CN102834521B

CN102834521B - 用于增强来自发酵工艺副产物的方法

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Publication number: CN102834521B
Application number: CN201180016668.XA
Authority: CN
Inventors: J.桑德斯; J.M.江普; H.S.奥尔森; A.盖查德; N.E.克里尔; M.阿克曼; A.G.朱尔曼德
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes North America Inc
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2031-03-30
Also published as: CN102834521A; EP2553110A1; EP3070171B1; WO2011126897A2; ES2684760T3; EP2553110B1; US20180216139A1; CN102918160A; EP3070171A1; ES2585284T3; WO2011126897A3; CN102918160B; US20130052702A1; EP2553111B1; US20130034883A1; EP2553111A2; WO2011123505A1; ES2636216T3; US8883456B2

Abstract

本发明涉及用于增强来自用于产生发酵产物的发酵工艺的副产物的产量和/或品质的方法。本发明包括将含淀粉材料发酵为发酵产物的工艺，所述工艺包括发酵步骤，其中在发酵步骤之前或之中添加一种或多种酶。更具体而言，本发明提供用于增加来自用于产生发酵产物的工艺的油回收产量并进一步通过从DDGS去除所含脂肪而增强DDGS的品质的方法，所述DDGS作为副产物在用于产生发酵产物的工艺中产生。

Description

用于增强来自发酵工艺副产物的方法

技术领域

本发明涉及用于增强来自产生发酵产物的发酵工艺的油收率和/或副产物品质的方法。

发明背景

由于化石燃料的有限储备以及对于温室气体排放的担忧，人们日益关注使用可再生的能源。

用于从含淀粉材料或含木素纤维素材料产生发酵产物如乙醇的工艺在本领域是公知的。准备含淀粉材料如谷物/玉米用于此类发酵工艺通常以在干研磨或湿磨工艺中研磨谷物/玉米开始。湿磨工艺涉及将谷物/玉米分级为不同组分，其中仅淀粉级分进入发酵工艺。干研磨工艺涉及将谷物/玉米仁研磨至粗粉，并将粗粉与水和酶混合。一般而言使用两种干研磨工艺。最常用的工艺，通常称作“常规工艺”，包括研磨含淀粉材料，然后通常使用细菌α-淀粉酶在高温液化糊化的淀粉，然后在葡糖淀粉酶和发酵生物的存在下进行同时糖化和发酵(SSF)。另一种公知的工艺，通常称作“生淀粉水解”工艺(RSH工艺)，包括研磨含淀粉材料，然后在起始糊化温度以下，通常在酸性真菌α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的存在下，同时糖化和发酵粒状淀粉。

在用于从谷物/玉米产生乙醇的工艺中，根据SSF或RSH工艺，在发酵之后，将乙醇从全醪蒸馏出来。将所得的不含乙醇的浆料，通常称作全釜馏物，分离为固体和液体级分(即分别含有约35和7%固形物的湿饼和稀釜馏物)。通常浓缩所述稀釜馏物，即，将其蒸发为稠釜馏物或糖浆，并与湿饼重组，并进一步干燥为含可溶物的蒸馏干酒糟(distiller’sdried grains with solubles)(DDGS)以供用于动物饲料。DDGS的油含量有时高于期望，且人们寻求将更多油作为单独的副产物回收以供用于产生生物柴油或其他生物可再生产物的方法。

大部分从发酵工艺进行油回收的工作专注于改善油从全釜馏物的可提取性。油的有效去除通常通过己烷提取完成。然而由于所需的高资本投资，己烷提取的利用并未得到广泛应用。因此，人们探索了改善从发酵工艺进行油提取的其他方法。

美国专利号6,433,146公开了使用乙醇从玉米或玉米加工副产物提取油和玉米醇溶蛋白(zein)。

美国专利号7,601,858公开了从浓缩的副产物(如在用于产生乙醇的干磨工艺过程中形成的稀釜馏物)回收油的方法。所述方法包括例如通过蒸发副产物而从副产物形成浓缩物，并从浓缩物回收油。

美国专利号7,608,729公开了通过将釜馏物加热至足以至少部分分离或结合来自釜馏物的油的温度，而释放全釜馏物和稀釜馏物中存在的结合油的方法。

美国专利申请号2010/0058649公开了从发酵产物分离油级分，调整油级分的pH，并从油级分回收油的方法。

Wang(2008,Lipid Technology 20(9):203-207)和Wang等(2009,J.Agric.FoodChem.57:2302-2307)研究了酶和不同的研磨和挤出方法增强油分隔(oil partitioning)的用途。

全釜馏物和稀釜馏物两者均包含大量水。用于将釜馏物脱水的方法在本领域是已知的。

本发明的目标是提供改善的用于增加可回收的油的量，使釜馏物脱水，以及增加来自发酵工艺的DDGS的品质的方法。

发明内容

本发明涉及将含淀粉材料发酵为发酵产物的工艺，其包括在半纤维素酶和/或内切葡聚糖酶存在下进行的发酵步骤。

本发明还涉及增加从用于产生发酵产物的工艺回收的油的量的方法。

本发明还涉及使从用于产生发酵产物的工艺获得的釜馏物脱水的方法。

本发明还涉及减少在用于产生发酵产物的工艺中产生的含可溶物的蒸馏干酒糟中脂肪或油的量的方法。

本发明还涉及增加分隔(partition)入通过用于产生发酵产物的工艺产生的稀釜馏物中的油的量的方法。

本发明还涉及使用于产生发酵产物的工艺产生的全釜馏物脱水的方法。

发明详述

定义

乙酰木聚糖酯酶：术语“乙酰木聚糖酯酶”意指羧基酯酶(EC 3.1.1.72)，其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、乙酸α-萘酯(alpha-napthyl acetate)和乙酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本发明而言，乙酰木聚糖酯酶活性是使用含有0.01% TWEEN^TM 20的50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM乙酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶定义为能够在pH 5,25℃每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。

α-淀粉酶：术语“α-淀粉酶”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)，其催化淀粉和其他直链和支化的1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶：术语“α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶”意指α-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃水解酶(EC 3.2.1.55)，其催化对α-L-阿拉伯糖苷中的末端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解。该酶对α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖起作用。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶或α-L-阿拉伯聚糖酶。就本发明而言，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性是使用总体积200μl中的每ml的100mM乙酸钠pH 5中5mg的中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,Ltd.,Bray，Co.Wicklow，Ireland)在40℃进行30分钟，接着通过HPX-87H柱层析(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)的阿拉伯糖分析来确定的。

α-葡糖醛酸糖苷酶：术语“α-葡糖醛酸糖苷酶”意指α-D-葡糖苷酸葡糖醛酸水解酶(alpha-D-glucosiduronate glucuronohydrolase)(EC 3.2.1.139)，其催化α-D-葡糖醛酸糖苷水解为D-葡糖醛酸和醇。就本发明而言，α-葡糖醛酸糖苷酶活性是根据de Vries,1998,J.Bacteriol.180:243-249确定的。一个单位的α-葡糖醛酸糖苷酶等于能够在pH 5，40℃每分钟释放出1微摩尔葡糖醛酸或4-O-甲基葡糖醛酸的酶量。

β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(beta-D-glucosideglucohydrolase)(E.C.No.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，根据Venturi等,2002,Extracellular beta-D-glucosidasefrom Chaetomium thermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties,J.Basic Microbiol.42:55-66描述的基本方法。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃,pH 4.8，在含有0.01%20的50mM柠檬酸钠pH 5中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-葡糖吡喃糖苷每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。

β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(β-D-xylosidexylohydrolase)(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖(xylooligosaccharide)的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。就本发明而言，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃，pH 5从1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷作为底物在含有0.01%20的100mM柠檬酸钠中每分钟产生1.0微摩尔对硝基苯酚阴离子。

纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase)(E.C.No.3.2.1.91)，其催化纤维素、纤维素寡糖，或任何包含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的还原或非还原末端释放纤维二糖(Teeri,1997,Crystalline cellulose degradation:Newinsight into the function of cellobiohydrolases,Trends in Biotechnology 15:160-167;Teeri等,1998,Trichoderma reesei cellobiohydrolases:why so efficienton crystalline cellulose?,Biochem.Soc.Trans.26:173-178)。纤维二糖水解酶活性根据Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279;van Tilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156;van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBS Letters187:283-288;和Tomme等,1988,Eur.J.Biochem.170:575-581描述的方法确定。在本发明中，Tomme等方法可用于确定纤维二糖水解酶活性。

纤维素材料：纤维素材料意指包含纤维素的任何材料。生物质的初生细胞壁(primary cell wall)中的主要多糖是纤维素，其次最丰富的是半纤维素，而第三是果胶。次生细胞壁(secondary cell wall)在细胞停止生长后产生，其同样含有多糖并通过共价交联至半纤维素的聚合木质素而加强。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是直链β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如木聚糖、木葡聚糖(xyloglucan)、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，具有系列取代基的复杂分支结构。尽管通常是多形的，存在于植物组织中的纤维素主要是平行葡聚糖链的不溶晶体基质。半纤维素通常与纤维素以及与其它半纤维素以氢键相连，其帮助稳定细胞壁基质。

纤维素通常见于例如植物的茎、叶、壳、皮和穗轴，或树的叶、枝和木材。纤维素材料可以是，但不限于，草本材料(包括能源作物)、农业残余物、木材(林业残余物)、城市固体废物、废纸和纸浆与造纸厂残余物(参见，例如，Wiselogel等,1995,于Handbook onBioethanol(Charles E.Wyman编),pp.105-118,Taylor & Francis,Washington D.C.;Wyman,1994,Bioresource Technology 50:3-16;Lynd,1990,Applied Biochemistry andBiotechnology 24/25:695-719;Mosier等,,1999,Recent Progress in Bioconversionof Lignocellulosics,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,T.Scheper主编,Volume65,pp.23-40,Springer-Verlag,New York)。在本文中应理解的是，纤维素可为木素纤维素，在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料的形式。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，纤维素材料是木素纤维素，其包含纤维素、半纤维素和木质素。

在一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是农业残余物。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残余物)。在另一个方面，纤维素材料是城市固体废物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是纸浆和造纸厂残余物。

在另一个方面，纤维素材料是谷物/玉米秸秆。在另一个方面，纤维素材料是麦秆。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是稻杆。在另一个方面，纤维素材料是芒属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是松。在另一个方面，纤维素材料是柳。在另一个方面，纤维素材料是桉树属(eucalyptus)。

在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉线头(cottonlinter)。在另一个方面，纤维素材料是无定形的磷酸处理的纤维素。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。

在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如用于本文，术语“水生生物质”意指在水生环境中通过光合作用过程产生的生物质。所述水生生物质可为藻类；沉水植物；挺水植物；和浮叶植物。

纤维素材料可以直接使用或进行预处理，使用本领域已知的常规方法，如本文所述。在一个优选的方面，预处理纤维素材料。

纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括内切葡聚糖酶，纤维二糖水解酶，β-葡糖苷酶，或其组合。测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)，如Zhang等,Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies,2006,Biotechnology Advances 24:452-481所综述的。总纤维素分解活性通常是使用不溶性底物来测定的，所述底物包括Whatman No.1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、经预处理的木素纤维素等。最常见的总纤维素分解活性测定法是使用Whatman No.1滤纸作为底物的滤纸测定法。该测定法是由International Union of Pure and AppliedChemistry(IUPAC)(Ghose,1987,Measurement of cellulase activities,PureAppl.Chem.59:257-68)确立的。

就本发明而言，纤维素分解酶活性通过测量在下述条件下由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的增加来确定：1-20mg的纤维素分解酶蛋白/g的PCS中纤维素在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃进行3-7日，与未添加纤维素分解酶蛋白的对照水解相比较。通常条件为：1ml反应液，经洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶性固形物，50mM乙酸钠pH 5，1mM MnSO₄，50℃、55℃或60℃，72小时，通过HPX-87H柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行糖分析。

编码序列：术语“编码序列”的意思是直接指定其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指包括对编码本发明的α-淀粉酶的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述α-淀粉酶的多核苷酸可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码α-淀粉酶的多核苷酸编码区的连接。

内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase)(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)中的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可通过测量底物粘度的减少或由还原糖测定法(Zhang等,2006,Biotechnology Advances 24:452-481)确定的还原端增加来确定。就本发明而言，根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，在pH 5，40℃使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来确定内切葡聚糖酶活性。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据Henrissat B.,1991,A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acidsequence similarities,Biochem.J.280:309-316,及Henrissat B.,和Bairoch A.,1996,Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases,Biochem.J.316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。该家族中的酶起初基于一个家族成员中非常弱的内切-1,4-β-D葡聚糖酶活性的测量而被归类为糖基水解酶家族。这些酶的结构和作用模式明显是非标准的，且其无法认为是真正的糖苷酶。然而，基于其在与纤维素酶或纤维素酶混合物一同使用时，增强木素纤维素分解的能力，其仍保留在CAZy分类中。

阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase or feruloyl esterase)：术语“阿魏酸酯酶”意指4-羟基-3-甲氧基肉桂酰-糖水解酶酶(EC 3.1.1.73)，其催化4-羟基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基团从酯化的糖(其在“天然”底物中通常为阿拉伯糖)的水解，以产生阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)。阿魏酸酯酶也称作阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase)、FAE-III、肉桂酸酯水解酶、FAEA、cinnAE、FAE-I或FAE-II。就本发明而言，阿魏酸酯酶是使用50mM乙酸钠pH 5.0中的0.5mM阿魏酸对硝基苯酯作为底物确定的。一个单位的阿魏酸酯酶活性等于能够在pH 5，25℃每分钟释放出1微摩尔对硝基苯酚阴离子的酶量。

半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如几种)水解半纤维素材料的酶。参见，例如Shallom和Shoham,2003 Microbialhemicellulases.Current Opinion In Microbiology,6(3):219-228)。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于乙酰甘露聚糖酯酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是支化和直链多糖的混杂集团，这些多糖通过氢键键合于植物细胞壁中的纤维素微纤维，将其交联为鲁棒(robust)的网络。半纤维素酶亦共价地附于木质素，与纤维素一同形成高度复杂的结构。半纤维素的可变的结构和组织形式需要许多酶的协同作用使其完全降解。半纤维素酶的催化模块为水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或水解乙酸或阿魏酸侧基酯键的糖酯酶(CE)。这些催化模块，基于其一级序列的同源性，可指派为以数字标记的GH和CE家族。一些家族，具有总体上类似的折叠，可进一步归类为宗族(clan)，以字母标记(例如，GH-A)。最具信息性和更新的这些和其他糖活性酶的分类可在Carbohydrate-ActiveEnzymes(CAZy)数据库获得。半纤维素分解酶活性可根据Ghose和Bisaria,1987,Pure &Appl.Chem.59:1739-1752在合适的温度，例如50℃、55℃或60℃测量。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞由于在复制过程中发生的突变而与亲本细胞不完全相同的后代。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或其受修饰以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。

多肽片段：术语“多肽片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酶活性。

具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指催化具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。就本发明而言，通过测量由纤维素分解酶在下述条件下水解纤维素材料所导致的还原糖增加或纤维二糖与葡萄糖的总量增加来确定纤维素分解增强活性：1-50mg总蛋白/g PCS中纤维素，其中总蛋白包含50-99.5% w/w的纤维素分解酶蛋白，及0.5-50% w/w的具有纤维素分解增强活性的GH61多肽的蛋白质，在合适的温度50℃、55℃或60℃历时1-7天，与用等量的总蛋白加载量而无纤维素分解增强活性(1-50mg纤维素分解蛋白/g PCS中纤维素)所进行的对照水解相比。在一个优选的方面，使用在总蛋白重量的2-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或者总蛋白质量的2-3%的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014所述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载量存在下的1.5L(Novozymes A/S,Denmark)的混合物作为纤维素分解活性的来源。

具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过降低达到相同水解水平所需的纤维素分解酶的量而增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解，优选降低至少1.01倍，更优选至少1.05倍，更优选至少1.10倍，更优选至少1.25倍，更优选至少1.5倍，更优选至少2倍，更优选至少3倍，更优选至少4倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，并且最优选至少20倍。

预处理的玉米秸秆：术语“PCS”或“预处理的玉米秸秆“意指通过用热和稀硫酸处理的源自玉米秸秆的纤维素材料。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLO SUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度-比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

含木聚糖材料：术语“含木聚糖材料”意指任何包含含有β-(1-4)连接的木糖残基主链的植物细胞壁多糖的材料。陆生植物的木聚糖是具有β-(1-4)-D-吡喃木糖主链(其由短糖链分支)的杂聚物。它们包含D-葡糖醛酸或其4-O-甲基醚、L-阿拉伯糖和/或多种寡糖，所述寡糖包括D-木糖、L-阿拉伯糖，D-或L-半乳糖和D-葡萄糖。木聚糖类型的多糖可分为同木聚糖(homoxylan)和杂木聚糖(heteroxylan)，其包括葡糖醛酸木聚糖，(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖，(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖，阿拉伯木聚糖和复合杂木聚糖(complexheteroxylan)。参见例如Ebringerova等,2005,Adv.Polym.Sci.186:1-67。

在本发明的方法中，可使用任何含木聚糖材料。在一个优选的方面，所述含木聚糖材料是木素纤维素。

木聚糖降解活性或木聚糖分解活性：术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”意指水解含木聚糖材料的生物学活性。两种测定木聚糖分解活性的基础方法包括：(1)测定总木聚糖分解活性，和(2)测定单独的木聚糖分解活性(例如乙酰木聚糖酯酶、α-葡糖醛酸酯酶(α-glucuronyl esterase)、α-葡糖醛酸糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、内切木聚糖酶和阿魏酸酯酶)。最近在木聚糖分解酶测定法的进展总结于几个公开文献中，包括Biely和Puchard,Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes,2006,Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11):1636-1647；Spanikova和Biely,2006,Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced bySchizophyllum commune,FEBS Letters 580(19):4597-4601；Herrmann等,1997,Thebeta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylanxylohydrolase,Biochemical Journal 321:375-381。

总木聚糖降解活性可通过确定从多种类型的木聚糖形成的还原糖来测量，所述木聚糖包括例如燕麦斯佩耳特小麦(oat spelt)、山毛榉木(beechwood)和落叶松木(larchwood)木聚糖，或者可通过光度法确定从多种共价染色的木聚糖释放出的染色的木聚糖片段来测量。最常见的总木聚糖分解活性测定法基于从多聚的4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖产生还原糖，如Bailey,Biely,Poutanen,1992,Interlaboratory testing of methodsfor assay of xylanase activity,Journal of Biotechnology 23(3):257-270中所述。木聚糖酶活性亦可用0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中确定。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃在pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。

就本发明而言，木聚糖降解活性是通过测量由木聚糖降解酶在下述通常条件下造成的桦木木聚糖(Sigma Chemical Co.,Inc.,St.Louis,MO,USA)水解的增加来确定的：1ml反应液，5mg/ml底物(总固形物)，5mg木聚糖分解蛋白质/g底物，50mM乙酸钠，pH 5，50℃，24小时，如Lever,1972,A new reaction for colorimetric determination ofcarbohydrates,Anal.Biochem 47:273-279所述使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定法进行糖分析。

木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(1,4-β-D-xylan-xylohydrolase)(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内水解。就本发明而言，木聚糖酶活性是用0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖作为底物在37℃在0.01%X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH 6中确定的。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37℃，pH 6在200mM磷酸钠pH 6缓冲液中从作为底物的0.2% AZCL-阿拉伯木聚糖每分钟产生1.0微摩尔的天青精(azurine)。

本发明的工艺/方法

本发明的一个方面涉及从含淀粉材料或木素纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括在半纤维素酶存在下进行的发酵步骤。

在另一个方面，本发明涉及从含淀粉材料或木素纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括在半纤维素酶和内切木聚糖酶的存在下进行的发酵步骤。

在另一个方面，本发明涉及从含淀粉材料或木素纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括在半纤维素酶、内切葡聚糖酶和GH61多肽存在下进行的发酵步骤。

在另一个方面，本发明涉及从含淀粉材料或木素纤维素材料产生发酵产物的工艺，其包括在内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶的存在下进行的发酵步骤。

本发明的方法可用于常规的以及生淀粉水解工艺，以及生物质工艺。

半纤维素单独或与其他酶(例如内切葡聚糖酶)组合添加可在发酵之后增强全釜馏物的脱水和自稀釜馏物或糖浆提取油，其可用于生物柴油或其他生物可再生产物的产生。不拘于任何具体理论，认为在用于产生发酵产物的工艺的发酵步骤过程中将半纤维素单独或与其他酶活性组合添加至发酵培养基可释放含淀粉材料中的结合油。更“非结合的”油的形成可在固/液分离为湿饼和稀釜馏物之后允许油分隔入全釜馏物的水相。然后此种油可通过一种或多种本领域中已知的油提取方法从分离的全釜馏物的“含水”层或稀釜馏物回收。

在一个实施方案中，内切葡聚糖酶以0.01-1.0，例如0.02-0.08、0.025-0.06、0.025-0.05或0.03-0.04 EGU/g干固形物的量添加。

在一个实施方案中，内切葡聚糖酶以1-30，例如5-30、7-25、10-20、10-17或12-15微克/g干固形物的量添加。

在一个实施方案中，半纤维素酶以0.01-1.0，例如0.015-0.08、0.015-0.06、0.015-0.04或0.02-0.03 FXU/g干固形物的量添加。

在一个实施方案中，半纤维素酶以1-30，例如5-30、7-25、10-20、10-17或12-15微克/g干固形物的量添加。

本发明还通过减少DDGS中的脂肪或油含量由此产生更高品质的DDGS而导致DDGS的增强。

用于自糊化的含淀粉材料产生发酵产物的工艺

在一个实施方案中，本发明涉及用于产生发酵产物的工艺，其包括：

(a)在α-淀粉酶的存在下液化含淀粉材料；

(b)使用糖源生成酶糖化步骤(a)中获得的经液化的材料；和

(c)在半纤维素酶存在下使用发酵生物进行发酵。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

(a)在α-淀粉酶的存在下液化含淀粉材料；

(b)使用糖源生成酶糖化步骤(a)中获得的经液化的材料；和

(c)在内切葡聚糖酶和半纤维素酶存在下使用发酵生物进行发酵，其中内切葡聚糖酶以0.01-1.0EGU/g干固形物的量和1-30微克/g干固形物的量存在，而半纤维素酶以0.01-1.0FXU/g干固形物的量和1-30微克/g干固形物的量存在。

所述糖化和发酵步骤可顺序或同时进行。当该工艺作为顺序糖化和发酵工艺进行时，可在糖化和/或发酵过程中添加半纤维素酶和/或内切葡聚糖酶,而当步骤(b)和(c)同时进行时(SSF工艺)则在发酵之前或过程中添加半纤维素酶和/或内切葡聚糖酶。

液化优选在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行。在一个实施方案中，在液化过程中添加普鲁兰酶、异淀粉酶和/或肌醇六磷酸酶。发酵生物优选为酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的株。合适的发酵生物列于下文“发酵生物”部分。

液化可作为三步热浆工艺来进行。将浆料加热至60-95℃，优选80-85℃，并添加α-淀粉酶以起始液化(稀化)。然后可将浆料在95-140℃，优选105-125℃的温度喷射蒸煮1-15分钟，优选约3-10分钟，特别是约5分钟。使浆料冷却至60-95℃并添加更多的α-淀粉酶以完成水解(二次液化)。液化工艺通常在pH4.0至6.5，特别是在pH 4.5至6进行。

糖化可使用本领域众所周知的条件用糖化酶例如β-淀粉酶、葡糖淀粉酶或产麦芽糖淀粉酶，以及任选地脱支酶如异淀粉酶或普鲁兰酶进行。举例而言，完全的糖化工艺可持续约24至约72小时，然而，通常在30-65℃，通常约60℃的温度进行通常40-90分钟的预糖化，然后在同时发酵和糖化工艺(SSF工艺)中在发酵过程中进行完全糖化。糖化通常在20-75℃，优选40-70℃，通常约60℃的温度，在约pH 4-5的pH，通常在约pH 4.5进行。

发酵产物，特别是乙醇生产中最广泛使用的工艺为同时糖化和发酵(SSF)工艺，其中对于糖化没有保持阶段，意指发酵生物(如酵母)和酶(包括半纤维素酶和/或内切葡聚糖酶)可一起添加。SSF通常在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。在一个实施方案中，发酵持续6至120小时，特别是24至96小时。

在一个具体实施方案中，本发明的工艺在步骤(a)之前还包括下述步骤：

x)减小含淀粉材料的粒度，优选通过磨制；和

y)形成包含含淀粉材料和水的浆料。

含水浆料可含有10-55w/w%干固形物(DS)，优选25-45w/w%干固形物(DS)，更优选30-40w/w%干固形物(DS)的含淀粉材料。将浆料加热到糊化温度以上，并可添加α-淀粉酶，优选细菌和/或酸性真菌α-淀粉酶以起始液化(稀化(thinning))。在进行本发明步骤(a)中的α-淀粉酶处理前，浆料可经喷射蒸煮(jet-cooked)以进一步使浆料糊化。

自未糊化的含淀粉材料产生发酵产物的方法

在另一个实施方案中，本发明涉及在半纤维素酶的存在下，不糊化(即不烹制)含淀粉材料而从含淀粉材料产生发酵产物)的工艺。

在另一个实施方案中，本发明涉及不糊化(即不烹制)含淀粉材料而从含淀粉材料产生发酵产物)的工艺，其中内切葡聚糖酶和半纤维素酶在生淀粉水解工艺过程中存在，其中内切葡聚糖酶以0.01-1.0EGU/g干固形物的量和1-30微克/g干固形物的量存在，而半纤维素酶以0.01-1.0FXU/g干固形物的量和1-30微克/g干固形物的量存在。

在这些实施方案中，从未糊化的含淀粉材料产生所需的发酵产物如乙醇。该工艺包括用α-淀粉酶、糖源生成酶和发酵生物在低于含淀粉材料起始糊化温度的温度在内切葡聚糖酶和/或半纤维素酶的存在下同时糖化和发酵含淀粉材料，例如粒状淀粉。

如用于本文，术语“起始糊化温度”意指淀粉发生糊化的最低温度。一般而言，在水中加热的淀粉在约50℃至75℃开始糊化；糊化的准确温度取决于特定的淀粉，并可方便的由本领域技术人员确定。从而，起始糊化温度可根据植物物种，植物物种的特定品种以及生长条件而改变。在本发明的上下文中，给定含淀粉材料的起始糊化温度可确定为使用由Gorinstein和Lii44(12)：461-466描述的方法5%的淀粉颗粒丧失双折射的温度。

RSH工艺在低于起始糊化温度的温度进行，意指所述温度通常在30-75℃，优选45-60℃的范围。在一个实施方案中，所述工艺在25℃至40℃，如28℃至35℃，如30℃至34℃，优选约32℃的温度进行。

本领域技术人员可方便地确定使用何种剂量/量的酶和发酵生物。

在一个实施方案中，可制备具有10-55w/w%干固形物(DS)，优选25-45w/w%干固形物，更优选30-40w/w%干固形物的含淀粉材料的含淀粉材料(如粒状淀粉)的浆料。所述浆料可含有水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水(scrubber water)、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水(side-stripper water)或来自其他发酵产物设备(plant)的工艺水。由于本发明的RSH工艺在糊化温度以下进行，因此不发生显著的粘度增加，如果需要，可使用高水平的釜馏物。在一个实施方案中，含水浆料包含约1至约70vol%，优选15-60vol%，特别为约30至50vol%的水和/或工艺水，如釜馏物(逆流)、洗涤水、蒸发器冷凝液或馏出物、来自蒸馏的侧线汽提器水或来自其他发酵产物设备的工艺水，或其组合等。

含淀粉材料可通过优选以干磨或湿磨将其粒度减小到0.05至3.0mm，优选0.1至0.5mm来制备。在进行本发明的工艺后，含淀粉材料的至少85%，至少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者优选至少99%的干固形物转化为可溶的淀粉水解物。

用于从含木素纤维素材料产生发酵产物的工艺

本发明亦涉及产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)水解经预处理的含木素纤维素材料；和

(c)在半纤维素酶的存在下使用发酵生物进行发酵。

本发明还涉及产生发酵产物的工艺，其包括下述步骤：

(a)预处理含木素纤维素材料；

(b)水解经预处理的含木素纤维素材料；和

(c)在内切葡聚糖酶和半纤维素酶的存在下使用发酵生物进行发酵，其中内切葡聚糖酶以0.01-1.0EGU/g干固形物的量和1-30微克/g干固形物的量存在，而半纤维素酶以0.01-1.0FXU/g干固形物的量和1-30微克/g干固形物的量存在。

步骤(b)和(c)可分别或同时进行。或者，可开始步骤(b)，然后继续进行步骤(b)及进行步骤(c)，另外称作混合的水解和发酵工艺。

在水解和发酵之前，所述含木素纤维素材料可经预处理。预处理的目标是分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素，这样会改善酶水解的速率。

在预处理过程中，含木素纤维素材料可以以10-80wt.%，例如20-50wt.%的量存在。

可在水解和/或发酵之前对含木素纤维素材料进行化学、机械和/或生物预处理。机械预处理(通常称作物理预处理)可单独使用或与后续或同时的水解特别是酶水解组合使用，以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

优选地，所述化学、机械和/或生物预处理在水解和/或发酵之前进行。或者，所述化学、机械和/或生物预处理与水解同时进行，如同时添加一种或多种纤维素分解酶或下文提及的其他酶活性，以释放可发酵的糖如葡萄糖和/或麦芽糖。

化学预处理指能促进纤维素、半纤维素和/或木质素分离和/或释放的任何化学处理。合适的化学预处理步骤的实例包括用例如稀酸、石灰、碱、有机溶剂、氨、二氧化硫、二氧化碳进行处理。此外，湿氧化和pH控制的水热解亦认为是化学预处理。

优选地，所述化学预处理是酸预处理，更优选地，连续稀和/或弱酸(mild acid)处理，如用硫酸或另一种有机酸如乙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸或其组合的处理。亦可使用其他酸。弱酸处理在本发明的上下文中意指处理pH在1-5的范围，优选pH 1-3。在一个具体实施方案中，酸浓度在0.1至2.0wt.%酸，优选硫酸的范围。可将所述酸与根据本发明的待发酵的材料混合或接触，并可将混合物保持在160-220℃，如165-195℃的范围，进行数分钟至数秒，例如1-60分钟，如2-30分钟或3-12分钟。可施用强酸如硫酸的添加以去除半纤维素。这增强了纤维素的可消化性。

已显示纤维素溶剂处理将约90%的纤维素转化为葡萄糖。亦显示当木素纤维素结构受破坏时，酶水解可大为增强。碱H₂O₂、臭氧、有机溶剂(使用含水醇中的路易斯酸，FeCl₃，(Al)₂SO₄)、甘油、二噁烷、苯酚或乙二醇属于已知破坏纤维素结构并促进水解的溶剂(Mosier等,2005,Bioresource Technology 96:673-686)。

该预处理亦可为用碱例如NaOH、Na₂CO₃和/或氨等的碱性化学预处理。使用氨的预处理方法描述于例如WO 2006/110891、WO 2006/110899、WO2006/110900、WO 2006/110901，其通过提述并入本文。

湿氧化技术涉及使用氧化剂如基于亚硫酸盐的氧化剂等。溶剂预处理的实例包括用DMSO(二甲亚砜)等进行的预处理。化学预处理一般进行1至60分钟，如5至30分钟，但可取决于待预处理的材料进行更短或更长的期间。

其他合适预处理方法的实例描述于Schell等,2003,Appl.Biochem andBiotechn.105-108:69-85,和Mosier等,2005,Bioresource Technology 96:673-686,以及美国专利申请号2002/0164730，其均通过提述并入本文。

机械预处理指促进纤维素、半纤维素和/或木质素从含木素纤维素材料分离和/或释放的任何机械或物理预处理。举例而言，机械预处理涉及多种类型的磨制、辐照、汽蒸/蒸汽爆炸和水热解。

机械预处理包括粉碎(机械减小粒径)。粉碎包括干磨、湿磨和振动球磨(vibratory ball milling)。机械预处理可涉及高压和/或高温(蒸汽爆炸)。在本发明的一个实施方案中，高压意指在300到600psi，优选400到500psi范围内，例如约450psi的压力。在本发明的一个实施方案中，高温意指在约100到300℃，优选约140到235℃的范围内的温度。在一个优选实施方案中，机械预处理是分批工艺蒸汽枪水解器系统，其使用如上定义的高压和高温。也可为此使用Sunds Hydrolyzer(可从Sunds Defibrator AB(Sweden)获得)。

在本发明的一个实施方案中，进行了化学和机械预处理，其涉及例如，稀酸或弱酸预处理以及高温和高压处理。所述化学和机械预处理可根据需要顺序或同时进行。

相应地，在一个优选实施方案中，对含木素纤维素材料进行化学和机械预处理以促进纤维素、半纤维素和/或木质素的分离和/或释放。

在一个优选实施方案中，所述预处理作为稀酸和/或弱酸蒸汽爆炸步骤进行。在另一个优选实施方案中，预处理作为氨纤维爆炸(fiber explosion)步骤(或AFEX预处理步骤)进行。

生物预处理指促进从含木素纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可涉及应用溶化木质素的微生物(参见，例如，Hsu,T.-A.,1996,Pretreatment of biomass,于Handbook on Bioethanol：Productionand Utilization,Wyman,C.E.编,Taylor & Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh,P.和Singh,A.,1993,Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,J.D.,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review，于Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production,Himmel,M.E.,Baker,J.O.和Overend,R.P.编,ACS Symposium Series 566,American Chemical Society，Washington,DC,第15章;Gong,C.S.,Cao,N.J.,Du,J.和Tsao,G.T.,1999,Ethanol production fromrenewable resources,于Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper，T.编,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany，65:207-241;Olsson和Hahn-Hagerdal,1996,Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanolproduction,Enz.Microb.Tech.18:312-331;以及Vallander，L.和Eriksson,K.-E.L.,1990,Production of ethanol from lignocellulosic materials:State of the art,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。

在发酵之前和/或过程中水解，优选用酶水解经预处理的材料。可水解经预处理的含木素纤维素材料以打破木质素的密封并破坏纤维素的晶体结构。在一个优选实施方案中，水解通过一种或多种水解酶(根据酶命名法的E.C.3类)，优选一种或多种糖酶包括纤维素分解酶和半纤维素分解酶，或其组合以酶法进行。此外，因为含木素纤维素材料可包含一些例如淀粉性和/或蛋白性材料，在水解和/或发酵过程中可存在α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶等。

用于水解的酶能够直接或间接将糖聚合物转化为可发酵的糖，如葡萄糖和/或麦芽糖，其可发酵为所需的发酵产物，如乙醇。

在一个实施方案中，所述糖酶具有纤维素分解(纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶)和/或半纤维素分解(例如木聚糖酶)活性。

在一个实施方案中，使用进一步包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的多肽的纤维素分解酶制备物进行水解。在一个优选实施方案中，所述具有纤维素分解增强活性的多肽是家族GH61A来源的。合适和优选的纤维素分解酶制备物和具有纤维素分解增强活性的多肽的实例描述于下文“纤维素分解酶”部分和“纤维素分解增强多肽”部分。

合适的酶描述于下文“酶”部分。

半纤维素聚合物可由半纤维素酶和/或酸性水解降解，以释放其五碳和六碳糖组分。六碳糖(己糖)如阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖，可容易地通过合适的发酵生物包括酵母发酵为发酵产物如丙酮、丁醇、柠檬酸、乙醇、延胡索酸、甘油等。

酵母是优选用于乙醇发酵的发酵生物。优选的是酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母的菌株，优选对于高水平的乙醇，即，高至例如约10、12、15或20体积%或更高的乙醇具有抗性的菌株。

酶水解优选在合适的水性环境中在可容易地由本领域技术人员确定的条件下进行。在一个优选实施方案中，水解在对于所讨论的酶合适的，优选最适的条件进行。

合适的工艺时间、温度和pH条件可容易地由本领域技术人员确定。优选地，水解在25至70℃，例如40至60℃，特别是大约50℃的温度进行。该步骤优选在3-8范围的pH，例如pH4-6进行。水解通常进行12至96小时，例如16至72小时，特别是24至48小时。

在一个实施方案中，在水解步骤(b)之前或之后将经预处理的含木素纤维素材料洗涤和/或解毒。这可改善例如稀酸水解的含木素纤维素材料如玉米秸秆的可发酵性。解毒可以以任何合适的方式进行，如通过蒸汽汽提、蒸发、离子交换、树脂或木炭处理液体级分或通过洗涤经预处理的材料。

发酵培养基

发酵培养基(″Fermentation media"或"fermentation medium")指其中进行发酵的环境，并包括发酵底物，即由发酵生物代谢的糖源。

发酵培养基可包含对于发酵生物的营养和生长刺激物。营养和生长刺激物广泛用于发酵领域，并包括氮源如氨；尿素，维生素和矿物质，或其组合。发酵培养基亦可包括酶如淀粉酶和/或其他糖源生成酶，特别是其中本发明的工艺作为同时糖化和发酵工艺或RSH工艺进行。

发酵生物

短语“发酵生物”指适用于发酵工艺并能够产生所需发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物。发酵生物可为C6或C6发酵生物，或其组合。C5和C6发酵生物在本领域中均为公知的。

合适的发酵生物能够将可发酵的糖，如阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖和/或木糖直接或间接发酵即转化为所需的发酵产物。

发酵生物的实例包括真菌生物如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)的菌株；毕赤酵母属(Pichia)的菌株，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；假丝酵母属(Candida)的菌株，优选产朊假丝酵母(Candida utilis)、阿糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、迪丹斯假丝酵母(Candidadiddensii)、Candida sonorensis，休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的菌株。其他发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)，特别是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)或异常汉逊酵母(Hansenula anomala)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的菌株。

商业上可获得的酵母包括，例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可从Fermentis/Lesaffre,USA获得)，FALI(可从Fleischmann’s Yeast,USA获得)，SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可从Ethanol Technology,WI,USA获得)，BIOFERM AFT和XR(可从NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA获得)，GERT STRAND(可从GertStrand AB,Sweden获得)和FERMIOL(可从DSM Specialties获得)。

优选的细菌发酵生物包括埃希氏菌属(Escherichia)的菌株，特别是大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，发酵单胞菌属(Zymomonas)，特别是运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株，发酵细菌属(Zymobacter)，特别是棕榈发酵细菌(Zymobactor palmae)的菌株，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，特别是产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)的菌株，明串珠菌属(Leuconostoc)，特别是肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的菌株，梭菌属(Clostridium)，特别是酪酸梭菌(Clostridium butyricum)的菌株，肠杆菌属(Enterobacter)，特别是产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的菌株，以及热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)的菌株，特别是热厌氧杆菌BG1L1(Appl.Microbiol.Biotech.77:61-86)和乙醇热厌氧杆菌(Thermoanarobacter ethanolicus)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterthermosaccharolyticum)或Thermoanaerobacter mathrani的菌株。还想到的是乳杆菌属(Lactobacillus)以及谷氨酸棒状杆菌R(Corynebacterium glutamicum R)，热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillus thermoglucosidaisus)和热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillusthermoglucosidasius)的菌株。

在一个实施方案中，所述发酵生物是C6糖发酵生物，例如，酿酒酵母的菌株。

对于发酵木素纤维素来源材料，可使用C5糖发酵生物。多数C5糖发酵生物也发酵C6糖。C5糖发酵生物的实例包括毕赤酵母，例如树干毕赤酵母菌种的菌株。C5糖发酵细菌也是已知的。而且，一些酿酒酵母菌株发酵C5(和C6)糖。实例为能够发酵C5糖的酵母属菌种的经遗传修饰的菌株，包括，例如，Ho等,1998,Applied and Environmental Microbiology,p.1852-1859和Karhumaa等,2006,Microbial Cell Factories 5:18和Kuyper等,2005,FEMS Yeast Research5：925-934中公开的菌株。

某些发酵生物的发酵性能可由发酵培养基中抑制剂的存在而受抑制，因此减少乙醇产生能力。已知生物质水解物中的化合物和高浓度的乙醇抑制某些酵母细胞的发酵能力。预适应或适应方法可减少该抑制作用。通常酵母细胞的预适应或适应涉及在发酵前顺序地培养酵母细胞，以增加所述酵母的发酵性能并增加乙醇产生。酵母预适应和适应方法在本领域为已知的。此类方法可包括，例如，在粗生物质水解物的存在下培养酵母细胞，在抑制剂例如酚化合物、糠醛和有机酸的存在下生长酵母细胞；在非抑制量的乙醇存在下生长酵母细胞；以及在酵母培养物中补充乙醛。在一个实施例中，所述发酵生物为在发酵之前进行一种或多种预适应或适应方法的酵母菌株。

根据本发明，发酵生物优选在准确的条件下以特定的生长速率生长。当将所述发酵生物导入/添加入所述发酵培养基时，接种的发酵生物经过许多阶段。起初，生长并未发生。该期间称为“迟滞期”，且可视为适应期。在下一个称为“指数期”的阶段，生长速率逐渐增加。经过一段最大生长的时间，生长速率停止，且所述发酵生物进入“稳定期”。又一段时间后所述发酵生物进入“死亡期”，此时活细胞数减少。

在一个实施方案中，将所述发酵生物添加至发酵培养基中从而使得每ml发酵培养基的中活的发酵生物计数为10⁵至10¹²，优选10⁷至10¹⁰的范围内，特别是约5x10⁷。

含淀粉材料

根据本发明，可使用任何合适的含淀粉材料。所述起始材料通常基于期望的发酵产物而选择。含淀粉材料的实例包括全谷粒、大麦、豆类、木薯、玉米、买罗高粱、豌豆、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、树薯或小麦，或它们的组合或来源于它们的淀粉，或谷类。也涵盖蜡质和非蜡质类型的玉米和大麦。

术语“粒状淀粉”意指生的、未烹制的淀粉，即，以其天然形式存在于谷类、块茎或谷粒中的淀粉。淀粉在植物细胞中作为微小的不溶于水的颗粒形成。当置于冷水中时，淀粉颗粒可吸收少量液体并膨胀(swell)。在高至50℃至75℃的温度，膨胀可为可逆的。然而，在更高温度开始称为“糊化”的不可逆膨胀。待加工的粒状淀粉可为高度精制的淀粉质量，优选至少90%，至少95%，至少97%或至少99.5%纯，或者其可为更加粗制的含淀粉材料，其含有包括非淀粉部分(例如胚残余物和纤维)的(例如，磨制的)全谷粒。原材料(如全谷粒)可通过例如磨制减小粒度以打开其结构并允许进一步的加工。根据本发明优选两个方法，湿磨和干磨。在干磨中，将整粒磨碎并使用。湿磨给出胚和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)的良好分离，并通常用于使用淀粉水解物产生例如糖浆的场合(location)。干磨和湿磨在淀粉加工领域是已知的，并等同地涵盖于本发明的方法中。在一个实施方案中，粒度减少至约0.05到3.0mm，优选0.1-0.5mm，或使得至少30%，优选至少50%，更优选至少70%，甚至更加优选至少90%的含淀粉材料可穿过具有0.05到3.0mm筛网，优选0.1到0.5mm筛网的筛。

含木素纤维素的材料(生物质)

在本发明的方法可使用任何合适的含木素纤维素材料。含木素纤维素材料可为任何含有木素纤维素的材料。在一个优选实施方案中，所述含木素纤维素的材料含有至少50wt.%，优选至少70wt.%，更优选至少90wt.%木素纤维素。可理解的是含木素纤维素材料也可包含其它组分，例如纤维质材料，如纤维素、半纤维素，且也可包含组分如糖类，如可发酵糖和不可发酵糖。

含木素纤维素材料通常见于，例如，植物的茎、叶、荚、壳和穗轴或树的叶、枝、木材。含木素纤维素材料也可为，但不仅限于，草本材料，农业残余物、林业残余物、城市固体废物，废纸，以及纸浆和造纸厂残余物。在本文中可理解的是含木素纤维素的材料可以植物细胞壁材料的形式出现，其在混合基质中包含木质素、纤维素和半纤维素。

在一个实施方案中，所述含木素纤维素材料选自如下的一种或多种：玉米纤维、稻草/稻秆、松木、刨花、杨木、甘蔗渣以及纸和纸浆加工废物。

合适的含木素纤维素材料的其它实例包括玉米秸杆、玉米穗轴、硬木如杨木和桦木、软木、谷物草秆如麦秆、柳枝稷(switch grass)、芒属(Miscanthus)、稻壳、城市固体废物(MSW)，工业有机废物，办公室用纸，或其混合物。

在一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米秸杆或玉米穗轴。在另一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为玉米纤维。在另一个实施方案中，所述含木素纤维素材料为柳枝稷。在另一个实施方案中，所述含木素纤维素的材料为甘蔗渣。

发酵产物

术语“发酵产物”意指使用发酵生物由包括发酵步骤的工艺产生的产物。发酵产物包括醇(例如阿拉伯糖醇，正丁醇，异丁醇，乙醇，甘油，甲醇，乙二醇，1,3-丙二醇(丙二醇)，丁二醇，丙三醇，山梨醇与木糖醇)；有机酸(例如，乙酸，醋酮酸，己二酸，抗坏血酸，柠檬酸，2,5-二酮-D-葡糖酸，蚁酸，延胡索酸，葡萄糖二酸，葡糖酸，葡糖醛酸，戊二酸，3-羟基丙酸，衣康酸，乳酸，苹果酸，丙二酸，草酸，草酰乙酸，丙酸，琥珀酸与木质酸/木糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，赖氨酸，丝氨酸和苏氨酸)；烷(例如，戊烷，己烷，庚烷，辛烷，壬烷，癸烷，十一烷和十二烷)，环烷烃(例如，环戊烷，环己烷，环庚烷和环辛烷)，烯(例如戊烯，己烯，庚烯和辛烯)；异戊二烯；聚酮化合物；气体(例如，甲烷，氢气(H₂)，二氧化碳(CO₂)和一氧化碳(CO))；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如核黄素，B₁₂，β-胡萝卜属)；和激素。在一个优选实施方案中，所述发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用的中性酒；或工业乙醇或在可消费醇类工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业中使用的产品。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、发泡酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。优选的发酵工艺包括醇类发酵工艺。在一个实施方案中，所述发酵产物是乙醇，其可用作燃料乙醇或饮用乙醇。

蒸馏

在发酵之后，可将发酵产物从发酵培养基分离。可蒸馏浆料以通过微过滤或膜过滤技术提取所需的发酵产物或从发酵培养基提取所需的发酵产物。或者，可通过汽提回收发酵产物。用于回收发酵产物的方法在本领域是公知的。通常，获得例如具有高至例如约96体积%的纯度的发酵产物例如乙醇。

在发酵工艺结束之后，剩下的材料视为全釜馏物。如用于本文，术语“全釜馏物”包括在回收发酵产物例如乙醇之前或之后在发酵工艺结束时残留的材料。发酵产物可任选地通过任何本领域中已知的方法回收。在一个实施方案中，将全釜馏物通过一种或多种用于将稀釜馏物与湿饼分离的方法分离或分隔为固相和液相。此类方法包括，例如离心和倾析。发酵产物可任选地在全釜馏物分离为固相和液相之前或之后回收。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法进一步包括蒸馏以获得发酵产物例如乙醇。发酵和蒸馏可同时和/或分别/顺序进行，任选地继以一个或多个工艺步骤以供进一步精制发酵产物。

在本发明的一个实施方案中，将来自蒸馏工艺的水性副产物(全釜馏物)例如通过离心分离为两个级分：湿谷粒(固相)和稀釜馏物(上清)。

在另一个实施方案中，本发明的方法进一步包括将由蒸馏产生的全釜馏物分离为湿谷粒和稀釜馏物；并在液化之前将稀釜馏物再循环至含淀粉材料。

在一个实施方案中，所述稀釜馏物再循环至磨制的全谷粒浆料。

可将湿谷粒级分，通常在转鼓式干燥器中干燥。干燥的产物称作蒸馏干酒糟，并可例如用作动物饲料。

可使系釜馏物级分蒸发，得到两个级分(参见图1)：

(i)4-6% DS的冷凝级分(主要是淀粉、蛋白和细胞壁组分)，和

(ii)糖浆级分，主要由极限糊精和不可发酵的糖组成，其可与湿谷粒(来自全釜馏物分离步骤)一同导入干燥器以提供称作含可溶物的蒸馏干酒糟的产物，其亦可用作动物饲料。

稀釜馏物是用于全釜馏物离心上清的术语。通常，稀釜馏物含有4-6% DS(主要为淀粉和蛋白)，并具有约60-90℃的温度。

在另一个实施方案中，不再循环稀釜馏物，但将蒸发的稀釜馏物的冷凝流再循环至含有待喷射蒸煮的磨制的全谷粒的浆料。

含可溶物的蒸馏干酒糟

如上所解释，釜馏物是在醪转化为糖，发酵并蒸馏为乙醇之后残余的产物。釜馏物可分离(如通过离心或筛选)为两个级分：(1)湿饼(固相)和(2)稀釜馏物(上清)。可压制固体级分或蒸馏湿谷粒(distillers'wet grain，DWG)以去除过量的水分，然后干燥以产生蒸馏干酒糟(DDG)。在从液体级分去除乙醇之后，可蒸发残余的液体以将可溶材料浓缩至冷凝的蒸馏可溶物(distillers'solubles，DS)或干燥并磨碎以制成蒸馏干可溶物(distillers'dried solubles，DDS)。DDS常常与DDG混合以形成含可溶物的蒸馏干酒糟(DDGS)。DDG、DDGS和DWG统称做蒸馏酒糟(distillers'grain)。

在来自玉米的乙醇产生工艺之后的DDGS通常含有约13%油，31%蛋白和56%糖，以及其他组分。将部分油从DDGS去除会改善DDGS的品质，因为在饲料市场，许多饲料生产商偏好DDGS中较少的油和脂肪以制备高品质饲料。

油提取和脱水

用于使釜馏物脱水和用于从发酵产物提取油的方法在本领域中是已知的。这些方法包括倾析，或者以其他方式将全釜馏物分离为湿饼和稀釜馏物。参见，例如美国专利号6,433,146，7,601,858和7,608,729，以及美国专利申请号2010/0058649。此外，可将稀釜馏物蒸发或冷凝为糖浆或稠釜馏物，由其可使用离心、过滤、加热、高温、加压或其组合提取油。另一种提取油的方式是降低稀釜馏物或糖浆的pH。使用表面活性剂破乳亦增强油提取。还可使用压榨机(press)进行脱水。

在本发明的一个实施方案中，在本发明的工艺中的发酵过程中半纤维素酶和/或内切葡聚糖酶的存在增加了稀釜馏物以及进一步的糖浆或稠釜馏物中的油的量，相对于当半纤维素酶和/或内切葡聚糖酶未添加至发酵工艺时稀釜馏物、糖浆或稠釜馏物中油的量而言。

回收

发酵产物可任选地使用任何本领域中已知的方法从发酵培养基回收，所述方法包括但不限于层析、电泳方法、差示溶解度、蒸馏或提取。举例而言，将醇从发酵的纤维素材料分离，并通过常规的蒸馏方法纯化。可获得具有高至约96体积%的纯度的乙醇，其可用作，例如燃料乙醇，饮用乙醇，即可饮用的中性酒，或工业乙醇。

半纤维素酶

半纤维素可通过半纤维素酶和/或酸水解降解以释放其五碳和六碳糖组分。

可使用任何适用于将半纤维素水解为优选木糖的半纤维素酶。优选的半纤维素酶包括乙酰木聚糖酯酶，内切阿拉伯糖酶，外切阿拉伯糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，阿魏酸酯酶，内切半乳聚糖酶，外切半乳聚糖酶，葡糖醛酸糖苷酶，甘露聚糖酶，木聚糖酶，及其两个或更多个的组合。优选地，用于本发明的半纤维素酶是外作用的半纤维素酶，且更优选地，所述半纤维素酶是具有在低于pH 7，优选pH 3-7的酸性条件下水解半纤维素的能力的外作用的半纤维素酶。

在一个方面，所述半纤维素酶包含商业性半纤维素分解酶组合物。适用于本发明的商业性半纤维素分解酶制备物的实例包括，例如SHEARZYME^TM(Novozymes A/S)，CELLIC^TMHTec(Novozymes A/S)，CELLIC^TM HTec2(Novozymes A/S)，(Novozymes A/S)，(NovozymesA/S)，HC(Novozymes A/S)，Xylanase(Genencor)，XY(Genencor)，XC(Genencor)，TX-200A(AB Enzymes)，HSP 6000Xylanase(DSM)，DEPOL^TM 333P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)，DEPOL^TM 740L.(Biocatalysts Limit,Wales,UK)和DEPOL^TM 762P(Biocatalysts Limit,Wales,UK)。

在一个实施方案中，所述半纤维素酶是木聚糖酶。在一个实施方案中，所述木聚糖酶可优选是微生物来源的，如真菌(例如曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、多孔菌属(Meripilus)、木霉属(Trichoderma))来源的，或来自细菌(例如芽孢杆菌属)。在一个优选实施方案中，所述木聚糖酶来源于丝状真菌，优选来源于曲霉属如棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的株；或腐质霉属优选疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)的株。可用于本发明方法的木聚糖酶的实例包括但不限于棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO 94/21785)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)木聚糖酶(WO 2006/078256)和土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)NRRL 8126木聚糖酶(WO2009/079210)。所述木聚糖酶可优选为内切-1,4-β-木聚糖酶，更优选GH 10或GH 11的内切-1,4-β-木聚糖酶。商业性木聚糖酶的实例包括来自Novozymes A/S,Denmark的SHEARZYME^TM，BIOFEED WHEAT^TM，HTec和HTec2。

可用于本发明方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于里氏木霉(Trichodermareesei)β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458),埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(SwissProt登录号Q7SOW4)。

可用于本发明方法的乙酰木聚糖酯酶的实例包括但不限于红褐肉座菌(Hypocreajecorina)乙酰木聚糖酯酶(WO 2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)和特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800乙酰木聚糖酯酶(WO 2009/073709)。

可用于本发明方法的阿魏酸酯酶的实例包括但不限于特异腐质霉DSM 1800阿魏酸酯酶(WO 2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)和费希新萨托菌(Neosartorya fischer)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。

可用于本发明方法的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不限于特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO 2009/073383)和黑曲霉(Aspergillus niger)阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。

可用于本发明方法的α-葡糖醛酸糖苷酶的实例包括但不限于棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillusterreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。

内切葡聚糖酶(EG)

术语“内切葡聚糖酶”意指内切-1,4-(1,3;1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(lichenin)的1,4-β-D-糖苷键、混合的β-1,3葡聚糖例如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中和含有纤维素组分的其它植物材料中的β-1,4键的内水解(endohydrolysis)。内切葡聚糖酶活性可根据Ghose,1987,Pure and Appl.Chem.59:257-268的方法，使用羧甲基纤维素(CMC)水解来确定。

在一个优选实施方案中，内切葡聚糖酶可来源于木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株；或金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，如Chrysosporium lucknowense的菌株。

用于水解含木素纤维素材料的酶

半纤维素酶

任何如上所述的半纤维素酶可用于水解含木素纤维素材料。

可以以有效水解半纤维素的量，如以约0.001至0.5wt.%的总固形物(TS)，更优选约0.05至0.5wt.%的TS的量添加半纤维素酶。

木聚糖酶可以以0.001-1.0g/kg DM(干物质)底物的量，优选0.005-0.5g/kg DM底物的量，且最优选0.05-0.10g/kg DM底物的量添加。

纤维素分解活性

短语“纤维素分解活性”如用于本文包括具有纤维二糖水解酶活性(EC3.2.1.91)(例如纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II)，内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和/或β-葡糖苷酶活性(EC 3.2.1.21)的酶。

至少三种类型的酶对于将纤维素转化为可发酵的糖是重要的：内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，其随机剪切纤维素链；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其从纤维素链末端切割纤维二糖单元；和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)，其将纤维二糖和可溶性纤维糊精转化为葡萄糖。在这三类涉及纤维素生物降解的酶中，纤维二糖水解酶看来对于降解天然微晶纤维素是关键的酶。

在一个优选实施方案中，所述纤维素分解活性可为真菌来源的酶的制备物的形式，如来自木霉属的菌株，优选里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，如特异腐质霉的菌株，或金孢子菌属的菌株，优选Chrysosporium lucknowense的菌株。

在优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含一种或多种下述活性：纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解酶增强活性、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或木糖异构酶。

在一个优选实施方案中，所述纤维素酶可为如PCT/US2008/065417中定义的组合物，其通过提述并入本文。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物包含具有纤维素分解增强活性的多肽，优选为家族GH61A多肽，优选为公开于WO 2005/074656(Novozymes)中的。所述纤维素分解酶制备物可进一步包含β-葡糖苷酶，如来源于曲霉属、青霉属(Penicillium)或木霉属菌株的β-葡糖苷酶，包括公开于WO 2008/057637的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白。在一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物亦可包含CBHII酶，优选土生梭孢霉纤维二糖水解酶II CEL6A。在另一个优选实施方案中，所述纤维素分解酶制备物亦可包含纤维素分解酶，优选源自里氏木霉或特异腐质霉。

所述纤维素分解酶制备物亦可包含WO 2005/074656中公开的具有纤维素分解增强活性的多肽(GH61A)；β-葡糖苷酶(WO 2008/057637中公开的融合蛋白)；和源自里氏木霉的纤维素分解酶。

在一个实施方案中，所述纤维素分解酶是商业上可获得的产品1.5L，CELLUZYME^TM，CTEC或CTEC2(可从NovozymesA/S,Denmark获得)或ACCELERASE^TM 1000(来自Genencor Inc.,USA)。

可在发酵过程中添加纤维素分解酶。纤维素分解酶可在0.1-100 FPU每克总固形物(TS)，优选0.5-50 FPU每克TS，特别是1-20 FPU每克TS的范围中剂量添加。在另一个实施方案，将至少0.1mg纤维素分解酶每克总固形物(TS)，优选至少3mg纤维素分解酶每克TS，如5至10mg纤维素分解酶每克TS用于水解。

内切葡聚糖酶(EG)

任何上述内切葡聚糖酶可用于水解木素纤维素材料。

纤维二糖水解酶(CBH)

在水解过程中可存在一种或多种纤维二糖水解酶。术语“纤维二糖水解酶”意指1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)，其在纤维素，纤维寡糖或任何含有β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中催化1,4-β-D-葡糖苷键的水解，自链的还原或非还原末端释放纤维二糖。

纤维二糖水解酶的实例包括来自里氏木霉、特异腐质霉的CBH I和CBHII；和来自土生梭孢霉的CBH II纤维二糖水解酶(CELL6A)。

纤维二糖水解酶活性可根据由Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279和由vanTilbeurgh等,1982,FEBS Letters 149:152-156;van Tilbeurgh和Claeyssens,1985,FEBSLetters 187:283-288描述的方法来确定。所述Lever等的方法适用于评估玉米秸杆中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等的方法适用于基于荧光二糖衍生物确定纤维二糖水解酶的活性。

β-葡糖苷酶

术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。就本发明而言，β-葡糖苷酶活性根据由Venturi等,2002,J.Basic Microbiol.42:55-66描述的基本方法确定，只是如本文所述使用不同的条件。一单位的β-葡糖苷酶活性定义为在100mM柠檬酸钠、0.01%20中在50℃、pH 5自作为底物的4mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚。

在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶为真菌来源的，例如曲霉属、青霉属或木霉属的菌株。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自里氏木霉，如由bgl1基因编码的β-葡糖苷酶(参见EP 562003的图1)。在一个优选实施方案中，所述β-葡糖苷酶源自米曲霉(根据WO 2002/095014在米曲霉中重组产生)，烟曲霉(根据WO 2002/095014的实施例22在米曲霉中重组产生)，或黑曲霉(1981,J.Appl.3:157-163)。

木糖异构酶

木糖异构酶(D-木糖酮异构酶)(E.C 5.3.1.5)为催化D-木糖变为D-木酮糖的可逆异构化反应的酶。一些木糖异构酶亦转化D-葡萄糖到D-果糖的可逆异构化。因此，木糖异构酶时称作葡萄糖异构酶。

用于本发明方法或工艺的木糖异构酶可为任何具有木糖异构酶活性的酶，且可得自任何来源，优选细菌或真菌来源，如丝状真菌或酵母。细菌木糖异构酶的实例包括属于游动放线菌属(Actinoplanes)、芽孢杆菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)和栖热袍菌属(Thermotoga)，包括新阿波罗栖热袍菌(T.neapolitana)(Vieille等,1995,Appl.Environ.Microbiol.61(5):1867-1875)和海栖热袍菌(T.maritime)的那些。

真菌木糖异构酶的实例源自担子菌纲(Basidiomycetes)。

优选的木糖异构酶来源于假丝酵母属的菌株，优选博伊丁氏假丝酵母，特别是由例如Vongsuvanlert等,1988,Agric.Biol.Chem.,52(7):1817-1824公开的博伊丁氏假丝酵母木糖异构酶。所述木糖异构酶可来源于博伊丁氏假丝酵母的菌株(Kloeckera 2201)，其以DSM 70034和ATCC 48180保藏，公开于Ogata等,Agric.Biol.Chem,33,1519-1520或Vongsuvanlert等,1988,Agric.Biol.Chem,52(2):1519-1520。

在一个实施方案中，所述木糖异构酶来源于链霉菌属的菌株，例如，来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)的菌株(美国专利号4,687,742)、黄微绿链霉菌(S.flavovirens)、白色链霉菌(S.albus)、不产色链霉菌(S.achromogenus)、多刺链霉菌(S.echinatus)、威德莫尔链霉菌(S.wedmorensis)，其均公开于美国专利3,616,221号。其他的木糖异构酶公开于美国专利3,622,463号，美国专利4,351,903号，美国专利4,137,126号，美国专利3,625,828号，HU专利12,415号，DE专利2,417,642，JP专利69,28,473号，以及WO 2004/044129，每个均通过提述并入本文。

所述木糖异构酶可为固定化或液体形式。优选液体形式。

商业上可得到的木糖异构酶的实例是来自Novozymes A/S,Denmark的SWEETZYME^TMT。

添加木糖异构酶以提供0.01-100 IGIU每克总固体范围内的活性水平。

GH61多肽

在本发明的工艺中，可使用任何GH61多肽。

在一个方面，所述GH61多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-X(4,5)-G-X-Y-[ILMV]-X-R-X-[EQ]-X(4)-[HNQ]和[FW]-[TF]-K-[AIV]，

其中X为任意氨基酸，X(4,5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而X(4)是在4个连续位置的任意氨基酸。

包含上述所示的基序的GH61多肽可进一步包含：

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]，

[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，或

H-X(1,2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]，

其中X为任意氨基酸，X(1,2)为在1个位置或2个连续位置的任意氨基酸，X(3)为3个连续位置的任意氨基酸，而X(2)为2个连续位置的任意氨基酸。

在一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]。在另一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。在另一个优选的方面，所述GH61多肽进一步包含H-X(1，2)-G-P-X(3)-[YW]-[AILMV]和[EQ]-X-Y-X(2)-C-X-[EHQN]-[FILV]-X-[ILV]。

在第二个方面，所述GH61多肽包含下述基序：

[ILMV]-P-x(4,5)-G-x-Y-[ILMV]-x-R-x-[EQ]-x(3)-A-[HNQ],

其中x为任意氨基酸，x(4,5)为在4或5个连续位置的任意氨基酸，而x(3)为3个连续位置的任意氨基酸。在上述基序中，采用公认的IUPAC单字母氨基酸缩写。

在第三个方面，所述GH61多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO:1(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:2(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:3(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:4(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:5(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:6(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:7(橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus))，SEQ ID NO:8(里氏木霉)，SEQ ID NO:9(嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila))，SEQ IDNO:10(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:11(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:12(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:13(嗜热毁丝霉)，SEQ ID NO:14(橙橘嗜热子囊菌)，SEQ IDNO:15(烟曲霉)，SEQ ID NO:16(嗜松青霉(Penicillium pinophilum))，SEQID NO:17(嗜热子囊菌属菌种(Thermoascus sp.))，SEQ ID NO:18(青霉属菌种(Penicillium sp.))，SEQ ID NO:19(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:20(土生梭孢霉)，SEQ IDNO:21(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:22(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:23(土生梭孢霉)，SEQ IDNO:24(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:25(土生梭孢霉)，SEQ IDNO:26(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:27(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:28(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:29(土生梭孢霉)，SEQ ID NO:30(甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus))，SEQ ID NO:31(甲壳嗜热子囊菌)，SEQ IDNO:32(甲壳嗜热子囊菌)，SEQ ID NO:33(Aurantiporus alborubescens)，或SEQ ID NO:34(Aurantiporus alborubescens)的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，或至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或至少100%的同一性程度。

在第六个方面，所述GH61多肽人工变体，所述人工变体包含SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQID NO:30，SEQ ID NO:31，或SEQ IDNO:32；或其同源序列的成熟多肽的一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入。

优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidinetract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适pH等。

能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的纤维素分解增强活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与亲本多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry.30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene 46:145；Ner等,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ IDNO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ IDNO:30，SEQ ID NO:31，或SEQ ID NO:32的成熟GH61多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不超过4，例如1、2、3或4。

在一个方面，所述GH61多肽在WO 2008/151043中所述的可溶性活化二价金属阳离子，例如硫酸锰的存在下使用。

在一个方面，所述GH61多肽在二氧化合物、二环化合物、杂环化合物、含氮化合物或含硫化合物的存在下使用。

所述二氧化合物可包括任何含有两个或更多氧原子的合适化合物。在一些方面，所述二氧化合物含有如本文中所述的取代的芳基模块(moiety)。所述二氧化合物可包括一种或多种(几种)羟基和/或羟基衍生物，但亦包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基模块。二氧化合物的非限定性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3,4-二羟基苯甲酸；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯二酚；联苯三酚；没食子酸；甲基-3,4,5-三羟基苯甲酸；2,3,4-三羟基二苯甲酮；2,6-二甲氧基苯酚；芥子酸；3,5-二羟基苯甲酸；4-氯-1,2-苯二酚；4-硝基-1,2-苯二酚；鞣酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基延胡索酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2,4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2,4,4’-三羟基二苯甲酮；顺-2-丁烯-1,4-二醇；3,4-二羟基-3-环丁烯-1,2-二酮；二羟基丙酮；乙酰丙烯醛(acroleinacetal)；甲基-4-羟基苯甲酸；4-羟基苯甲酸；和甲基-3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸；或其盐或溶剂合物(solvate)。

所述二环化合物可包括任何如本文中所述的合适的取代稠环系统。所述化合物可包含一个或多个(几个)另外的环，且除非另行说明，不限于具体的环数。在一个方面，所述二环化合物是类黄酮。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的异类黄酮(isoflavonoid)。在另一个方面，所述二环化合物是任选取代的花色离子(flavyliumion)，如任选取代的花色素或任选取代的花色苷，或其衍生物。二环化合物的非限定性实例包括表儿茶素(epicatechin)；槲皮素(quercetin)；杨梅黄酮(myricetin)；黄杉素(taxifolin)；山奈酚(kaempferol)；桑素(morin)；金合欢素(acacetin)；柚皮素(naringenin)；异鼠李黄素(isorhamnetin)；芹菜苷配基(apigenin)；花青素(cyanidin)；花色素苷(cyanin)；kuromanin；花青素鼠李葡糖苷(keracyanin)；或其盐或溶剂合物。

所述杂环化合物可为任何合适的化合物，如本文中所述的任选取代的包含杂原子的芳环或非芳环。在一个方面，所述杂环是包含任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块的化合物。在另一个方面，所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的五员杂环烷基或任选取代的五员杂芳基模块。在另一个方面，任选取代的杂环烷基或任选取代的杂芳基模块是选自吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩-吡唑基(dihydrothieno-pyrazolyl)、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基(benzothienyl)、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基(benzooxazolyl)、苯并咪唑基、异喹啉基、异吲哚基、吖啶基、苯并异噁唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、吲哚基、二氮杂基(diazepinyl)、氮杂基(azepinyl)、硫杂基(thiepinyl)、哌啶基和噁庚基(oxepinyl)的任选取代的模块。在另一个方面所述任选取代的杂环烷基模块或任选取代的杂芳基模块是任选取代的呋喃基。杂环化合物的非限定性实例包括(1,2-二羟乙基)-3,4-二氢呋喃-2(5H)-酮；4-羟基-5-甲基-3-呋喃酮；5-羟基-2(5H)-呋喃酮；[1,2-二羟乙基]呋喃-2,3,4(5H)-三酮；α-羟基-γ-丁内酯；核糖酸γ-内酯；aldohexuronicaldohexuronic酸γ-内酯；葡糖酸δ-内酯；4-羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟甲基)糠醛；糠偶姻(furoin)；2(5H)-呋喃酮；5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮；和5,6-二氢-4-羟基-6-甲基-2H-吡喃-2-酮；或其盐或溶剂合物。

所述含氮化合物可为任何具有一个或多个氮原子的合适化合物。在一个方面，所述含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或硝基氧(nitroxide)模块。含氮化合物的非限定性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2-氨基苯酚；1,2-苯二胺；2,2,6,6-四甲基-1-吡啶基氧(piperidinyloxy)；5,6,7,8-四氢生物蝶呤；6,7-二甲基-5,6,7,8-四氢蝶呤；和马来酰胺酸；或其盐或溶剂合物。

所述醌化合物可为任何本文中所述的包含醌模块的合适的化合物。醌化合物的非限定性实例包括1,4-苯醌；1,4-萘醌；2-羟基-1,4-萘醌；2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-苯醌或辅酶Q₀；2,3,5,6-四甲基-1,4-苯醌或四甲基对苯醌；1,4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5,6-二氢吲哚二酮或肾上腺色素；4-叔丁基-5-甲氧基-1,2-苯醌；吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone)；或其盐或溶剂合物。

所述含硫化合物可为任何包含一个或多个硫原子的合适的化合物。在一个方面，所述含硫化合物包含选自亚硫酰，硫醚，亚磺酰，磺酰，磺酰胺(sulfamide)，磺酰胺(sulfonamide)，磺酸和磺酸酯的模块。含硫化合物的非限定性实例包括乙硫醇；2-丙硫醇；2-丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫醇；苯-1,2-二硫醇；半胱氨酸；甲硫氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其盐或溶剂合物。

在一个实施方案中，所述GH61多肽以2-1000微克/g干固形物(DS)，例如5-100，10-40或20-40微克/g DS的量存在。

用于常规工艺和生淀粉水解工艺中的酶

α-淀粉酶

可使用任何α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精。优选的α-淀粉酶是微生物来源的，如细菌或真菌来源。最适合的α-淀粉酶取决于工艺条件，但本领域技术人员可容易地确定。

在一个实施方案中，优选的α-淀粉酶为酸性α-淀粉酶，例如，真菌酸性α-淀粉酶或细菌酸性α-淀粉酶。短语“酸性α-淀粉酶”意指在3到7，优选3.5到6，或更优选4-5的范围内的pH具有最佳活性的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。

细菌α-淀粉酶

在另一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属。所述芽孢杆菌属α-淀粉酶可来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株，但也可来源于其他芽孢杆菌属菌种。涵盖的α-淀粉酶的特定实例包括示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶，示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，和示于WO 99/19467的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(所有序列通过提述并入本文)。在本发明的一个实施方案中，所述α-淀粉酶可为分别与示于WO 99/19467的SEQ ID NOS:3、4或5中的任何序列具有至少60%，优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%的同一性程度的酶。

所述芽孢杆菌属α-淀粉酶也可为变体和/或杂合体，特别是描述于WO96/23873、WO96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO02/10355(所有文件通过提述并入本文)中任一的变体和/或杂合体。特别涵盖的α-淀粉酶变体公开于美国专利号6,093,562、6,297,038或美国专利号6,187,576(通过提述并入本文)，并包括在位置R179到G182具有一个或两个氨基酸缺失的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(BSGα-淀粉酶)变体，优选WO 96/023873公开的双缺失-参见，例如，第20页第1-10行(通过提述并入本文)，优选与WO 99/19467公开的SEQ ID NO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比对应于Δ(181-182)，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的编号方式缺失氨基酸R179和G180(所述文献通过提述并入本文)。甚至更优选的是芽孢杆菌属α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其较之WO 99/19467公开的SEQ IDNO:3所列的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列具有对应于Δ(181-182)的双缺失，且进一步包括N193F取代(也表示为I181*+G182*+N193F)。

细菌杂合体α-淀粉酶

特别涵盖的杂合体α-淀粉酶包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(示于WO1999/19467的SEQ ID NO:4)的445个C-末端氨基酸残基，以及源自解淀粉芽孢杆菌的α淀粉酶(示于WO99/19467的SEQ ID NO:5)的37个N-末端氨基酸残基，并具有下列取代中的一个或多个，特别是全部：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO99/19467的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌编号方式)。也优选具有一个或更多下述突变的变体(或在其他芽孢杆菌属α-淀粉酶主链中的对应突变)：H154Y，A181T，N190F，A209V和Q264S和/或位置176和179之间两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5编号方式)。

真菌α-淀粉酶

真菌α-淀粉酶包括源自曲霉属菌株的α-淀粉酶，如川地曲霉(Aspergilliskawachii)，黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)α-淀粉酶。

优选的酸性真菌α-淀粉酶为Fungamyl样α-淀粉酶，其源自米曲霉的菌株。根据本发明，短语“Fungamyl样α-淀粉酶”指下述的α-淀粉酶，即与WO 96/23874的SEQ ID NO:10中所示氨基酸序列的成熟部分显示高同一性，即，高于70%，高于75%，高于80%，高于85%，高于90%，高于95%，高于96%，高于97%，高于98%，高于99%或甚至100%的同一性。

另一个优选的酸性α-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一个优选实施方案中，所述酸性真菌α-淀粉酶来自黑曲霉，作为“AMYA_ASPNG”以原始登录号P56271公开于Swiss-prot/TeEMBL数据库中，并描述于WO 89/01969(实施例3)。源自黑曲霉的商业上可得到的酸性真菌α-淀粉酶是SP288(可由Novozymes A/S,Denmark得到)。

其他涵盖的野生型α-淀粉酶包括源自根毛霉属(Rhizomucor)和多孔菌属(Meripilus)的菌株，优选微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)(WO 2004/055178通过提述并入本文)或巨多孔菌(Meripilus giganteus)的菌株的那些α-淀粉酶。

在一个优选实施方案中，所述α-淀粉酶源自川地曲霉，并由Kaneko等1996,J.Ferment.Bioeng.81:292-298“Molecular-cloning and determination of thenucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable α-amylase fromAspergillus kawachii”公开，并进一步作为EMBL:#AB008370公开。

所述真菌α-淀粉酶也可为包括淀粉结合域(SBD)和α-淀粉酶催化域的野生型酶(即，非杂合体)，或其变体。在一个实施方案中，所述野生型α-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。

真菌杂合体α-淀粉酶

在一个优选实施方案中，所述真菌酸性α-淀粉酶为杂合体α-淀粉酶。真菌杂合体α-淀粉酶的优选实例包括公开于WO 2005/003311或美国申请公开号2005/0054071(Novozymes)或美国申请号60/638,614(Novozymes)中的那些，将其通过提述并入本文。杂合体α-淀粉酶可包含α-淀粉酶催化域(CD)和糖结合域/模块(CBM)，如淀粉结合域，以及任选的接头。

所涵盖的杂合体α-淀粉酶的特定实例包括美国专利申请号60/638,614实施例中的表1到5中公开的那些，包括具有催化域JA118和罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)SBD(美国申请号60/638,614中的SEQ ID NO:100)的Fungamyl变体，具有罗耳阿太菌AMG接头和SBD(美国申请号60/638,614中的SEQ ID NO:101)的微小根毛霉α-淀粉酶，具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和SBD的微小根毛霉α-淀粉酶(其作为美国申请号11/316,535中氨基酸序列SEQID NO:20,SEQID NO:72和SEQ ID NO:96的组合公开于表5)，或作为WO2006/069290中表5中的V039，和具有罗耳阿太菌葡糖淀粉酶接头和SBD的巨多孔菌α-淀粉酶(美国申请号60/638,614中的SEQ ID NO:102)。其他特别涵盖的杂合体α-淀粉酶为美国申请号11/316,535和WO 2006/069290(每个均通过提述并入本文)实施例4中表3、4、5和6中所列的任何杂合体α-淀粉酶。

涵盖的杂合体α-淀粉酶的其他特定实例包括美国申请公开号2005/0054071中公开的那些，包括第15页表3公开的那些，如具有川地曲霉接头和淀粉结合域的黑曲霉α-淀粉酶。

也涵盖下述α-淀粉酶，其与任何上面提及的α-淀粉酶显示高同一性，即，与成熟酶序列显示高于70%，高于75%，高于80%，高于85%，高于90%，高于95%，高于96%，高于97%，高于98%，高于99%或甚至100%同一性。

酸性α-淀粉酶可根据本发明以0.1到10AFAU/g DS，优选0.10到5AFAU/g DS，特别是0.3到2AFAU/g DS的量添加。

商业性α-淀粉酶产品

优选的包含α-淀粉酶的商业组合物包括来自DSM的MYCOLASE^TM；BAN^TM，TERMAMYL^TMSC，FUNGAMYL^TM，LlQUOZYME^TM X，SAN^TMSUPER，以及SAN^TM EXTRA L(Novozymes A/S)和CLARASE^TM L-40,000，DEX-LO^TM，SPEZYME^TM FRED，SPEZYME^TM AA，SPEZYME^TM，DELTA AAGC358和Clearflow AA(Genencor Int.)，以及以商品名SP288出售的酸性真菌α-淀粉酶(可从Novozymes A/S,Denmark获得)。

肌醇六磷酸酶

任何肌醇六磷酸酶可用于本发明的工艺。肌醇六磷酸酶是通过特异性水解肌醇和磷之间的酯键而降解肌醇六磷酸盐和/或肌醇六磷酸的酶。肌醇六磷酸酶活性取决于许多成分中磷和离子的可获得性。在一些实施方案中，肌醇六磷酸酶能够从肌醇六磷酸(例如植酸)释放至少一个无机磷酸。肌醇六磷酸酶可根据其对于植酸分子上起始水解处的磷酸酯基团的具体位置的偏好进行归类(例如3-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.8)或6-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.26))。肌醇六磷酸酶的实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶(myo-inositol-hexakiphosphate-3-phosphohydrolase)。

肌醇六磷酸酶可从微生物如真菌或细菌生物获得。举例而言，所述肌醇六磷酸酶可从丝状真菌如曲霉属(例如无花果曲霉(A.ficuum)，烟曲霉，黑曲霉和土曲霉(A.terreus))，支胞属(Cladospirum)，毛霉属(Mucor)(例如梨形毛霉(Mucorpiriformis))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如嗜热毁丝霉(M.thermophila))，青霉属(例如P.hordei(ATCC No.22053)，桧状青霉(P.piceum)(ATCC No.10519)，或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCC No.48944))，踝节菌属(Talaromyces)(例如嗜热踝节菌(T.thermophilus))，嗜热霉属(Thermomyces)(WO 99/49740)和木霉属菌种(Trichodermaspp.)(例如里氏木霉(T.reesei))获得。

在一个实施方案中，所述植酸降解酶从酵母(例如Arxula adeninivorans、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、西方许望酵母(Schwanniomyces occidentalis))，革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌、克雷伯氏菌属菌种(Klebsiella spp.)、假单胞菌属菌种(Pseudomonas spp.))，和革兰氏阳性细菌(例如芽孢杆菌属菌种如枯草芽孢杆菌)获得。

所述肌醇六磷酸酶亦可从柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)或隔孢伏革菌属(Peniophora)获得。

在一个实施方案中，所述肌醇六磷酸酶来源于布丘氏菌属菌种(Buttiauxiellaspp.)如乡间布丘氏菌(B.agrestis)、B.brennerae、B.ferragutiase、B.gaviniae、B.izardii、B.noackiae和B.warmboldiae。在一些实施方案中，所述肌醇六磷酸酶是公开于WO 2006/043178或美国申请号11/714,487的肌醇六磷酸酶。

在一个优选实施方案中，所述肌醇六磷酸酶与美国申请号No.12/263,886的SEQID NO:31中所示的氨基酸序列具有至少75%，至少80%，至少85%，至少88%，至少90%，至少93%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%和至少99%的序列同一性。

商业上可获得的肌醇六磷酸酶为NATUPHOS(BASF)，RONOZYME P(Novozymes A/S)，PHZYME(Danisco A/S,Diversa)和FINASE(AB Enzymes)。用于确定微生物肌醇六磷酸酶活性的方法和肌醇六磷酸酶单位的定义公开于Engelen等,1994,Journal of AOACInternational 77:760-764。所述肌醇六磷酸酶可为野生型肌醇六磷酸酶，其活性变体或活性片段。

普鲁兰酶

任何普鲁兰酶可用于本发明的工艺。在一个实施方案中，所述普鲁兰酶为GH57普鲁兰酶，例如从热球菌属(Thermococcus)，包括热球菌属菌种AM4，热球菌属菌种HJ21，Thermococcus barophilus，Thermococcus gammatolerans，Thermococcushydrothermalis；Thermococcus kodakarensis，Thermococcus litoralis；和Thermococcus onnurineus的菌株获得；或从火球菌属(Pyrococcus)，如深海火球菌(Pyrococcus abyssi)和激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的菌株获得。

糖源生成酶

短语“糖源生成酶”包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)，β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(均为麦芽糖生成者)以及普鲁兰酶和α-葡糖苷酶。糖源生成酶能够产生碳水化合物，其可由所述发酵生物用作能量源，例如，当用于供产生发酵产物，例如乙醇的工艺时。所产生的碳水化合物可直接或间接的转化为期望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可存在糖源生成酶的混合物。特别涵盖的混合物为至少葡糖淀粉酶和α-淀粉酶，特别是酸性淀粉酶，甚至更优选酸性真菌α-淀粉酶的混合物。酸性真菌α-淀粉酶活性(AFAU)每葡糖淀粉酶活性(AGU)的比例(即，AFAU每AGU)可为至少0.1，特别是至少0.16，如0.12至0.50或更高的范围。

葡糖淀粉酶

所述葡糖淀粉酶可源自任何合适的来源，例如源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等,1984,EMBO J.3(5):1097-1102)，及其变体，如公开于WO 92/00381,WO 2000/104136和WO 2001/04273(来自Novozymes,Denmark)的那些；公开于WO 84/02921的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.,55(4):941-949(1991))，及它们的变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等,1996,Prot.Eng.9:499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等,1995,Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等,1994,Biochem.J.301:275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等,1996,Biochemistry,35:8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等,1997,Protein Eng.10:1199-1204)。

其他的葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(之前表示为罗耳伏革菌(Corticiumrolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4727026和Nagasaka等，1998,“Purification andproperties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii,Appl Microbiol Biotechnol.50:323-330)，踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃莫森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromycesthermophilus)(美国专利号4,587,215)。

涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)以及公开于WO 2006/069289的瓣环栓菌(Trametes cingulata)的葡糖淀粉酶。

杂合体葡糖淀粉酶亦可用于本发明的工艺。所述杂合体葡糖淀粉酶的实例公开于WO 2005/045018。特定的实例包括公开于WO 2005/045018(其以教导杂合体葡糖淀粉酶的程度通过提述并入本文)实施例1表1和4的杂合体葡糖淀粉酶。

涵盖的还有如下葡糖淀粉酶，即与任何上面提及的葡糖淀粉酶显示高同一性，即，与成熟酶序列显示高于70%，高于75%，高于80%，高于85%，高于90%，高于95%，高于96%，高于97%，高于98%，高于99%或甚至100%的同一性。

商业上可得到的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER，SAN^TM EXTRA L，SPIRIZYME^TM PLUS，SPIRIZYME^TMFUEL，SPIRIZYME^TM B4U和AMG^TM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEX^TM300(来自Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900，G-ZYME^TM，GC480，GC148，GC019和G990 ZR(来自Genencor Int.)。

所述葡糖淀粉酶可以以0.02-20AGU/g DS，优选0.1-10AGU/g DS，特别是在1-5AGU/g DS，如0.5AGU/g DS的量添加。

β-淀粉酶

术语“β-淀粉酶”(E.C 3.2.1.2)为传统上给予外作用的(exo-acting)产麦芽糖淀粉酶的名称，其催化直链淀粉、支链淀粉以及相关的葡萄糖聚合物中1,4-α-葡糖苷连接的水解。自非还原的链末端以逐步的方式连续移除麦芽糖单元直至分子降解，或者，在支链淀粉的情况下，直至到达分枝点。释放的麦芽糖具有β异头物构象，由此得到β-淀粉酶的名称。

已经从多种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(Fogarty和Kelly,1979,Progressin Industrial Microbiology,15,112-115)。这些β-淀粉酶的特征在于具有40℃到65℃的最适温度以及4.5到7的最适pH。来自大麦的商业上可得到的β-淀粉酶为来自Novozymes A/S,Denmark的NOVOZYM^TM WBA和来自Genencor Int.,USA的SPEZYME^TM BBA 1500。

产麦芽糖淀粉酶

淀粉酶也可为产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构象的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶商业上可由Novozymes A/S得到。产麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048，4,604,355和6,162,628，其通过提述并入本文。

所述产麦芽糖淀粉酶可以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加。

蛋白酶

蛋白酶可在糖化、发酵或同时糖化和发酵过程中添加。可在发酵过程中添加蛋白酶以反絮凝发酵生物，特别是酵母。所述蛋白酶可为任何蛋白酶。在一个优选实施方案中，所述蛋白酶为微生物来源的酸性蛋白酶，优选真菌或细菌来源的。酸性真菌蛋白酶是优选的，但也可使用其他蛋白酶。

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶为酸性蛋白酶，即，特征为能够在pH7以下的酸性条件下水解蛋白质的蛋白酶。

涵盖的酸性真菌蛋白酶包括来源于曲霉属、假丝酵母属、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)、丝核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别涵盖的是来源于黑曲霉(参见，例如，Koaze等,1964,Agr.Biol.Chem.Japan,28,216)，斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida,1954,J.Agr.Chem.Soc.Japan,28,66)，泡盛曲霉(Hayashida等,1977 Agric.Biol.Chem.,42(5),927-933)，棘孢曲霉(WO 95/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶，以及来自微小毛霉(Mucor pusillus)和米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

还涵盖了中性或碱性蛋白酶，如来源于芽孢杆菌属菌株的蛋白酶。具体涵盖的蛋白酶来源于解淀粉芽孢杆菌，且具有在Swissprot可作为登录号P06832得到的序列。

也涵盖与在Swissprot可作为登录号P06832得到的氨基酸序列具有至少90%同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%同一性的蛋白酶。

进一步涵盖的是与WO 2003/048353中作为SEQ ID NO:1公开的氨基酸序列具有至少90%的同一性，如至少92%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或特别为至少99%的同一性的蛋白酶。

还涵盖木瓜蛋白酶样蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)内的蛋白酶，如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC 3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC 3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC 3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC 3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。

在一个实施方案中，所述蛋白酶来源于曲霉属，如米曲霉的菌株的蛋白酶制备物。在另一个实施例中，所述蛋白酶来源于根毛霉属，优选曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)的菌株。在另一个涵盖的实施方案中，所述蛋白酶为蛋白酶制备物，优选来源于曲霉属(如米曲霉)的菌株的蛋白水解制备物以及来源于根毛霉属(优选曼赫根毛霉)的菌株的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶描述于，例如，Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings和J.F.Woessner编,Academic Press,San Diego,1998,270章)。天冬氨酸蛋白酶的合适的实例包括，例如，Berka等,1990,Gene 96:313;Berka等,1993,Gene 125:195-198;以及Gomi等,1993,Biosci.Biotech.Biochem.57:1095-1100公开的那些，其通过提述并入本文。

商业上可得到的产品包括ESPERASE^TM、FLAVOURZYME^TM、PROMIX^TM、NOVOZYM^TMFM 2.0L、以及NOVOZYM^TM 50006(可由Novozymes A/S、Denmark得到)以及来自Genencor Int.,Inc.USA.的GC106^TM和SPEZYME^TMFAN。

所述蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白每克DS，优选0.001到0.1mg酶蛋白每克DS的量存在。或者，所述蛋白酶可以0.0001到1LAPU/g DS，优选0.001到0.1LAPU/g DS和/或0.0001到1mAU-RH/g DS，优选0.001到0.1mAU-RH/g DS的量存在。

此处描述并要求保护的发明不限于此处公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案旨在说明本发明的几个方面。意图将任何等效的实施方案以及一个或多个所述实施方案的组合包括在本发明的范围内。根据前文的描述，在此处说明和记载的修饰之外对本发明的各种修饰对于本科领域技术人员会是显而易见的。意欲使这些修饰也落入所附权利要求的范围内。

此处引用了多篇参考文献，将它们整体通过提述并入。通过以下实施例进一步描述本发明，但不应将这些实施例理解为对本发明范围的限制。

材料和方法

方法

使用滤纸测定法(FPU测定法)测定纤维素酶活性

1.方法来源

1.1本方法公开于Adney和Baker,1996.Laboratory Analytical Procedure,LAP-006,National Renewable Energy Laboratory(NREL)的“Measurement of CellulaseActivities”,其基于供测定纤维素酶活性的IUPAC方法(Ghose,1987,Measurement ofCellulse Activities,Pure & Appl.Chem.59:257-268)。

2.方法

2.1该方法如Adney和Baker，1996,见上文所述实施，只是使用96孔板来读取显色后的吸光度值，如下文所述。

2.2 酶测定管：

2.2.1将成卷的(rolled)滤纸条(#1 Whatman;1x6cm;50mg)添加至试管(13X100mm)的底部。

2.2.2向管中添加1.0ml 0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH 4.80)。

2.2.3将含有滤纸和缓冲液的管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育5分钟。

2.2.4温育后，向管中添加0.5ml柠檬酸盐缓冲液中的酶稀释液。酶稀释液设计成产生略高于和略低于目标值2.0mg葡萄糖的值。

2.2.5通过温和涡旋震荡3秒将管内容物混合。

2.2.6涡旋震荡后，将管在循环水浴中在50℃(±0.1℃)温育60分钟。

2.2.7在60分钟温育后立即将管从水浴中取出，并向每个管中添加3.0ml二硝基水杨酸(DNS)试剂以终止反应。将管涡旋震荡3秒钟以混合。

2.3空白和对照

2.3.1通过向试管中添加1.5ml柠檬酸盐缓冲液来制备试剂空白。

2.3.2通过将成卷的滤纸条置于试管的底部并添加1.5ml柠檬酸盐缓冲液来制备底物对照。

2.3.3通过将1.0ml柠檬酸盐缓冲液与0.5ml适宜的酶稀释液混合来制备每种酶稀释液的酶对照。

2.3.4以与酶测定管相同的方式测定试剂空白、底物对照和酶对照，而且与酶测定管一起进行。

2.4葡萄糖标准品

2.4.1制备100ml葡萄糖储液(10.0mg/ml)，并冷冻5ml等分试样。在使用前，将等分试样解冻并涡旋震荡以混合。

2.4.2如下在柠檬酸盐缓冲液中制备储液的稀释液：

G1=1.0ml储液+0.5ml缓冲液=6.7mg/ml=3.3mg/0.5ml

G2=0.75ml储液+0.75ml缓冲液=5.0mg/ml=2.5mg/0.5ml

G3=0.5ml储液+1.0ml缓冲液=3.3mg/ml=1.7mg/0.5ml

G4=0.2ml储液+0.8ml缓冲液=2.0mg/ml=1.0mg/0.5ml

2.4.3通过向1.0ml柠檬酸盐缓冲液中添加0.5ml每种稀释液来制备葡萄糖标准品管。

2.4.4以与酶测定管相同的方式测定葡萄糖标准品管，而且与酶测定管一起进行。

2.5显色

2.5.1在60分钟温育和添加DNS后，将所有管一起在水浴中煮沸5分钟。

2.5.2煮沸后，立即将它们在冰/水浴中冷却。

2.5.3冷却时，将管短暂地涡旋震荡，并让纸浆沉降。然后通过将来自每个管的50微升添加至96孔板中的200微升双蒸水来稀释每个管。将每个孔混合，并在540nm读取吸光度。

2.6计算(例子在NREL文件中给出)

2.6.1通过将四种标准品(G1-G4)的葡萄糖浓度(mg/0.5ml)对在254nm的吸光度绘图来绘制葡萄糖标准曲线。这是使用线性回归(Prism Software)来拟合的，并使用该线的方程来确定每个酶测定管所生成的葡萄糖。

2.6.2绘制所生成的葡萄糖(mg/0.5ml)对总酶稀释度的曲线，其中Y轴(酶稀释度)为对数标度。

2.6.3在生成刚刚高于2.0mg葡萄糖的酶稀释度与生成刚刚低于该值的稀释度之间画一条线。根据此线确定会精确生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度。

2.6.4如下计算滤纸单位/ml(FPU/ml)：

FPU/mL=0.37生成2.0mg葡萄糖的酶稀释度

EGU测定

制备十升的0.1M磷酸pH 6.0缓冲液，并随后用其制备1升的35g/l，pH6.0羧甲基纤维素(CMC，Aqualon 7LF)试剂。将EGU标样在室温放置15分钟，然后称重。将大约1g的标样称重置于50ml容量瓶中，并用磷酸缓冲液填充至刻度处。然后将该储液搅拌15分钟。如下表所述制备工作标样：

对于该测定准备样品，即允许其升温至室温。将样品称重，用0.1M磷酸pH 6.0缓冲液稀释，并搅拌最少15分钟，最多30分钟。稀释酶样品使得最终稀释的活性大约是在曲线中部。记录所有的重量和稀释。样品可使用ZYMATE II ROBOT(Zymark,USA)自动分析，或根据下述规范手动分析：将0.375ml体积的磷酸缓冲液移液至试管中。接着，将0.125ml的标样或样品移液至含磷酸缓冲液的试管中。重要的是溶液在移液时必须是新鲜搅拌过的。将四ml的CFC底物预加热至25℃，并在Whirl混合器上混合25-30秒。将试管中的样品在40℃水浴中温育30分钟。在擦净试管之后，将其置于粘度仪的试管夹具中，从而使得振动梭(vibratingspindle)处于试管中央，然后放置20秒。读取并记录mV信号。使用酶标样的量度作图出标准曲线，其中酶活性作为x轴而对应的mV信号作为y轴。将标准曲线通过回归拟合至三次多项式。然后使用对于不同样品稀释的mV值来从标准曲线读出对应的酶活性值。然后每个样品的活性(EGU/g)计算如下：

样品活性=(Cx烧瓶x稀释)/(重量)

其中：

C=通过回归线计算出的酶活性(EGU/mL)

烧瓶=溶液烧瓶的体积(mL)

稀释=样品的进一步稀释

FXU测定

通过用去除矿物质的水稀释从30%(w/v)BRIJ 35(Sigma B4184-1L)储液制备两升的15%(w/v)BRIJ 35工作溶液。通过称取45.55g±0.005g ACES并将该盐转移至5000mL刻度瓶来制备五升的样品稀释液(含225mg BRIJ/L，pH 6.0的50mM ACES缓冲液)。添加大约4550ml去除矿物质的水，并用磁力搅拌器混合至少20分钟或直至溶解。将7.50ml的Brij 35储液15%(w/v)移至溶液中。将pH在室温用氢氧化钠调整至6.00±0.03，并将体积调整至5.0l。

通过称取2.441g MES±0.005g并转移至250mL刻度瓶中来制备250ml的50mM XYL-BUF/S：MES缓冲液pH 6.0。添加大约240ml去除矿物质的水，并用磁力搅拌器混合至少20分钟或直至溶解。将pH在室温用氢氧化钠调整至6.00±0.03并将体积调整至250ml。通过称取0.2800g±0.001g的小麦阿拉伯木聚糖置于100ml烧瓶中来制备50ml的MES缓冲液50mM，pH6.0中的XYL-SUB/S:底物小麦阿拉伯木聚糖5.60g/l。在烧杯中加热搅拌溶液至大约55℃进行30分钟或直至溶解。在冷却之后，将pH在室温用氢氧化钠调整至6.00±0.03并将体积调整至50ml。通过称取四粒(丸状：新鲜，未结块)NaOH(例如，Merck 1.06498)置于50ml容量瓶来制备50ml的500mM NaOH。实际重量记为4粒(大约0.8g)=W。将重量W乘以50(=大约40g)并记录结果。将烧瓶用去除矿物质的水填充至50*W+/-0.001g重量，并用磁力搅拌器搅拌5分钟。25mL的对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)PAHBAH/S：PAHBAH/铋/酒石酸溶液通过下述来制备：称取0.1380±0.0001g的乙酸铋(III)(例如Aldrich401587)。然后，称取0.5000±0.001g的PAHBAH(Sigma H-9882,152.2g/mol,4kg等分于2.5g玻璃容器中)。称取1.2500±0.001g量的酒石酸钾钠四水合物(Merck 1.08087,282.2g/mol)。将粉末转移至25ml刻度瓶。将瓶用500mMNaOH填充至刻度处，并立即用铝箔包裹以避光，或倾至棕色瓶中。将样品用磁力搅拌器搅拌15分钟。

FXU标样通过下述来制备：称取0.4520g(±0.0005g)，并溶解于250ml容量瓶中的样品稀释液，并搅拌15分钟。将标准曲线制成7点曲线，并在最低和最高标准点之间相差4.0倍，推荐的体积为1200微升。标样溶液通过下述来制备：将储液用样品稀释液在稀释器中进一步根据下表稀释入样品杯中：

称取样品并溶解于样品稀释液中。将储液搅拌15分钟。将工作溶液用储液稀释至位于用样品稀释液制成的标准曲线范围内。使用Konelab 30分析仪(ThermoFischerScientific)进行活性测定。将所有试剂、标样和样品置于分析仪中。从标准曲线读取稀释样品的酶活性。可自动计算结果。表示为FXU/g的样品的活性计算根据下式进行：

FXU/g=(S x V x F)/W

其中

S=表示为FXU/mL的从标准曲线的读数

V=表示为mL的使用的量瓶的体积

F=对于第二稀释的稀释因子

W=样品重量(g)

葡糖淀粉酶活性

葡糖淀粉酶活性可用AGI单位或葡糖淀粉酶单位(AGU)来测量。

葡糖淀粉酶活性(AGI)

葡糖淀粉酶(等同于淀粉葡糖苷酶)将淀粉转化为葡萄糖。葡萄糖的量通过用于活性确定的葡糖氧化酶方法来确定。该方法描述于"Approved methods of the AmericanAssociation of Cereal Chemists".Vol.1-2 MCC,from American Association ofCereal Chemists,2000;ISBN:1-891127-12-8的76-11部分：Starch-Glucoamylase Methodwith Subsequent Measurement of Glucose with Glucose Oxidase。

一个葡糖淀粉酶单位(AGI)为在该方法的标准条件下每分钟形成1微摩尔葡萄糖的酶量。

所述淀粉应为Lintner淀粉，其为在实验室中用作比色指示剂的稀糊淀粉。将天然淀粉用稀盐酸处理使其保持与碘生成蓝色的能力，从而获得Lintner淀粉。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃，pH4.3，底物：23.2mM麦芽糖，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

可使用自动分析仪系统。将变旋酶(mutarotase)添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-D-葡萄糖转化为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶特异性地与β-D-葡萄糖在上述反应中反应，形成NADH，其使用光度计在340nm处测定作为起始葡萄糖浓度的量度。

AMG温育：
		底物：	23.2mM麦芽糖
缓冲液：	0.1M乙酸盐
		pH：	4.30
温育温度：	37℃±1
		反应时间：	5分钟
酶工作范围：	0.5-4.0AGU/mL

颜色反应：
		GlucDH：	430U/L
变旋酶：	9U/L
		NAD：	0.21mM
缓冲液：	0.12M磷酸盐;0.15M NaCl
		pH：	7.60±0.05
温育温度	37℃±1
		反应时间：	5分钟
波长：	340nm

α-淀粉酶活性

α-淀粉酶活性(KNU)

α-淀粉酶活性可使用马铃薯淀粉作为底物来确定。该方法基于酶对于改性马铃薯淀粉的降解，并通过将淀粉/酶溶液的样本与碘溶液混合来跟踪反应。起初，形成了蓝黑色(blackish blue)，但在淀粉降解过程中，蓝色越来越淡，并逐渐变为红棕色(reddish-brown)，将其和有色玻璃标准(colored glass standard)进行比较。

一个千Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；以及pH 5.6)糊精化5260mg的淀粉干物质Merck Amylum Solubile所需的酶量。

酸性α-淀粉酶活性

当根据本发明使用时，任何酸性α-淀粉酶的活性可用AFAU (酸性真菌α-淀粉酶单位，Acid Fungal Alpha-amylase Units)来测量。或者，酸性α-淀粉酶的活性可用AAU(酸性α-淀粉酶单位，Acid Alpha-amylase Units)来测量。

酸性α-淀粉酶单位(AAU)

酸性α-淀粉酶活性可以用AAU(酸性α-淀粉酶单位)来测量，其为绝对方法。一个酸性淀粉酶单位(AAU)是在标准化的条件下每小时将1g的淀粉(100%的干物质)转化为在与已知强度的碘溶液反应之后在620nm具有等于颜色参照的透射的产物的酶量。

标准条件/反应条件：

底物：可溶性淀粉，浓度大约为20g DS/L。

缓冲液：柠檬酸(盐)，大约0.13M，pH=4.2

碘溶液： 40.176g碘化钾+0.088g碘/L

市政水(city water)： 15-20°dH(German硬度)

pH： 4.2

温育温度： 30℃

反应时间： 11分钟

波长： 620nm

酶浓度： 0.13-0.19AAU/mL

酶工作范围： 0.13-0.19AAU/mL

淀粉应为Lintner淀粉。进一步的细节可见于EP 0140410，其通过提述并入本文。

酸性α-淀粉酶活性(AFAU)

酸性α-淀粉酶的活性可以以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶单位)测定，其相对于酶标准物来确定。一AFAU定义为在下面提及的标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。

酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-葡糖苷键以形成具有不同链长的寡糖和糊精。与碘形成的颜色的强度与淀粉浓度成正比。使用反向比色法(reverse colorimetry)在规定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为淀粉酶活性。

蓝色/紫色 T=23秒脱色

标准条件/反应条件：

底物：可溶性淀粉，大约0.17g/L

缓冲液：柠檬酸(盐)，大约0.03M

碘(I₂)： 0.03g/L

CaCl₂： 1.85mM

pH： 2.50±0.05

温育温度： 40℃

反应时间： 23秒

波长： 590nm

酶浓度： 0.025AFAU/mL

酶工作范围： 0.01-0.04AFAU/mL

木糖/葡萄糖异构酶测定(IGIU)

一IGIU是在标准分析条件以每分钟1微摩尔的起始速率将葡萄糖转化为果糖的酶量。

标准条件：

葡萄糖浓度： 45%w/w

pH： 7.5

温度： 60℃

Mg²⁺浓度： 99mg/l(1.0g/l MgSO₄*7 H₂O)

Ca²⁺浓度： <2ppm

激活剂，SO₂浓度： 100ppm(0.18g/l Na₂S₂O₅)

缓冲剂，Na₂CO₃，浓度： 2mM Na₂CO₃

蛋白酶活性

蛋白酶测定方法AU(RH)

蛋白分解活性可用变性的血红蛋白作为底物来确定。在用于确定蛋白分解活性的Anson-Hemoglobin方法中，消化变性的血红蛋白，然后将未消化的血红蛋白用三氯乙酸(TCA)沉淀。用酚试剂确定TCA可溶性产物的量，所述酚试剂遇到酪氨酸和色氨酸呈蓝色。

一Anson单位(AU(RH))定义为在标准条件下(即，25℃，pH 5.5和10分钟反应时间)以使得每分钟释放的TCA可溶产物量与一毫当量的酪氨酸遇到酚试剂给出相同的颜色的起始速率消化血红蛋白。

确定产麦芽糖淀粉酶活性(MANU)

一MANU(产麦芽糖淀粉酶Novo单位，Maltogenic Amylase Novo Unit)可定义为在37℃，在每ml的0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0中10mg麦芽三糖(Sigma M 8378)底物的浓度反应30分钟，每分钟释放一微摩尔麦芽糖所需的酶量。

材料

Spirizyme Excel–瓣环栓菌(T.cingulata)和埃默森踝节菌(T.emersonii)葡糖淀粉酶混合物(Novozymes A/S,Denmark))

CELLIC^TM CTec–里氏木霉纤维素酶组合物，补充GH61多肽和β-葡糖苷酶融合蛋白(Novozymes A/S,Denmark).

CELLIC^TM HTec–木聚糖酶(Novozymes A/S,Denmark).

CELLIC^TM CTec2–(a)补充了GH61多肽和β-葡糖苷酶的里氏木霉纤维素酶组合物和(b)CELLIC^TM HTec2(Novozymes A/S,Denmark)的混合物。

CELLIC^TM HTec2–木聚糖酶(Novozymes A/S,Denmark)。

葡糖淀粉酶A(AMG A)：由公开于WO 2006/069289(Novozymes A/S)中SEQ ID NO:2的瓣环栓菌来源的葡糖淀粉酶。

α-淀粉酶A(AAA)：杂合体α-淀粉酶，由具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和作为V039公开于WO 2006/069290(Novozymes A/S)中表5的SBD的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶组成。

Celluclast 1.5L- 具有木聚糖酶活性的里氏木霉纤维素酶组合物。

Ultraflo-具有阿魏酸酯酶和木聚糖酶活性的特异腐质霉β-葡聚糖酶。

Shearzyme 2x-棘孢曲霉木聚糖酶。

Shearzyme Plus-棘孢曲霉木聚糖酶。

实施例

实施例1

使用未发酵的玉米醪制备发酵样品。将尿素和青霉素分别添加至1000ppm和3mg/L的终浓度。将醪的pH调整至pH 5。将大约620g醪置于LR-2.ST1L反应器容器(IKA,Wilmington,NC)中，将该容器在整个54小时发酵过程中恒定混合地保持在32℃水浴中。

Spirizyme Excel以0.06%(%w/w玉米)的最终浓度剂量添加。将CELLIC^TM CTec、CELLIC^TM HTec和烟曲霉GH61多肽各同样以33.3微克酶蛋白/g DS剂量添加。通过将0.68g的干Ethanol Red酵母(RedStar Yeast Co.,Milwaukee,WI)直接添加至反应器来起始发酵。

在54个小时之后，通过添加10微升的40%(v/v)H₂SO₄/g醪终止发酵，并在4℃在玻璃反应器中储藏过夜。然后将每个处理物转移至三个250mlNalgene瓶中，加盖，并在大约30℃在Avanti J-E离心机(Beckman Coulter,Brea,CA)中的F14BCI-6x250cy转子中以3500xg离心15分钟。再次合并来自每个处理的上清，允许其冷却至室温，并根据下述方法回收油：

将来自每个处理的上清合并于250ml分液漏斗中。将样品离心用的Nalgene瓶用少量己烷(<5ml)漂洗，接着提取上清(三次提取，每次提取40ml己烷)。将有机相收集于预称重的圆底烧瓶中，转移至50ml试管以供在11000xg离心15分钟，然后重新转移回圆底烧瓶中。将有机层使用R-205旋转蒸发器(Buchi,Flawil,Switzerland)以240rpm以设置为85℃的水浴在真空下蒸去，并对圆底烧瓶重新称重以获得最终油重量。

为了准确地比较油产量，将回收的油作为用于处理的起始醪的质量百分比进行报道。对于SSF处理，使用记录的起始醪重量进行计算。为了计算用于每个样品的起始醪，测量等分入大规模发酵的醪的量。油产量基于获得的油对使用的起始玉米醪的百分比重量基础进行计算(表1)。

表1：油产量

处理	%油(w/w)
		Spirizyme Excel	0.60%
Spirizyme Excel、CELLIC^TM CTec、CELLIC^TM HTec和GH61多肽	0.86%

结果显示CELLIC^TM CTec、CELLIC^TM HTec和GH61多肽的混合物的添加相对于对照样品将提取的玉米油的量显著增加43%。

实施例2

将未发酵的工业上产生的醪在混合器中混合5分钟。这是为了增加酶活性可利用的表面积，并进一步破坏含油的胚。将100g的该玉米醪样品等分入具有配置滤器的盖的塑料250mL瓶。使用AAA+AMG A(10.5AGU/FAU-F)以0.04wt.%的剂量进行糖化。CELLIC^TM CTec2以12mg产物/gDS剂量添加。

在发酵中使用Rehydrated RED STAR^TM酵母(Fermentis/Lesaffre,USA)，将3.3g的酵母重悬于50mL的32℃自来水30分钟，然后将2mL该培养物投入每份醪。允许SSF在32℃在往复/定规振荡空气培养箱中进行72小时。在72小时之后，通过添加10微升的40%(v/v)H₂SO₄/g醪终止发酵。

为了测量在样品水相和油相中捕获的油的量，开发了基于己烷的提取测定法。将发酵的样品倾入两个50mL锥形离心管。将发酵瓶的壁用去离子水漂洗良好，并倾入第三个30ml离心管中。将所有试管在具有转子GH-3.8的Allegra 6R台式离心机(BeckmenCoulter,Brea,CA)中以1462xg离心10分钟。将上清倾入新鲜的250mL容量瓶。使用少量(<5ml)己烷将残余的油从离心管壁漂洗去，并添加至容量瓶。添加去离子水以将沉淀重悬于两个离心管中，并合并入一个管，并再次离心。将上清倒入容量瓶，并使用少量己烷再次漂洗管壁。将瓶中的上清倒入250ml分液漏斗，然后加入2g的NaCl，并颠倒数次混合。然后，将15ml的己烷添加至漏斗，并在通风下充分混合，然后允许其分离以将水层倾入烧杯。将己烷层转移入合适的容器。将水层添加回漏斗，并再次用己烷洗涤并收集。在漏斗中用己烷进行第三次洗涤，倒出水层，并仅洗涤漏斗壁。将所有己烷层第四次倒回漏斗，并用100ml热自来水漂洗。在相分离之后，倾去水相，并将己烷层转移至预称重的圆底烧瓶。将有机层使用R-205旋转蒸发器(Buchi,Flawil,Switzerland)以240rpm以设置为85℃的水浴在真空下蒸去，并对圆底烧瓶重新称重以获得最终油重量。

为了准确地比较油产量，将回收的油作为用于处理的起始醪的质量百分比进行报道。对于SSF处理，使用记录的起始醪重量进行计算。为了计算用于每个样品的起始醪，测量等分入大规模发酵的醪的量。油产量基于获得的油对使用的起始玉米醪的百分比重量基础进行计算(表2)。

表2：油产量

处理	%油(w/w)
		1.AAA+AMG A(10.5AGU/FAU-F)	0.48%
2.AAA+AMG A(10.5AGU/FAU-F)+CELLIC^TM CTec2	1.48%

结果显示CELLIC^TM CTec2的添加相对于对照样品将提取的玉米油的量显著增加208%。

实施例3

将工业产生的玉米醪用于所有测定验证实验。将含有液化醪的5加仑容器解冻，并分配为较小的量(1升螺旋帽Nalgene瓶)，并重新冻结。在起始该研究之前，将一升的该醪解冻大约4个小时。对于醪，使用1g/l青霉素和200g/l尿素溶液补充3ppm青霉素和1000ppm尿素，并用40%(v/v)H₂SO₄调整至pH 5.0。醪的干固形物含量在HB43-S型卤素灯水分天平(halogen lamp moisture balance)(Mettler-Toledo,Toledo,Ohio)上进行测量，得到大约30% DS的值。将大约25g的工业醪添加至具有螺旋帽的50ml锥形离心管。运行了总共24次发酵。

Spirizyme Ultra以0.056%(% w/w玉米)的终浓度剂量添加。Celluclast 1.5L、Shearzyme 2x、CELLIC^TM Ctec2、CELLIC^TM Htec2和Shearzyme Plus分别以10或100微克酶蛋白/g DS剂量添加。

向25g样品剂量添加水，使得添加的水和酶的总体积对于组中的每个样品归一化。将总共5.5g的Fermentis Ethanol Red酵母通过在32℃温育30分钟而在100mL的35℃自来水中重新水合。然后对每25g样品剂量添加以重新水合的酵母溶液的250微升等分试样。在时点0将管称重，然后在32℃以150rpm在温育的SHKE4000-5型定轨振荡器(ThermoScientific,Waltham,MA)中发酵70小时。在52或70个小时之后，将管称重，并使用下式计算乙醇浓度：

蒸馏

对于所有蒸馏使用Büchi Multivapor蒸发系统(Buchi,Flawil,Switzerland)。该单元每次蒸馏12个样品。测试湿饼脱水加工的参数示于表3，而测试玉米油提取加工的参数示于表4：

表3：对于湿饼脱水的蒸馏参数

表4：对于玉米油提取的蒸馏参数

时间	45分钟
		温度	75℃
真空	450-200mBar
		RPM	8

后段加工(湿饼脱水)

在蒸馏之后，将全釜馏物样品在具有JS-5.3转子的Avanti J-E系列离心机(Beckman Coulter，Brea,CA)中以1400xg离心10分钟。在离心之后，立即将样品倾入预称重的15mL锥形管。记录所得的湿饼和稀釜馏物的重量。将湿饼刮出试管，并置于预称重的干燥盘中，并在55℃温育过夜，并转移至温育烤箱(incubation oven)(分别为VWR 1545和1370FM型)在105℃进行2小时。在每次温育之前和之后记录重量。使用这些值使用下式计算干固形物的值。

后段加工(玉米油提取)

将己烷以0.125mL己烷/g起始材料的剂量添加至每个全釜馏物样品。将每个试管密封以阻止样品泄露，并彻底混合。将试管在具有JS-5.3转子的Avanti JE系列离心机中以3000xg离心10分钟。在离心之后，使用正压式移液器(positive displacement pipette)移出油/己烷层(上清)，将其转移至预先称重的5ml掀盖管(flip-top tube)，并重新称重。样品的密度使用DDM 2911型研究分析密度计(research analytical density meter)(Rudolph Research Analytical,Hackettstown,NJ)测量。然后将上清密度代入标准曲线方程以获得上清中油的百分比。根据该值，可得出起始材料中总的油百分比。

结果示于下表5-13。

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

这些结果显示纤维素酶、木聚糖酶和GH61活性的组合以协同方式增加了油提取和脱水的功效。此外，当这些活性组合时，纤维素酶活性和木聚糖酶活性之间的更大的比例导致玉米油提取和脱水效果的增强。就其自身而言，这些活性(纤维素酶、木聚糖酶和GH61)均未显著有助于增强油提取或脱水，除非将其以非经济性的高剂量使用。

实施例4

将工业产生的玉米醪用于所有样品。将含有液化醪的5加仑容器解冻，并分配为较小的量(1升螺旋帽Nalgene瓶)，并重新冻结。在起始该研究之前，将一升的该醪解冻大约4个小时。对于醪，使用1g/l青霉素和200g/l尿素溶液补充3ppm青霉素和1000ppm尿素，并用40%(v/v)H₂SO₄调整至pH 5.0。醪的干固形物含量在Mettler-Toledo水分天平(HB43-S卤素)上进行测量，得到大约30.00% DS的值。将大约5g的工业醪添加至带掀盖的15ml锥形离心管(NUNC #362694)。运行了总共126次发酵。酶根据下表中的产品规格进行剂量添加，并使用下式确定添加至发酵的储液的体积：

	酶	剂量	单位
				1	Spirizyme Ultra(对照)	0.500	AGU/g DS
2	CELLIC^TM CTEC2	100.000	微克EP/g DS
				3	CELLIC^TM CTEC2	1000.000	微克EP/g DS
4	Celluclast 1.5L	100.000	微克EP/g DS
				5	Shearzyme Plus	10.000	微克EP/g DS
6	Shearzyme Plus	100.000	微克EP/g DS

向每个样品添加水，使得添加的水和酶的总体积大约为70微升/25g样品。将重新水合的酵母(100mL 35℃自来水中的5.5g Fermentis Ethanol Red酵母在32℃温育30分钟)以每个5g样品中50微升的酵母溶液剂量添加。将管在时点0称重，然后在32℃发酵52或70个小时，在整个发酵过程中监视重量丧失，并根据下式逆推计算确定产生的乙醇的量：

HPLC分析

在发酵时点最后，将50微升的40% H₂SO₄添加至每个样品，并进行涡旋以确保混合。将样品在在具有转子GH3.8的Beckman Coulture台式离心机(Allegra 6R)中以1570xg(3000rpm)离心10分钟，然后通过0.45微米注射器式滤器(Whatman)滤入HPLC小瓶，然后进行HPLC分析。

HPLC系统：配有Chem工作站软件的Agilent的1100/1200系列除气器

平方泵(Quadratic Pump)

自动取样器

具有加热器的柱区室(Column Compartment/w Heater)

折光率检测器(RI)

柱:Bio-Rad HPX-87H Ion Exclusion Column 300mmx7.8mm部件# 125-0140

Bio-Rad保护柱(guard cartridge)阳离子(cation)H部件#125-0129,Holder部件#125-0131

方法:0.005M H₂SO₄流动相

0.6ml/min的流速

柱温度-65℃

RI检测器温度-55℃

该方法使用对于糊精(DP4+)、麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、乙酸、乳酸、甘油和乙醇的校准标样对几种分析物定量。使用包括原点(origin)的4点校准。

乙醇产量和在52和70小时的发酵相对于对照的增加的结果总结于表12。

表12- 在52和70小时发酵时间之后乙醇产量的比较

结果显示在52小时之后，两个样品中乙醇显著增加：以100微克EP/g DS(1.01%增加)和以1mg EP/g DS(2.97%增加)剂量添加的CELLIC^TM CTec2。在72小时之后，观察到相同结果，当以100微克EP/g DS(1.17%增加)和以1mgEP/g DS(2.55%增加)剂量添加时，CELLIC^TMCTec2为仅有的相对于对照具有显著增加的样品。其他样品均未显示相对于对照的显著增加，尽管其亦为纤维素和半纤维素降解酶(纤维素酶和木聚糖酶)。这表明需要纤维素酶和木聚糖酶降解酶的组合以CELLIC^TM CTec2中包含的比例来增强乙醇产量。该最适比例得到下述事实支持：Shearzyme Plus亦含有纤维素酶和木聚糖酶降解酶，但具有高得多的量的木聚糖酶，其产量的结果不如CELLIC^TM CTec2高。

实施例5

将一部分玉米使用具有7号筛的Fitzpatrick Hammer磨进行干磨。磨制产物的干物质含量用总量分析法测量为88.0% w/w。使用681.8g的磨制玉米和1318.2g的市政水制成了含有30%干物质的醪。将0.11g的Termamyl SC-L(α-淀粉酶)以等同于20KNU/kg磨制玉米的剂量添加。将醪在搅拌下在60分钟过程中从55℃加热至90℃，然后冷却至32℃，并分为240g部分以供同时糖化和发酵试验，该试验是在500ml蓝帽瓶中进行的，在该瓶的橡胶瓶塞中放置有气门。

在使用Termamyl SC-L对玉米醪进行液化之后，使用表13中所示的酶类型和产品：

表13

在用表13中的酶和剂量调理30分钟之后，将0.20g的新鲜面包酵母(DanishDistillers A/S)添加至每个烧瓶。同时糖化和发酵试验在具有摇床的恒温容器中在32℃以150rpm在44振荡器中进行。发酵时间为67小时，且在发酵期结束时在HPLC上对所有样品分析乙醇和剩余可溶性糖的含量。

对于脂肪/油确定，将所有样品离心，并分离上清和沉积物，并将其冻干于铝盘中。在ASE 300加速溶剂提取器中(accelerated solvent extractor)(Dionex Corporation)分析沉积物中的油含量。

将来自上清的油稀释于己烷，并过滤。将己烷在通风柜中蒸发，并将油称重。

在67小时之后来自乙醇确定的结果在11-13%w/w之间，得到基于磨制玉米的27-34kg乙醇/100kg干物质之间的醇产量。这些产量在实验室试验的正常范围中。

表14显示实际油回收数据，并计算油对上清(釜馏物)的平均产量以及根据本发明得到的额外产量。产量计算基于见于磨制玉米产物中的10.50%w/w的油含量。

表14-油回收

结果显示纤维素酶、木聚糖酶和阿魏酸酯酶的协同作用导致35%油的额外产量。几乎双倍质量(double mass)的油可通过施加协同作用的细胞壁降解酶(Celluclast+Ultraflo)来提取。认为稀釜馏物中乙醇的浓度越高，可提取的油(包括磷脂)的量也越大。

未对玉米粗粉进行除了磨制之外的特别预处理。

推荐在工艺的适当步骤进行干或湿的精细磨制，以进一步改善产量。

本发明进一步由下述段落限定：

1.一种回收油的方法，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(c)使用发酵生物将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(f)从稀釜馏物回收油。

2.一种回收油的方法，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)使用发酵生物将糖化的纤维素材料发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(e)从稀釜馏物回收油。

3.一种回收油的方法，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(c)使用发酵生物将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶和内切葡聚糖酶；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(f)从稀釜馏物回收油。

4.一种回收油的方法，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物将糖化的纤维素材料发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶和内切葡聚糖酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(e)从稀釜馏物回收油。

5.一种回收油的方法，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(c)使用发酵生物将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶、内切葡聚糖酶和GH61多肽；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(f)从稀釜馏物回收油。

6.一种回收油的方法，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物将糖化的纤维素材料发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶、内切葡聚糖酶和GH61多肽；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(e)从稀釜馏物回收油。

7.一种回收油的方法，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(c)使用发酵生物将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(f)从稀釜馏物回收油。

8.一种回收油的方法，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物将糖化的纤维素材料发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(e)从稀釜馏物回收油。

9.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼，由此更多液相转移至稀釜馏物。

10.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼，由此更多液相转移至稀釜馏物。

11.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

12.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶和内切葡聚糖酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

13.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

14.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶、内切葡聚糖酶和GH61多肽；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

15.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

16.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产物，其中所述发酵培养基包含内切葡聚糖酶和β-葡聚糖酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

17.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(f)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(g)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

18.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物将糖化的纤维素材料发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含半纤维素酶；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(e)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(f)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

19.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(f)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(g)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

20.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(e)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(f)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

21.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(f)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(g)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

22.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(e)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(f)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

23.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(f)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(g)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

24.一种产生饲料共产物的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；

(e)将稀釜馏物脱油以形成含较少油的可溶物；和

(f)从湿饼和含较少油的可溶物回收饲料共产物。

25.段17-24任一项的工艺，其中所述饲料共产物是蒸馏干酒糟(DDG)。

26.段17-24任一项的工艺，其中所述饲料共产物是含可溶物的蒸馏干酒糟(DDGS)。

27.段17-24任一项的工艺，其中所述饲料共产物是蒸馏干可溶物(DDS)。

28.段17-24任一项的工艺，其中所述饲料共产物是蒸馏湿谷粒(DWG)。

29.段1-6、9-14、17-22和25-28任一项的工艺，其中所述半纤维素酶选自下组：乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。

30.段29的工艺，其中所述半纤维素酶是木聚糖酶。

31.段1-30任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含纤维二糖水解酶。

32.段1-31任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含β-葡糖苷酶。

33.段1-32任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含蛋白酶。

34.段1-33任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含GH61多肽。

35.段1-34任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含β-葡聚糖酶。

36.段1-35任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含阿魏酸酯酶。

37.段2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24-36任一项的工艺，其中所述含纤维素材料经预处理。

38.段2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24-37任一项的工艺，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，半纤维素酶，棒曲霉素，酯酶，漆酶，木质素分解酶，果胶酶，过氧化物酶，蛋白酶和膨胀素。

39.段38的工艺，其中所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

40.段38或39的工艺，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。

41.段3-8、11-16和19-40的工艺，其中所述内切葡聚糖酶以0.01-1.0EGU/g，例如0.02-0.08，0.025-0.06，0.025-0.05或0.03-0.04EGU/g干固形物的量添加。

42.段3-8、11-16和19-41的工艺，其中所述内切葡聚糖酶以1-30，例如5-30，7-25，10-20，10-17或12-15微克/g干固形物的量添加。

43.段1-6、9-14、17-22和25-42的工艺，其中所述半纤维素酶以0.01-1.0，例如0.015-0.08，0.015-0.06，0.015-0.04或0.02-0.03FXU/g干固形物的量添加。

44.段1-6、9-14、17-22和25-43的工艺，其中所述半纤维素酶以1-30，例如5-30、7-25、10-20、10-17或12-15微克/g干固形物的量添加。

45.一种回收油的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(c)使用发酵生物将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含GH61多肽；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(f)从稀釜馏物回收油。

46.段45的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含选自下组的半纤维素酶：乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，阿魏酸酯酶，葡糖醛酸糖苷酶，木聚糖酶和木糖苷酶。

47.段46的工艺，其中所述半纤维素酶是木聚糖酶。

48.段45-47任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含内切葡聚糖酶。

49.段45-48任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含一种或多种纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶。

50.段45-49任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含一种或多种蛋白酶。

51.一种用于回收油的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用一种或多种发酵微生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产物，其中所述发酵培养基包含GH61多肽；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(d)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(e)从稀釜馏物回收油。

52.段51的工艺，其中所述纤维素材料经预处理。

53.段51或52的工艺，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。

54.段53的工艺，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

55.段53或54的工艺，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。

56.段51-55任一项的工艺，其中步骤(a)和(b)在同时糖化和发酵中同时进行。

57.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

58.段57的工艺，其中所述半纤维素酶选自下组：乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。

59.段58的工艺，其中所述半纤维素酶是木聚糖酶。

60.段57-59任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含一种或多种纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶。

61.段57-60任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含一种或多种蛋白酶。

62.段57-61任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含GH61多肽。

63.一种使全釜馏物脱水的工艺，其包括：

(a)用酶组合物糖化纤维素材料；

(b)用发酵生物发酵糖化的纤维素材料以产生发酵产物，其中所述发酵培养基包含GH61多肽；

(c)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；和

64.段63的工艺，其中所述纤维素材料经预处理。

65.段63或64的工艺，其中所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、棒曲霉素、酯酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶和膨胀素。

66.段65的工艺，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。

67.段65或66的工艺，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、木聚糖酶和木糖苷酶。

68.段1-67的工艺，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷、环烷烃、烯、异戊二烯、聚酮化合物或气体。

69.段68的工艺，其中所述发酵产物是乙醇。

70.段1-69任一项的工艺，进一步包括回收所述发酵产物。

71.一种产生发酵产物的工艺，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料液化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；和

(c)使用发酵生物将发酵培养基中的糖发酵为发酵产物，其中所述发酵培养基包含GH61多肽。

72.段71的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含纤维素酶(纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶)和半纤维素酶(例如阿魏酸酯酶和/或木聚糖酶)。

73.段1-72任一项的工艺，其中所述发酵培养基进一步包含葡糖淀粉酶。

73.一种由段17-44任一项的工艺产生的饲料共产物。

74.段73的饲料共产物，其为蒸馏干酒糟(DDG)。

75.段73的饲料共产物，其为含可溶物的蒸馏干酒糟(DDGS)。

76.段73的饲料共产物，其为蒸馏干可溶物(DDS)。

77.段73的饲料共产物，其为蒸馏湿谷粒(DWG)。

78.一种动物饲料，其包含段73-77任一项的饲料共产物。

Claims

1.一种回收油的方法，其包括：

(a)用α-淀粉酶将含淀粉材料转化为糊精；

(b)使用糖源生成酶糖化糊精以形成糖；

(d)蒸馏发酵产物以形成全釜馏物；

(e)将全釜馏物分离为稀釜馏物和湿饼；和

(f)从稀釜馏物回收油，

其中所述半纤维素酶是木聚糖酶，

其中所述半纤维素酶以0.01-1.0FXU/g干固形物的量添加；所述内切葡聚糖酶以0.01-1.0EGU/g的量添加；而且所述GH61多肽以2-1000微克/g干固形物(DS)的量存在。

2.权利要求1的方法，其中所述发酵培养基进一步包含纤维二糖水解酶。

3.权利要求1的方法，其中所述发酵培养基进一步包含β-葡糖苷酶。

4.权利要求1的方法，其中所述发酵培养基进一步包含蛋白酶。

5.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以0.015-0.08FXU/g干固形物的量添加。

6.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以0.015-0.06FXU/g干固形物的量添加。

7.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以0.015-0.04FXU/g干固形物的量添加。

8.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以0.02-0.03FXU/g干固形物的量添加。

9.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以1-30微克/g干固形物的量添加。

10.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以5-30微克/g干固形物的量添加。

11.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以7-25微克/g干固形物的量添加。

12.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以10-20微克/g干固形物的量添加。

13.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以10-17微克/g干固形物的量添加。

14.权利要求1的方法，其中所述半纤维素酶以12-15微克/g干固形物的量添加。

15.权利要求1的方法，其中所述发酵产物是醇、有机酸、酮、氨基酸、烷烃、环烷烃、烯、异戊二烯、聚酮化合物或气体。

16.权利要求1的方法，其中所述发酵产物是乙醇。