CN102869780A - 用于自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于自含木素纤维素材料产生水解产物的方法，其包括用低温预处理、水解和发酵，其中水解是通过使所述含木素纤维素材料与包含至少10%木聚糖酶酶蛋白w/w%的酶组合物接触进行的。

Description

用于自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法
技术领域
公开了用于自含木素纤维素材料产生发酵产物的方法，并且更具体而言，通过两阶段预处理来增强含木素纤维素材料的酶促水解的方法。
对于序列表的提及
本申请含有计算机可读形式的序列表。所述计算机可读形式通过提述引入本文。
背景技术
含木素纤维素材料或生物质可以用于产生可发酵糖，其继而可以用于产生发酵产物例如可再生燃料和化学品。含木素纤维素材料是包裹在木质素和半纤维素鞘中的纤维素纤维的复杂结构。自含木素纤维素材料产生发酵产物包括预处理、水解和发酵含木素纤维素材料。
木素纤维素的结构不是酶促水解能够直接接近的。因此，对木素纤维素进行预处理，以便破裂木质素密封且破坏纤维素的晶状结构。这可能引起半纤维素级分的增溶和糖化。随后可以将纤维素级分酶促水解，例如通过纤维素分解酶，所述纤维素分解酶将碳水化合物聚合物降解成可发酵糖。这些可发酵糖随后通过发酵生物转化成所需发酵产物，所述产物可以任选地例如通过蒸馏进行回收。
自含木素纤维素材料产生发酵产物目前是非常昂贵的。因此，需要提供用于自含木素纤维素材料产生发酵产物的进一步的工艺。
发明概述
本发明涉及用于自含木素纤维素材料产生水解产物的方法，其包括在相对低的温度预处理含木素纤维素材料，随后用包含高比例木聚糖酶的酶组合物水解。
相应地，在一个方面，本发明涉及用于产生木素纤维素材料的水解产物的工艺，其包括(a)对所述木素纤维素材料实施在165℃–175℃之间的温度的预处理，(b)对经预处理的木素纤维素材料实施水解酶的作用以产生水解产物，其中所述水解酶包含纤维素分解酶(cellulytic enzyme)和木聚糖酶，所述木聚糖酶以总量水解酶蛋白的至少10%的量存在。
本发明的一个优点包括含木素纤维素材料的可消化性得到显著改善，因此降低用于自含木素纤维素材料产生发酵产物的成本。
附图简述
图1显示使用表2中所示的水解酶的12种不同组合物在2个不同温度预处理的玉米秸秆的水解结果。
发明详述
含木素纤维素材料
“木素纤维素”或“含木素纤维素材料”意指主要由纤维素、半纤维素和木质素组成的材料。此类材料通常称为“生物质”。
生物质是包裹在木质素和半纤维素鞘中的纤维素纤维的复杂结构。生物质的结构使得它对于酶促水解并不易感。为了增强酶促水解，生物质必须进行预处理，以便破裂木质素密封，且溶解半纤维素，且破坏纤维素的晶状结构。纤维素随后可以进行酶促水解，例如通过纤维素分解酶处理，以将碳水化合物聚合物转化成可发酵糖，其可以发酵成所需发酵产物，例如乙醇。半纤维素分解酶处理也可以用于水解预处理的生物质中的任何剩余的半纤维素。
生物质可以是含有木素纤维素的任何材料。在一个优选实施方案中，生物质含有至少约30重量%、优选至少约50重量%、更优选至少约70重量%、甚至更优选至少约90重量%木素纤维素。
生物质一般例如在植物的茎、叶、皮、壳(hull,husk)和穗轴或树的叶、枝和木材中发现。生物质包括但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、市政固体废物、废纸以及浆和造纸厂残余物。应当理解生物质可以是在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。生物质可以进一步含有组成成分，例如蛋白质性材料、淀粉、和糖例如可发酵糖或不可发酵糖、或它们的混合物。
合适生物质的其他例子包括玉米纤维、稻草、松材、木屑(wood chip)、甘蔗渣、纸和浆加工废物、玉米秸秆、玉米穗轴、硬木材例如白杨木(poplar)和桦木(birch)、软木材、谷类稻草(cereal straw)例如麦秸、稻草(rice straw)、柳枝稷、芒属(Miscanthus)、稻壳、市政固体废物(MSW)、工业有机废物、办公室用纸、或它们的混合物。
在一个优选实施方案中，生物质选自玉米秸秆、玉米穗轴、玉米纤维、柳枝稷、麦秸、稻草(rice straw)和甘蔗渣及其组合。
预处理
根据本发明，生物质在水解前进行化学、机械、生物学或其任何组合的预处理。此外，化学、机械或生物学处理可以与水解同时进行，例如与一种或多种纤维素分解酶的添加或其他酶活性同时，以释放例如可发酵糖例如葡萄糖或麦芽糖。
预处理的目的是分离或释放纤维素、半纤维素和木质素，并且因此改善水解和/或发酵的速率或效率。生物质可以在预处理过程中以约10-80之间的干固体重量%、优选约20-70之间的干固体重量%、尤其是约30-60之间的干固体重量%例如在约干固体50重量%左右的量存在。
根据本发明，预处理在相对低的温度进行，优选在165℃-175℃之间，特别是从165℃、166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃或174℃一直到166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃、174℃或175℃。
在其中温度通常是约180°的常规生物质预处理过程中，出现半纤维素组分的广泛降解。从含木素纤维素材料中释放的木聚糖降解为木糖，并且木糖可以进一步降解为化合物，其可以是酶促水解和/或发酵的抑制剂。木糖的降解产物包括但不限于糠醛、羟甲基糠醛(HMF)、甲醛、甲酸、乙醛、巴豆醛、乳酸、二羟基丙酮、甘油醛、丙酮醛、丙酮醇和羟乙醛。不受任何具体理论束缚，认为在用本发明相对低的温度的预处理下，含木素纤维素材料的结构被打开，但木聚糖仅部分降解。因为较少的木聚糖被降解，所以抑制剂较少程度地产生，并且可以省略洗涤步骤。
化学预处理
术语“化学预处理”指促进纤维素、半纤维素或木质素的分离或释放的任何化学预处理。合适的化学预处理方法的例子包括用例如稀酸、石灰、有机溶剂、二氧化硫或二氧化碳处理。进一步地，湿氧化和pH控制的水热解也是考虑的化学预处理。
在一个优选实施方案中，化学预处理是酸处理，更优选地连续稀酸和/或弱酸处理，例如用硫酸或另一种有机酸和/或无机酸处理，所述酸例如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢或其混合物。还可以使用其他酸。弱酸处理意指处理pH处于约pH 1-5的范围中，优选约pH 1-3。
在一个优选实施方案中，预处理是用0.1-2.5重量%酸、优选0.5-2.0重量%酸、优选0.8-1.5重量%酸的酸预处理。用于第二次预处理的酸可以是盐酸、磷酸、硫酸、亚硫酸、碳酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、琥珀酸和/或其混合物；尤其是硫酸。酸可以与生物质和混合物接触范围为数分钟到数秒的时期。在本发明的一个优选实施方案中，预处理进行1分钟-60分钟的时期。
根据本发明还考虑了其他化学预处理技术。还已显示当木素纤维素结构被破坏时，酶促水解可以得到极大增强。臭氧、有机溶剂(organosolv)(使用在含水醇中的(Al)2SO4、FeCl3、路易斯酸)、甘油、二噁烷、苯酚或乙二醇属于已知的破坏纤维素结构且促进水解的溶剂(Mosier等人，2005，BioresourceTechnology 96：673-686)。
合适预处理方法的其他例子由下述描述：Schell等人，2003，Appl.Biochem and Biotechn.第105-108卷，第69-85页，和Mosier等人，2005，Bioresource Technology 96：673-686，和美国申请公开号2002/0164730，将所述各篇参考文献在此通过提述并入。
机械预处理
术语“机械预处理”指促进自生物质分离或释放纤维素、半纤维素或木质素的任何机械或物理预处理。例如，机械预处理包括多个类型的研磨、照射、汽蒸/蒸汽爆炸、和水热解(hydrothermolysis)。
机械预处理包括粉碎，即大小的机械减少。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨。机械预处理可以涉及高压和/或升高的温度(蒸汽爆炸)。“高压”意指在约300-600psi范围中、优选400-500psi，例如约450psi的压力。升高的温度意指在从约165℃一直到175℃范围中、优选约170℃的温度。在一个优选实施方案中，本发明的预处理作为在170℃的温度的蒸汽爆炸进行。在一个优选实施方案中，机械预处理是用蒸汽枪水解仪系统的分批工艺，其使用如上定义的压力和温度。Sunds Hydrolyzer(可从Sunds Defibrator AB(瑞典)获得)可以用于此。
生物学预处理
术语“生物学预处理”指任何促进自生物质分离或释放纤维素、半纤维素或木质素的生物学预处理。生物学预处理技术可以涉及应用木质素溶解微生物。参见例如，Hsu，T.-A.，1996，Pre-treatment of biomass，于Handbook onBioethanol：Production and Utilization，Wyman，C.E.，编辑，Taylor&Francis，Washington，DC，179-212；Ghosh，P.和Singh，A.，1993，Physicochemical andbiological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosicbiomass，Adv.Appl.Microbiol.39：295-333；McMillan，J.D.，1994，Pre-treatinglignocellulosic biomass：a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for FuelsProduction，Himmel，M.E.，Baker，J.O.和Overend，R.p.，编辑，ACS SymposiumSeries 566，American Chemical Society，Washington，DC，第15章；Gong，C.S.，Cao，N.J.，Du，J.和Tsao，G.T.，1999，Ethanol production from renewable resources，于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，Scheper，T.，编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，Germany，65：207-241；Olsson，L.和Hahn-Hagerdal，B.，1996，Fermentation of lignocellulosic hydrolyzates for ethanolproduction，Enz.Microb.Tech.18：312-331；以及Vallander，L.和Eriksson，K.-E.L.，1990，Production of ethanol from lignocellulosic materials：State of the art，Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42：63-95。
水解
在水解过程中，将经预处理的生物质(优选以生物质浆料的形式)酶促水解且降解成可发酵糖或其他有用的化合物。如本文使用的，术语“生物质浆料”指经历酶促水解的水性生物质材料。生物质浆料通过混合生物质，例如玉米秸秆、甘蔗渣等与水、缓冲液和其他预处理材料产生。生物质浆料可以在水解前进行预处理，或所述浆料可以由经预处理的生物质形成。
在水解过程中干固体含量可以在约5-50重量%、优选约10-40重量%、优选约20-30重量%的范围中。在一个优选实施方案中，水解可以作为分批补料工艺进行，其中将经预处理的生物质(即底物)逐步补料给例如含酶水解溶液。
根据本发明，水解和/或发酵使用纤维素分解酶和木聚糖酶进行。
在一个优选实施方案中，水解使用包含具有纤维素分解增强活性的一种或多种多肽的纤维素分解酶制备物进行。在一个优选实施方案中，具有纤维素分解增强活性的一种或多种多肽是家族GH61A来源的。合适和优选的纤维素分解酶制备物和具有纤维素分解增强活性的多肽的例子在下文进一步描述。
因为生物质可能含有除木质素、纤维素和半纤维素外的组成成分，所以水解和/或发酵可以在另外的酶活性的存在下进行，所述另外的酶活性选自蛋白酶、淀粉酶、酯酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维二糖酶、木聚糖酶、木糖异构酶、α-淀粉酶、α-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶及其混合物。
酶促水解优选在可以由本领域技术人员容易地确定的条件下在合适的含水环境中进行。在一个优选实施方案中，水解在用于所讨论的一种或多种酶的合适的、优选最佳的条件下进行。
优选地，水解在25℃-70℃之间、优选在40℃-60℃之间、尤其是约50℃的温度进行。水解优选在pH3-8范围中的pH、优选pH4-6、尤其是约pH5进行。此外，水解一般进行12–96小时之间、优选16–72小时、更优选24-48小时之间。
合适的工艺时间、温度和pH条件可以由本领域技术人员容易地确定。
发酵
通过能够将糖例如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或间接发酵成所需发酵产物的一种或多种发酵生物，可以发酵来自经预处理的和/或水解的生物质的可发酵糖。发酵条件取决于所需发酵产物和发酵生物，并且可以由本领域普通技术人员容易地确定。
尤其是在乙醇发酵的情况下，发酵可以进行1-72小时之间。在一个实施方案中，发酵在约20℃-40℃之间、优选25℃-40℃、更优选约30℃-约38℃、特别是约32℃的温度进行。在一个实施方案中，pH是5以上。在另一个实施方案中，pH是约pH3-7、优选约pH4-6、尤其是4-5之间。
发酵可以在分批、分批补料或连续反应器进行。分批补料发酵可以是固定体积或可变体积分批补料。在一个实施方案中，采用分批补料发酵。分批补料发酵的体积和速率取决于例如发酵生物、可发酵糖的特性和浓度、和所需发酵产物。此类发酵的速率和体积可以由本领域普通技术人员容易地确定。
发酵生物
术语“发酵生物”指适合于产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。尤其合适的发酵生物能够将糖例如葡萄糖直接或间接发酵，即转化成所需发酵产物。发酵生物的例子包括真菌生物，尤其是酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)菌株；毕赤酵母属(pichia)菌株，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)，例如树干毕赤酵母CBS 5773；假丝酵母属(Candida)菌株，特别是产朊假丝酵母(Candida utilis)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)或博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)菌株。其他发酵生物包括发酵单胞菌属(Zymomonas)；汉逊酵母属(Hansenula)，特别是异常汉逊酵母(H.anomala)；克鲁维酵母属(Klyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(S.pombe)菌株。
商购可得的酵母包括，例如，ETHANOL REDTM酵母(可从Fermentis/Lesaffre，USA获得)，FALITM(可从Fleischmann’s Yeast，USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(可从Ethanol Technology，WI，USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American BioproductsCorporation，GA，USA获得)，GERT STRAND(可从Gert Strand AB，瑞典获得)，和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。
根据本发明，优选的发酵生物能够将C5糖例如木糖转化为所需发酵生物。
发酵产物
本发明可以用于产生任何发酵产物。优选的发酵产物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；氨基酸(例如谷氨酸)；气体(例如H2和CO2)；抗生素(例如青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。
其他产物包括可消耗的醇工业产品，例如啤酒和葡萄酒；乳品工业产品，例如发酵乳制品；皮革工业产品和烟草工业产品。在一个优选实施方案中，发酵产物是醇，尤其是乙醇。根据本发明获得的发酵产物例如乙醇可以优选用作燃料酒精/乙醇。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。
SSF、HHF和SHF
根据本发明，水解和发酵可以同时(SHHF工艺)或连续(SHF工艺)进行。
水解和发酵可以作为同时水解和发酵步骤、或同时糖化作用和发酵(SSF)进行。一般而言，这意指组合/同时水解和发酵在对于所讨论的一种或多种发酵生物合适的、优选最佳的条件(例如温度和/或pH)下进行。
水解步骤和发酵步骤可以作为混合(hybrid)水解和发酵(HHF)进行。HHF一般以分开的部分水解步骤开始且以同时水解和发酵步骤结束。分开的部分水解步骤是通常在对于所讨论的一种或多种水解酶合适的、优选最佳的条件(例如在更高温度)下进行的酶促纤维素糖化步骤。后续同时水解和发酵步骤通常在对于一种或多种发酵生物合适的条件下(通常在比分开的水解步骤更低的温度)进行。
水解和发酵步骤还可以作为分开的水解和发酵进行，其中使水解在发酵起始前完成。这通常称为“SHF”。
回收
在发酵后，发酵产物可以任选以任何合适方式与发酵培养基分离。例如，培养基可以进行蒸馏以提取发酵产物，或发酵产物可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取。可替代地，发酵产物可以通过汽提(stripping)进行回收。回收方法是本领域众所周知的。
组合物
本发明涉及包含纤维素分解酶和木聚糖酶的水解酶的组合物，其中所述木聚糖酶以总量水解酶蛋白质的至少10%的量存在。纤维素分解酶可以包含衍生自里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶系统。
木聚糖酶优选是GH10木聚糖酶。木聚糖酶可以以水解酶蛋白总量的至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少20%或甚至至少25%的量存在。
优选地，水解酶包含以水解酶蛋白总量的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%或甚至至少5%、例如至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少15%、至少20%或甚至至少25%的量的β-葡糖苷酶。
组合物可以进一步包含家族61糖苷水解酶，且优选以水解酶蛋白总量的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少15%、至少20%或甚至至少25%的量存在。
组合物可以依照本领域已知的方法进行制备，并且可以以液体或干组合物的形式。例如，多肽组合物可以以颗粒或微粒的形式。待包括在组合物中的多肽可以依照本领域已知的方法进行稳定。
下文给出本发明的组合物的优选用途的例子。本发明的多肽组合物的剂量和在其下使用组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法进行测定。
用途
本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，包括：用本发明包含有效量的具有内切葡聚糖酶活性的多肽的组合物处理纤维素材料。在一个优选方面，该方法进一步包括回收降解或转化的纤维素材料。
本发明的多肽和宿主细胞可以在单糖、二糖和多糖的产生中用作来自纤维素生物质的化学或发酵原料用于产生乙醇、塑料或其他产物或中间产物。包含具有内切葡聚糖酶活性的多肽的组合物可以以去除或不去除细胞的粗发酵液的形式或以半纯化或纯化的酶制备物的形式。可替代地，组合物可以包含本发明的宿主细胞作为在用生物质的发酵工艺中具有内切葡聚糖酶活性的多肽来源。宿主细胞还可以含有在生物质的加工中有用的上文提及的编码其他蛋白质和酶的天然或异源基因。特别地，本发明的多肽和宿主细胞可以通过纤维素或半纤维素的部分或完全降解用于增加加工残余物(干酒糟、来自酿造的酒糟、甘蔗蔗渣等)的价值。
酶
即使在本发明的方法或工艺的背景中未具体提及，但应当理解一种或多种酶以及其他化合物以有效量使用。可以使用一种或多种酶。
纤维素分解酶
如本文使用的，术语“纤维素分解酶”或术语“纤维素分解酶制备物”或术语“具有纤维素分解活性的酶”应理解为包含具有纤维二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)，例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II，以及内切葡聚糖酶活性(EC 3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(EC 3.2.1.21)的酶。在一个优选实施方案中，纤维素分解酶可以包含真菌来源的酶制备物，例如木霉属(Trichoderma)菌株，优选里氏木霉菌株；腐质霉属(Humicola)菌株，例如特异腐质霉(Humicola insolens)菌株；或金孢子属(Chrysosporium)菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。
纤维素分解酶制备物可以包含可从Novozymes A/S，丹麦或ACCELERASETM 1000(来自Genencor Inc.，USA)获得的商购可得的产物
Figure BDA00001794167100101
1.5L或CELLUZYMETM。
纤维素分解酶可以以0.1-100FPU/克总固体(TS)、优选0.5-50FPU/克TS、尤其是1-20FPU/克TS的范围投入。在另一个实施方案中，将至少0.1mg纤维素分解酶/克总固体(TS)、优选至少3mg纤维素分解酶/克TS、例如5–10mg一种或多种纤维素分解酶/克TS用于水解。
内切葡聚糖酶(EG)
一种或多种内切葡聚糖酶可以存在于水解过程中。术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(EC编号3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉中的1,4-β-D-糖苷键、在混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维质组分的其他植物材料中的β-1,4键的内水解。根据Ghose，1987，Pure andAppl.Chem.59：257-268的程序，内切葡聚糖酶活性可以使用羧甲基纤维素(CMC)水解进行测定。
内切葡聚糖酶可以衍生自木霉属菌株，优选里氏木霉菌株；腐质霉属菌株，例如特异腐质霉菌株；或金孢子属菌株，优选Chrysosporium lucknowense菌株。
β-葡糖苷酶
一种或多种β-葡糖苷酶可以存在于水解过程中。术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(EC 3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，伴随β-D-葡萄糖的释放。为了本发明的目的，β-葡糖苷酶活性根据由Venturi等人，2002，J.Basic Microbiol.42：55-66描述的基本程序进行测定，除如本文描述的采用不同条件外。β-葡糖苷酶活性的1个单位定义为由在100mM柠檬酸钠、
Figure BDA00001794167100102
20中作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷在50℃、pH 5每分钟产生的1.0微摩尔对硝基苯酚
β-葡糖苷酶可以是真菌来源的，例如木霉属、曲霉属(Aspergillus)或青霉属(Penicillium)菌株。β-葡糖苷酶可以衍生自里氏木霉，例如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的图1)。β-葡糖苷酶可以衍生自米曲霉(Aspergillus oryzae)(根据WO 2002/095014在米曲霉中重组产生的)、烟曲霉(Aspergillus  fumigatus)(根据WO 2002/095014的实施例22在米曲霉中重组产生的)或黑曲霉(Aspergillus niger)(1981，J.Appl.第3卷，第157-163页)。
β-葡糖苷酶可以衍生自巴西青霉(Penicillium brasilianum)，例如在WO2009/111706中显示为SEQ ID NO:2的β-葡糖苷酶。
纤维二糖水解酶(CBH)
一种或多种纤维二糖水解酶可以存在于水解过程中。术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中1,4-β-D-葡糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖。
纤维二糖水解酶的例子在上文提及，包括来自里氏木霉；特异腐质霉的CBH I和CBH II和来自土生梭孢壳(Thielavia terrestris)纤维二糖水解酶(CELL6A)的CBH II。
纤维二糖水解酶活性可以根据由Lever等人，1972，Anal.Biochem.47：273-279和Tilbeurgh等人，1982，FEBS Letters 149：152-156；van Tilbeurgh和Claeyssens，1985，FEBS Letters 187：283-288描述的程序进行测定。Lever等人的方法适合于评估玉米秸秆中纤维素的水解，并且van Tilbeurgh等人的方法适合于测定对荧光二糖衍生物的纤维二糖水解酶活性。
家族61糖苷水解酶
家族61糖苷水解酶：根据Henrissat B.，1991，A classification of glycosylhydrolases based on amino-acid sequence similarities，Biochem.J.280：309-316，以及Henrissat B.和Bairoch A.，1996，Updating the sequence-based classificationof glycosyl hydrolases，Biochem.J.316：695-696以及www.cazy.org，术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”在本文中定义为属于糖苷水解酶家族61的多肽。目前，Henrissat将GH61家族列为未分类的，指出对于属于这个家族的多肽未知的性质，例如机制、催化亲核基团/碱基、催化质子供体和3-D结构。在本发明的背景中，家族61糖苷水解酶具有“纤维素分解增强活性”。
术语“纤维素分解增强活性”在本文中定义为增强纤维素材料通过具有纤维素分解活性的蛋白质的水解的生物学活性。为了本发明的目的，通过在下述条件下测量来自纤维素材料通过纤维素酶蛋白的水解的还原糖的增加或纤维二糖和葡萄糖总共的增加来测定纤维素分解增强活性：在PCS中的1-50mg总蛋白质/g纤维素，其中总蛋白质包含在PCS中的80-99.5%w/w纤维素酶蛋白/g纤维素和0.5-20%w/w具有纤维素分解增强活性的蛋白质在50℃进行1-7天，与具有不含纤维素分解增强活性的相等总蛋白质载量的对照水解比较(在PCS中的1-50mg纤维素分解蛋白质/g纤维素)。在一个优选方面，将在纤维素酶蛋白质载量的3%总蛋白质重量米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO2002/095014在米曲霉中重组产生的)或3%总蛋白质重量烟曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 2002/095014的实施例22在米曲霉中重组产生的)存在下的1.5L(Novozymes A/S，Bagsvaerd，丹麦)的混合物用作纤维素分解活性的来源。
半纤维素酶
半纤维素可以通过半纤维素酶和/或酸水解进行分解，以释放其五和六碳糖组分。根据本发明，预处理的木素纤维素材料用一种或多种半纤维素酶包括至少一种木聚糖酶(EC 3.2.1.8)进行处理。
用于在本发明中使用的木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶，并且可以是糖苷水解酶家族10或11(GH10或GH11)。GH10或GH11在Cantarel等人(2008)的Nucl.Acids Res.200937：D233-D238中和在www.cazy.org上定义。
木聚糖酶可以是任何来源的，包括哺乳动物、植物或动物来源；然而，优选木聚糖酶是微生物来源的。特别地，木聚糖酶可以是可衍生自丝状真菌或酵母的那种。优选地，木聚糖酶衍生自丝状真菌例如曲霉属菌种(Aspergillus sp.)、芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)、腐质霉属菌种(Humicola sp.)、毁丝霉属菌种(Myceliophotora sp.)、Poitrasia sp.、根毛霉属菌种(Rhizomucor sp.)或木霉属。
优选的是木聚糖酶GH10木聚糖酶。合适的GH10木聚糖酶可以衍生自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)，例如作为木聚糖酶II公开于WO 1994/021785的SEQ ID NO:2中的酶。还优选的是与WO 1994/021785的SEQ ID NO:2中和/或在本文中作为SEQ ID NO:1显示的氨基酸序列具有至少50%同一性、至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、至少90%同一性、至少95%同一性、或甚至至少99%同一性的木聚糖酶。
商业木聚糖酶的例子包括来自Novozymes A/S，丹麦的SHEARZYMETM和BIOFEED WHEATTM。
根据本发明，木聚糖酶以水解酶蛋白总量的至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%或甚至至少25%的量加入和/或存在于本发明的水解步骤中。
木聚糖酶以0.001-1.0g/kgDS底物的量、优选以0.005-0.5g/kg DS底物的量、且最优选以0.05-0.10g/kg DS底物的量加入和/或存在于本发明的水解步骤中。
半纤维素酶必须以有效水解半纤维素的量加入，例如以约0.001-0.5重量%总固体(TS)、更优选地约0.05-0.5重量%TS的量。
木聚糖酶可以以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物的量、优选以0.005-0.5g/kg DM底物的量、且最优选0.05-0.10g/kg DM底物加入。
其他优选的半纤维素酶包括阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、内切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、内切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶、及它们中两种或更多种的混合物。优选地，用于在本发明中使用的半纤维素酶是外切作用的半纤维素酶，并且更优选地，半纤维素酶是这样的外切作用的半纤维素酶，其具有在低于pH7、优选pH3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力。适合于在本发明中使用的半纤维素酶的例子包括VISCOZYMETM(可从Novozymes A/S，丹麦获得)。
木糖异构酶
木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C.5.3.1.5.)是催化D-木糖至D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。
木糖异构酶可以用于该方法或工艺中，并且可以是具有木糖异构酶活性的任何酶，并且可以衍生自任何来源，优选细菌或真菌来源，例如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的例子包括属于链霉菌属(Streptomyces)、游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属和黄杆菌属(Flavobacterium)和栖热袍菌属(Thermotoga)的那种，包括新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等人，1995，Appl.Environ.Microbiol.61(5)，1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)。真菌木糖异构酶的例子是担子菌纲(Basidiomycetes)的衍生菌种。
优选木糖异构酶衍生自酵母属假丝酵母属(Candida)菌株，优选博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)菌株，尤其是由例如Vongsuvanlert等人，1988，Agric.Biol.Chem.，52(7)：1817-1824公开的博伊丁假丝酵母木糖异构酶。木糖异构酶可以优选衍生自博伊丁假丝酵母菌株(Kloeckera 2201)，作为DSM 70034和ATCC 48180保藏，公开于Ogata等人，Agric.Biol.Chem，第33卷，第1519-1520页或Vongsuvanlert等人，1988，Agric.Biol.Chem，52(2)，第1519-1520页中。
在一个实施方案中，木糖异构酶衍生自链霉菌属菌株，例如衍生自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)(美国专利号4,687,742)；黄微绿链霉菌(S.fiavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、S.echinatus、威德摩尔链霉菌(S.wedmorensis)菌株，都公开于美国专利号3,616,221中。其他木糖异构酶公开于美国专利号3,622,463、美国专利号4,351,903、美国专利号4,137,126、美国专利号3,625,828、HU专利号12,415、DE专利2,417,642、JP专利号9,28,473和WO 2004/044129中，其各自通过提述并入本文。木糖异构酶可以以固定化的或液体的形式。液体形式是优选的。商购可得的木糖异构酶的例子包括来自Novozymes A/S，丹麦的SWEETZYMETM T。木糖异构酶以提供在0.01-100IGIU/克总固体范围中活性水平的量加入。
α-淀粉酶
可以使用一种或多种α-淀粉酶。优选的α-淀粉酶是微生物例如细菌或真菌来源的。最合适的α-淀粉酶基于工艺条件进行测定，但可以通过本领域技术人员容易地完成。
优选的α-淀粉酶可以是酸性α-淀粉酶，例如真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。术语“酸性α-淀粉酶”意指以有效量加入的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)具有在3-7、优选3.5-6或更优选4-5范围中的pH下的最适活性。
根据本发明，酸性α-淀粉酶可以以0.1-10AFAU/g DS、优选0.10-5AFAU/g DS、尤其是0.3-2AFAU/g DS的量加入。
包含α-淀粉酶的优选商业组合物包括MYCOLASE(来自DSM)、BANTM、TERMAMYLTM SC、FUNGAMYLTM、LIQUOZYMETM X和SANTM SUPER、SANTM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASETM L-40,000、DEX-LOTM、SPEZYMETM FRED、SPEZYMETM AA和SPEZYMETM DELTA AA(GenencorInt.)，和以商品名SP288(可从Novozymes A/S、丹麦获得)销售的酸性真菌α-淀粉酶。
蛋白酶
蛋白酶可以在水解、发酵或同时水解和发酵过程中加入。蛋白酶可以在发酵过程中加入，以反絮凝发酵生物尤其是酵母。蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，蛋白酶是微生物来源的，优选真菌或细菌来源的酸性蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是优选的，但还可以使用其他蛋白酶。
合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，特征在于在低于pH7的酸性条件下水解蛋白质的能力的蛋白酶。
考虑的酸性真菌蛋白酶包括衍生自曲霉菌属、毛霉属(Mucor)、根霉菌属(Rhizopus)、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、青霉属、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。尤其考虑的是衍生自黑曲霉(参见例如，Koaze等人，1964，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、佐氏曲霉(Aspergillus saitoi)(参见例如，Yoshida，1954，J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)(Hayashida等人，1977，Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933、棘孢曲霉(WO 1995/02044)、或米曲霉的蛋白酶，例如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucor pusillus)或米赫毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
还考虑的是中性或碱性蛋白酶，例如衍生自芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。例如，考虑用于本发明的蛋白酶衍生自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且具有在Swissprot作为登记号P06832可获得的序列。还考虑的是与在Swissprot作为登记号P06832可获得的氨基酸序列具有至少90%同一性的蛋白酶，例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或特别是至少99%同一性。
进一步考虑的是与在WO 2003/048353中作为SEQ ID NO:1公开的金黄色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)蛋白酶具有至少90%同一性，例如至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或特别是至少99%同一性。
还考虑的是木瓜蛋白酶样蛋白酶，例如在E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶)、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶)、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(caricain)。
在一个实施方案中，蛋白酶可以是衍生自曲霉菌属菌株例如米曲霉的蛋白酶制备物。在另一个实施方案中，蛋白酶可以衍生自根毛霉属菌株，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor meihei)。在另一个相关实施方案中，蛋白酶可以是蛋白酶制备物，优选衍生自曲霉属菌株例如米曲霉的蛋白水解制备物、和衍生自根毛霉属菌株优选曼赫根毛霉的蛋白酶的混合物。
天冬氨酸蛋白酶例如在Hand-book of Proteolytic Enzymes，由A.J.Barrett，N.D.Rawlings和J.F.Woessner编辑，Aca-demic Press，San Diego，1998，第270章)中描述。天冬氨酸蛋白酶的合适例子包括例如公开于R.M.Berka等人，Gene，96，313(1990))；(R.M.Berka等人，Gene，125，195-198(1993))；和Gomi等人，Biosci.Biotech.Biochem.57，1095-1100(1993)中的那些，所述参考文献通过提述并入本文。
商购可得的产品包括
Figure BDA00001794167100161
ESPERASETM、FLAVOURZYMETM、PROMIXTM、
Figure BDA00001794167100162
NOVOZYMTM FM 2.0L和NOVOZYMTM 50006(可从Novozymes A/S、丹麦获得)以及来自Genencor Int.、Inc.、USA的GC106TM和SPEZYMETM FAN。
蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白质/g DS、优选0.001-0.1mg酶蛋白质/gDS的量存在。可替代地，蛋白酶可以以0.0001-1LAPU/g DS、优选0.001-0.1LAPU/g DS和/或0.0001-1mAU-RH/g DS、优选0.001-0.1mAU-RH/g DS的量存在。
脂肪分解酶
脂肪分解酶是能够水解羧酸酯键的酶，以释放羧酸或羧酸盐(EC 3.1.1)。所述脂肪分解酶主要包含下述3个亚型：半乳糖脂酶(EC 3.1.1.26)、磷脂酶(A1或A2，EC 3.1.1.32或3.1.1.4)和三酰基甘油脂酶(EC 3.1.1.3)，占优势地分别具有对于半乳糖脂、磷脂和甘油三酯的活性。活性可以通过任何合适方法进行测定，例如通过本领域已知的或本说明书中随后描述的测定。
脂肪分解酶可以具有窄的特异性，对于3种底物之一具有活性而对于其他2种具有很少活性或无活性，或它可以具有更广泛的特异性，对于一种底物具有占优势活性而对于其他2种底物具有较少活性。可以使用2种或更多种脂肪分解酶的组合。
脂肪分解酶可以是原核的，特别是细菌的，或真核的，例如来自真菌或动物来源。脂肪分解酶可以衍生自例如下述属或种：嗜热丝孢菌属(Thermomyces)，疏棉状嗜热丝孢菌(T.Lanuginosus)(也称为柔毛腐质霉(Humicola Ianuginosa))；腐质霉属，特异腐质霉；镰孢属(Fusarium)，尖镰孢(F.oxysporum)、茄病镰孢(F.solani)、异孢镰孢(F.heterosporum)；曲霉属，塔宾曲霉(A.tubigensis)、黑曲霉、米曲霉；根毛霉属；假丝酵母属，南极假丝酵母(C.antarctica)、皱褶假丝酵母(C.rugosa)，青霉属，卡门柏青霉(P.camembertii)；根霉属，米根霉(Rhizopus oryzae)；犁头霉属(Absidia)，网柄菌属(Dictyostelium)，毛霉属，脉孢菌属(Neurospora)，根霉属，少根根霉(R．arrhizus)、日本根霉(R.japonicus)，核盘菌属(Sclerotinia)，发癣菌属(Trichophyton)，维氏核盘菌属(Whetzelinia)，芽孢杆菌属，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，肠杆菌属(Enterobacter)，爱德华氏菌属(Edwardsiella)，欧文氏菌属(Erwinia)，埃希氏菌属(Escherichia)，大肠杆菌(E.coli)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，变形杆菌属甲(Proteus)，普罗菲登斯菌属(Providencia)，沙门氏菌属(Salmonella)，沙雷氏菌属(Serratia)，志贺氏菌属(Shigella)，链霉菌属，耶尔森氏菌属(Yeersinia)，假单胞菌属(Pseudomonas)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)。
本文描述且请求保护的本发明并不限于本文公开的具体实施方案的范围中，因为这些实施方案预期作为本发明的几个方面的举例说明。任何等价实施方案以及一个或多个实施方案的组合预期在本发明的范围内。本发明的多种修饰加上本文显示且描述的那些根据前述说明书对于本领域技术人员将变得显而易见的。此类修饰也预期属于所附权利要求书的范围。
本文引用了多个参考文献，将其公开内容通过提述整体引入。本发明通过下述实施例进一步描述，所述实施例不应解释为限制本发明的范围。
材料与方法
同一性的测定
在2个氨基酸序列之间或在2个核苷酸序列之间的关联性由参数“同一性”描述。
为了本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443-453)测定在2个氨基酸序列之间的序列同一性程度，如在EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open SoftwareSuite，Rice等人，2000，Trends Genet.16：276-277)的Needle程序中所执行的，优选版本3.0.0或更新的版本。使用的可选参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”(使用–nobrief选项获得的)的Needle的输出用作同一性百分比，并且如下计算：
(相同残基x 100)/(比对长度–比对中的缺口总数)
为了本发明的目的，在2个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)进行测定，如EMBOSS包(EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，同上)中的Needle程序所执行的，优选版本3.0.0或更新的版本。使用的任选参数是缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得的)的Needle的输出用作同一性百分比，并且如下计算：
(相同脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的缺口总数)
酶
包含衍生自里氏木霉的纤维素分解酶复合物，在WO2005074656中作为SEQ ID NO：2的氨基酸23-250显示的具有纤维素分解增强活性(GH61A)的金黄色嗜热子囊菌多肽，和在WO05047499中作为SEQ ID NO：2的氨基酸1-863显示的烟曲霉β-葡糖苷酶的纤维素酶制备物C。
包含在WO9421785的SEQ ID NO:2中作为Xyl II和在本文中作为SEQ IDNO:1公开的棘孢曲霉木聚糖酶的制备物。
包含在WO2005074656中作为SEQ ID NO：2的氨基酸23-250显示的具有纤维素分解增强活性(GH61A)的金黄色嗜热子囊菌多肽的制备物。
包含在WO 2009/111706作为SEQ ID NO：2显示的巴西青霉β-葡糖苷酶的制备物。
实施例
实施例1
预处理：将玉米秸秆在1.13wt.%H2SO4溶液中在环境温度浸泡4小时。对玉米秸秆实施分别在170℃和180℃的蒸汽爆炸5.5分钟。分析经预处理的玉米秸秆(PCS)的组成，并且结果显示于表1中。
对2批PCS测试了酶组合物1-12(表2)。在具有12.6%起始TS、20g总重量的系统中评价了所述PCS的水解。酶剂量是5mg酶蛋白质/g纤维素。水解时间是72小时，伴随在50℃和pH5.0的130rpm。通过HPLC分析水解产物中的葡萄糖含量。纤维素转化按照从PCS中的总葡萄糖潜能(potential)中产生的葡萄糖的百分比计算。所有处理以3次重复进行。结果显示于图1中。
用高木聚糖酶剂量处理显示出对于在低温预处理的生物质的改善的水解。未见到高木聚糖酶剂量对于在高温预处理的生物质的效应。
Figure BDA00001794167100191
Figure BDA00001794167100192
Figure BDA00001794167100201
Figure IDA00001794167500011
Figure IDA00001794167500021

Claims (15)

1.一种用于产生木素纤维素材料的水解产物的工艺，其包括
a)对所述木素纤维素材料实施在165℃–175℃之间，例如约170℃的温度的预处理，和
b)对所述经预处理的木素纤维素材料实施水解酶的作用以产生水解产物，
其中所述水解酶包含纤维素分解酶和木聚糖酶，并且其中所述木聚糖酶以总量水解酶蛋白的至少10%的量存在。
2.根据权利要求1的工艺，其中所述水解酶包含衍生自里氏木霉的纤维素酶系统。
3.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述木聚糖酶是GH10木聚糖酶，优选具有显示为SEQ ID NO:1的序列或与显示为SEQ ID NO:1的序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%同一性的序列。
4.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述木聚糖酶以水解酶蛋白总量的至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少20%或甚至至少25%的量存在。
5.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述水解酶以水解酶蛋白总量的至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或甚至至少25%的量包含家族61糖苷水解酶。
6.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述水解酶以水解酶蛋白总量的至少1%、至少2%、至少3%、至少4%或甚至至少5%、例如至少6%、至少7%、至少8%、至少9或甚至至少10%的量包含β-葡糖苷酶。
7.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述含木素纤维素材料源于选自下组的材料：玉米秸秆，玉米纤维，硬木材例如白杨木和桦木，软木材，谷类稻草例如麦秸，柳枝稷，稻壳，市政固体废物，工业有机废物，办公室用纸或其混合物。
8.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述步骤(a)中的预处理使用有机酸或无机酸进行，优选硫酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和/或其混合物。
9.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述步骤(a)中的预处理使用0.1-2.5重量%的酸、优选0.5-2.0重量%的酸、优选0.8-1.5重量%的酸进行，所述酸优选硫酸。
10.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述预处理在约170℃的温度进行。
11.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中所述预处理作为蒸汽爆炸进行。
12.根据前述权利要求中任一项的工艺，其中将所述步骤(b)的水解产物发酵以产生发酵产物，优选使用酵母进行。
13.根据前述权利要求中任一项的工艺，其包括同时水解和发酵。
14.根据前述权利要求中任一项的工艺，其进一步包括包含回收所述发酵产物，优选乙醇的步骤。
15.一种组合物，其包含如前述权利要求中任一项中所限定的水解酶。
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