条件下通过蒸汽爆炸进行预处理并且原样获得(不进行液体分离)的木质纤维素底物进行该五个实验：
-芒草1响应水解测试和粘度测试(在10s-1的表观粘度等于0.09Pa.s)(实验1和实验5)
-芒草2没有响应水解测试(产率<70％)(实验2和实验3)
-小麦秸秆1响应水解测试和粘度测试(在10s-1的表观粘度等于1.1Pa.s)(实验4)。
水解测试和粘度测试是上面描述的那些。
图1显示了用所述渣料进行的各种实验的蛋白质浓度的变化：
实验1：芒草渣料1-使用为最佳实施方式的渣料量两倍的渣料量进行实施
实验2：芒草渣料2-使用为最佳实施方式的渣料量两倍的渣料量进行实施
实验3：芒草渣料2-所谓的最佳实施方式
实验4：小麦秸秆渣料1-所谓的最佳实施方式
实验5：芒草渣料1-所谓的最佳实施方式。
在实验3、4或5中使用的用于制备纤维素酶的所谓最佳实施方案为如下：
在以15g/L的葡萄糖以分批方式的24小时生长阶段后，每12小时进行芒草渣料的加入，每升介质加入6g干物质。120小时后，根据CO2信号调节添加频率。
实际上，在添加之后，在出口气体中的％CO2增大(图3)，这对应于在预处理渣料(主要是木糖和葡萄糖)中存在的可溶性糖的消耗。然后酶攻击纤维素，这将诱导纤维素酶的产生(图2)，并且％CO2减少。
当观察到在出口气体中的％CO2停止降低和pH升高超过0.05单位时，进行添加。
在整个实验中，pO2信号(以饱和溶解氧的浓度)保持是高时(高于30％)，具有低耗散功率(小于1kW/m3)。
在图1中，当pH值升高和CO2停止下降时，每次添加以6g干物质/升的速度加入渣料。箭头对应于添加渣料的时间。
结果绘制在图2中，并显示了操作方式和使用的渣料类型同时对该方法性能的重要性。
事实上，最佳方法(图2的实验5)使得能够在210小时内获得35g/L的纤维素酶的最终浓度，即制备率为0.17g/L/h。
因此，它比在实施例1中所示的分批方式获得的结果好70％。
使用相同的分批进料速率(最佳操作方式)但使用预处理的秸秆1(响应测试)(实验4)或芒草2(不响应测试)(实验3)的其它实验导致生产率分别比实验5低32％和25％。
使用为最佳速率两倍的分批进料速率进行的实验导致比使用响应测试的预处理芒草1(实验1)或不响应测试的预处理芒草2(实验2)更差的制备性能。
在这些实验中，发现pO2降至10％以下。使用的预处理秸秆在悬浮时具有的材料表观粘度是是芒草的表观粘度的大约12倍，这可以解释pO2的降低。

Claims (10)

1.用于制备纤维素分解酶或半纤维素分解酶的方法，其包括：
-在闭合反应器中，在至少一种浓度为10-90g/l的碳质生长底物存在下，在25-30℃的温度和4-5.5的pH下，纤维素分解微生物的生长阶段a)，所述纤维素分解微生物是里氏木霉(Trichoderma reesei.)种的真菌
-在25-27℃的温度和4-5的pH下的酶制备阶段b)，其中引入至少一种诱导碳质底物，并且阶段b)的介质的表观粘度在10s-1的剪切速率时保持小于10Pa.s
在该方法中
-所述诱导底物是从木质纤维素材料的预处理工艺获得的预处理渣料，预处理是在酸性条件下的蒸汽爆炸，所述渣料未经过酶促水解并以分批进料或连续方式被引入，并且所述预处理渣料由液体和固体形成，并且所述固体含有20-70％的干物质，其20-50％是木质素
-所述渣料具有在96小时后为至少80％的酶促水解产率，所述水解在50℃和pH 4.8下使用10毫克CELLIC® CTEC2酶/克干物质对所述含有15重量％干物质的渣料进行实施，所述 CELLIC® CTEC2 酶是纤维素酶、β-葡糖苷酶和半纤维素酶的混合物，所述产率是通过酶促水解释放的单糖质量除以最大理论质量的比率，所述最大理论质量在如果由预处理产生的所有纤维素，半纤维素和低聚物进行水解时将得到，
-在室温下使所述预处理渣料以10重量％干物质进行悬浮，其在10s-1的剪切速率时具有小于1Pa.s的表观粘度，
-所述渣料以连续方式以每升介质每小时0.3-0.8克干物质的速率被引入；或以分批进料方式被引入，每f小时加入的渣料量为0.3f-0.8f克干物质/升介质，其中f为0.5h-48h。
2.根据权利要求1的方法，其中所述渣料在被引入之前已经洗涤过。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述渣料在被引入之前未经洗涤。
4.根据权利要求1-2中任一项的方法，在阶段b)中在不存在添加糖的情况下进行操作。
5.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述预处理渣料是唯一的诱导底物。
6.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述预处理渣料由液体和固体形成，所述预处理渣料的固体含有30-60重量％的纤维素和1-10重量％的无机化合物和半纤维素，并且液体含有30-80重量％的糖。
7.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中在加入渣料的阶段中，在大气压下在介质中以氧饱和度溶解的氧的pO2浓度保持大于30％。
8.根据权利要求1-2中任一项的方法，其中所述预处理渣料是由木质纤维素生物质的预处理步骤产生的预处理渣料的一部分，将预处理渣料的另一部分引入到在通过所述酶制备方法获得的酶存在下进行的酶促水解步骤中，将得到的水解产物送至乙醇发酵步骤中，使得到的流出物蒸馏以分离乙醇。
9.根据权利要求8的方法，其中所述预处理渣料的所述部分直接用于阶段b)中。
10.根据权利要求8的方法，其中分离在所述预处理渣料的所述部分中所含的液体的一部分或全部，并将所得的渣料引入到阶段b)中。
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